铬染毒动物肝肾组织中的低分子络结合物
作者：高泽宣 曾 明 王翔朴 安飞云
单位：环境医学研究室 长沙 410078
关键词：铬；中毒；分光光度测定法；原子吸收；疾病模型；动物；大鼠
湖南医科大学学报990303 提要 对雄性大鼠进行铬染毒，剂量为每kg体重2.55mg Cr6+，每天1次，连续染毒7d，停止染毒后继续观察7d。结果染毒1d后，大鼠肝肾组织中的低分子络结合物HMW-Cr，LMW-Cr及MMW-Cr较对照组显著升高，并随染毒时间的延长而不断升高；对照组中未检出MMW-Cr，可作为铬中毒的特异观察指标。采用葡聚糖凝胶G-50柱层析法分离低分子蛋白效果好。
中国图书分类号 O614.611 R595.2
Low-molecular-weight chromium-binding substances in hepatic and nephric tissues of chromium-exposed rats
, 百拇医药
Gao Zexuan Zeng Ming Wang Xiangpu An Feiyun
(Environmental Medicine Research Laboratory, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Male Wistar rats were injected intraperitoneally with potassium dichromate(2.55mg Cr6+per kg body weight) for 7 days, and were observed continously for 7 days after stopping Cr injection. The results were that concentrations of chromium-binding substances (HMW-Cr, LMW-Cr, and MMW-Cr) increased significantly with the extension of Cr injection time; MMW-Cr was not found in the control group. MMW-Cr may be a valuable indicator in diagnosing chromium toxication. It was efficient to use Sephadex G-50 column chromatography and ultra-violet absorption spectrometry-atomic absorption spectrophotometry in isolation, and then it was followed by quantitative analysis of chromium-binding substances.
, 百拇医药
Key words chromium; poisoning; spectrophotometry,atomic absorption; disease models animals;rats
铬是一种常见的环境污染毒物，以3价和6价的铬化合物存在于自然界，铬及其化合物的工业用途很广，可能接触铬及其化合物的行业有冶金、制革、电镀和油漆等。铬主要通过呼吸道和皮肤进入机体，主要对肝、肾组织造成损害，而6价铬的毒性高于3价铬。肝肾组织中存在一种与铬特异性结合，分子量约为1500D的低分子铬结合物(Low molecular weight chromium-binding substance; LMCr)[1]。为研究铬化合物在肝肾组织中的存大形式及对肝肾组织的损害评价作用，笔者进行了动物实验研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 动物分组 健康雄性Wistar大鼠(由本校动物学部提供)50只，体重(260±20)g，随机分为对照组和铬染毒组，每组25只。
1.2 方法
1.2.1 动物染毒 铬染毒组的染毒剂量由预试实验确定，以保证大鼠的肝肾受到损害而又不致死亡。铬染毒组动物采用腹腔注射重铬酸钾溶液，剂量为每kg体重2.55mg Cr6+，每天1次，连续染毒7d，停止染毒后继续观察7d。对照组动物注射等体积的生理盐水溶液。
1.2.2 肝、肾组织样品的制备 于股动脉放血处死动物，立即取出肝脏和肾脏，去包膜和结缔组织，称重；分别切取肝组织和肾皮质各0.5g，剪碎后，加入相当于组织10倍体积的0.01mol磷酸缓冲液(pH7.2，含20mmol NaCl)，于细胞粉碎器(B-30型，USA)中制成匀浆，600g离心20min，去沉渣，再以100000g低温超速离心30min，取上清液备用。
, 百拇医药
1.2.3 LM Cr的分离 根据LM Cr的分子量范围，选择sephadex G-50凝胶柱层析法进行分离[2，3]，柱长1.0cm×50cm，洗脱液为0.01mol磷酸盐缓冲液，以蠕动泵(VGA-76型，USA)控制流速为18ml.h-1，以定时部分收集器收集洗脱液，每管3ml，用波长为280nm 751型紫外分光光度计，测定吸光度，并用已知分子量(MW)的牛血清白蛋白(MW68000)、胰蛋白酶(MW23300)、溶菌酶(MW14300)和杆菌肽(MW1450)作为参照物，以确定铬结合物的分子量。
1.2.4 LM Cr结合铬含量的分析 吸取上述洗脱液各0.1ml，加入1ml硝酸消化过夜，以Sepectr AA-40原子吸收分光光度计(Varian, USA)石墨炉法[4]进行测定，原子化温度为2500℃，方法灵敏度为0.15ng.ml-1，测定范围1～20ng.ml-1(进样量20μl)，平均回收率98.5%，变异数分析无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
1.3 统计学处理 数据经SPSS软件处理。
2 结 果
2.1 肝、肾组织铬结合物分子量分布和铬含量分析 铬染毒组大鼠肝脏和肾脏铬结合物紫外吸收光谱的分布有3个区带(附图)：分子量为70000～12500D的高分子部分(HMW-Cr)、分子量为12500～500D的低分子部分(LMW-Cr)以及分子量约为500D的小分子部分(MMW-Cr)。对照组仅有HMW-Cr和LMW-Cr两部分，未检出MMW-Cr。
附图 铬染毒7d大鼠肝肾组织中铬结合物Sephadex-50洗脱图示
Fig. Elution profile of liver and kidney supernatant from rats of 7days following chromium exposure on a Sephadex G-50 column
, 百拇医药
铬染毒组大鼠肝脏和肾脏铬结合物中铬含量分析结果(表1，2)说明，HMW-Cr，LMW-Cr及MMW-Cr在染毒后1d即开始升高，随染毒时间的延长，升高更明显，而正常对照组的肝脏和肾脏中均未检出MMW-Cr。
表1 大鼠肝组织铬结合物中铬含量结果(μg.g-1;n=50) 组别
染毒后(d)
停止染毒后(d)
1
2
3
7
7
, 百拇医药 对照组
HMW-Cr
0.146
0.120
0.129
0.152
0.118
LMW-Cr
0.475
0.417
0.453
0.510
0.425
, 百拇医药
MMW-Cr
未检出
未检出
未检出
未检出
未检出
染毒组
HMW-Cr
1.956①
3.148②
8.667②
18.488②
, http://www.100md.com
2.977①
LMW-Cr
6.645②
14.746②
24.685②
29.078②
6.933②
MMW-Cr
0.187②
0.444②
, http://www.100md.com
1.324②
2.506②
0.206
与对照组比较：①P<0.05;②P<0.01表2 大鼠肾组织铬结合物中铬含量结果(μg.g-1;n=50) 组别
染毒后(d)
停止染毒后(d)
1
2
3
7
7
, 百拇医药
对照组
HMW-Cr
0.202
0.180
0.178
0.226
0.209
LMW-Cr
0.424
0.384
0.396
0.454
0.455
, 百拇医药
MMW-Cr
未检出
未检出
未检出
未检出
未检出
染毒组
HMW-Cr
2.670①
7.967②
13.151②
18.043②
, 百拇医药
3.352①
LMW-Cr
6.547②
14.400②
18.846②
19.543②
5.825②
MMW-Cr
0.273②
0.859②
, 百拇医药
1.898②
2.960②
0.267
与对照组比较：①P<0.05;②P<0.01
3 讨 论
近年的研究发现，铬及其化合物对机体的肝脏和肾脏具有毒性作用，特别是对肾脏组织的危害性更大，因为肾脏既是铬的主要蓄积器官，又是铬的主要排泄器官，动物试验资料[1，5]表明，铬引起的动物急性中毒可导致肾小管坏死、肾功能障碍，甚至肾功能衰竭死亡。
我室以前的试验[6]结果表明，动物染毒后第一天即出现肝、肾、血和尿中铬含量显著高于对照组(P<0.01)，并先后出现谷草转氨酶(SGOT)、谷丙转氨酶(SGPT)、尿蛋白、尿N-乙酰-β-D-胺基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(MG)升高及肾小球滤过率(GFR)下降的肝肾损害指征，光镜和电镜均发现肝肾的病理学改变，说明笔者建立的铬性肝肾损害的动物模型成功。
, http://www.100md.com
铬进入肝肾组织后，与肝肾组织中分子量约为1500D的低分子蛋白结合结合，形成低分子铬的结合物而蓄积在肝肾组织中[1，5]，当达到一定浓度时，对肝肾组织产生损害。Yamamote等[5]将重铬酸钾染毒的小鼠肝细胞匀浆上清液用葡聚糖凝胶层析分离，发现铬分布于高分子和低分子两个区带中，且80%为低分子铬结合物(LMW-Cr)。本次试验结果为染毒1天后，首先LMW-Cr显著升高，随之是HMW-Cr，第三天才有MMW-Cr，可说明铬进入肝肾组织后，与LMW蛋白特异性结合，当这种配位体大量消耗后，才与HMW和MMW蛋白结合。虽然MMW-Cr出现较晚，但是对照组未检出，说明这种小分子的铬结合物仅染毒组动物所特有，对于铬中毒的诊断和观察治疗效果具有特殊的意义。
从肝肾组织中铬结合物分析结果可以看出，肝脏中铬结合物略高于肾脏，说明肝脏组织合成的低分子蛋白配位体的量略高于肾脏组织。Wada等[2]报道：用去除铬的LMW配位体与无机铬同时给动物染毒，可明显降低铬中毒的死亡率，因此认为LMW配位体对铬有一定的解毒作用。
, http://www.100md.com
本试验采用葡聚糖凝胶柱层析法分离低分子铬结合物，所采用的spehadex G-50葡聚糖凝胶，对低分子蛋白质具有很好的分离效果。
①国家自然科学基金资助项目(编号 39300113)
作者：高泽宣 男 53岁 高级实验师
参考文献
1 Yamaguch S, Sano K, Shimojo N, et al. On the biological half-time of hexavalent chromium in Rats. Indust Health, 1983,21:24～27
2 Wada O, Wu GY, Yanamoto A, et al. Purification and chromium-exeretory function of low-molecular-weight, chromium-binding substance for dog liver. Environ Res, 1983,32:228～229
, 百拇医药
3 吴国用.关于机体内特异的铬结合物质的精制及其意义的研究.延边医学院学报，1992，5(3)：1～4
4 高泽宣，杜理国，王翔朴，等.原子吸收法分析肾脏亚细胞组分中的镉.中华预防医学杂志，1997，31(2)：127～128
5 Yamamote A, Wada O, Ono T, et al. A low-molecular-weight chromium-binding substance in mammals. Toxicol Appl Pharmacol, 1981,59:515～519
6 曾明，王翔朴，安飞云，等.铬中毒性肾损害与铬结合物关系的研究.职业医学，1998，25(3)：1～4
1998-03-03 收稿, 百拇医药
单位：环境医学研究室 长沙 410078
关键词：铬；中毒；分光光度测定法；原子吸收；疾病模型；动物；大鼠
湖南医科大学学报990303 提要 对雄性大鼠进行铬染毒，剂量为每kg体重2.55mg Cr6+，每天1次，连续染毒7d，停止染毒后继续观察7d。结果染毒1d后，大鼠肝肾组织中的低分子络结合物HMW-Cr，LMW-Cr及MMW-Cr较对照组显著升高，并随染毒时间的延长而不断升高；对照组中未检出MMW-Cr，可作为铬中毒的特异观察指标。采用葡聚糖凝胶G-50柱层析法分离低分子蛋白效果好。
中国图书分类号 O614.611 R595.2
Low-molecular-weight chromium-binding substances in hepatic and nephric tissues of chromium-exposed rats
, 百拇医药
Gao Zexuan Zeng Ming Wang Xiangpu An Feiyun
(Environmental Medicine Research Laboratory, Hunan Medical University, Changsha 410078)
Male Wistar rats were injected intraperitoneally with potassium dichromate(2.55mg Cr6+per kg body weight) for 7 days, and were observed continously for 7 days after stopping Cr injection. The results were that concentrations of chromium-binding substances (HMW-Cr, LMW-Cr, and MMW-Cr) increased significantly with the extension of Cr injection time; MMW-Cr was not found in the control group. MMW-Cr may be a valuable indicator in diagnosing chromium toxication. It was efficient to use Sephadex G-50 column chromatography and ultra-violet absorption spectrometry-atomic absorption spectrophotometry in isolation, and then it was followed by quantitative analysis of chromium-binding substances.
, 百拇医药
Key words chromium; poisoning; spectrophotometry,atomic absorption; disease models animals;rats
铬是一种常见的环境污染毒物，以3价和6价的铬化合物存在于自然界，铬及其化合物的工业用途很广，可能接触铬及其化合物的行业有冶金、制革、电镀和油漆等。铬主要通过呼吸道和皮肤进入机体，主要对肝、肾组织造成损害，而6价铬的毒性高于3价铬。肝肾组织中存在一种与铬特异性结合，分子量约为1500D的低分子铬结合物(Low molecular weight chromium-binding substance; LMCr)[1]。为研究铬化合物在肝肾组织中的存大形式及对肝肾组织的损害评价作用，笔者进行了动物实验研究，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 动物分组 健康雄性Wistar大鼠(由本校动物学部提供)50只，体重(260±20)g，随机分为对照组和铬染毒组，每组25只。
1.2 方法
1.2.1 动物染毒 铬染毒组的染毒剂量由预试实验确定，以保证大鼠的肝肾受到损害而又不致死亡。铬染毒组动物采用腹腔注射重铬酸钾溶液，剂量为每kg体重2.55mg Cr6+，每天1次，连续染毒7d，停止染毒后继续观察7d。对照组动物注射等体积的生理盐水溶液。
1.2.2 肝、肾组织样品的制备 于股动脉放血处死动物，立即取出肝脏和肾脏，去包膜和结缔组织，称重；分别切取肝组织和肾皮质各0.5g，剪碎后，加入相当于组织10倍体积的0.01mol磷酸缓冲液(pH7.2，含20mmol NaCl)，于细胞粉碎器(B-30型，USA)中制成匀浆，600g离心20min，去沉渣，再以100000g低温超速离心30min，取上清液备用。
, 百拇医药
1.2.3 LM Cr的分离 根据LM Cr的分子量范围，选择sephadex G-50凝胶柱层析法进行分离[2，3]，柱长1.0cm×50cm，洗脱液为0.01mol磷酸盐缓冲液，以蠕动泵(VGA-76型，USA)控制流速为18ml.h-1，以定时部分收集器收集洗脱液，每管3ml，用波长为280nm 751型紫外分光光度计，测定吸光度，并用已知分子量(MW)的牛血清白蛋白(MW68000)、胰蛋白酶(MW23300)、溶菌酶(MW14300)和杆菌肽(MW1450)作为参照物，以确定铬结合物的分子量。
1.2.4 LM Cr结合铬含量的分析 吸取上述洗脱液各0.1ml，加入1ml硝酸消化过夜，以Sepectr AA-40原子吸收分光光度计(Varian, USA)石墨炉法[4]进行测定，原子化温度为2500℃，方法灵敏度为0.15ng.ml-1，测定范围1～20ng.ml-1(进样量20μl)，平均回收率98.5%，变异数分析无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
1.3 统计学处理 数据经SPSS软件处理。
2 结 果
2.1 肝、肾组织铬结合物分子量分布和铬含量分析 铬染毒组大鼠肝脏和肾脏铬结合物紫外吸收光谱的分布有3个区带(附图)：分子量为70000～12500D的高分子部分(HMW-Cr)、分子量为12500～500D的低分子部分(LMW-Cr)以及分子量约为500D的小分子部分(MMW-Cr)。对照组仅有HMW-Cr和LMW-Cr两部分，未检出MMW-Cr。
附图 铬染毒7d大鼠肝肾组织中铬结合物Sephadex-50洗脱图示
Fig. Elution profile of liver and kidney supernatant from rats of 7days following chromium exposure on a Sephadex G-50 column
, 百拇医药
铬染毒组大鼠肝脏和肾脏铬结合物中铬含量分析结果(表1，2)说明，HMW-Cr，LMW-Cr及MMW-Cr在染毒后1d即开始升高，随染毒时间的延长，升高更明显，而正常对照组的肝脏和肾脏中均未检出MMW-Cr。
表1 大鼠肝组织铬结合物中铬含量结果(μg.g-1;n=50) 组别
染毒后(d)
停止染毒后(d)
1
2
3
7
7
, 百拇医药 对照组
HMW-Cr
0.146
0.120
0.129
0.152
0.118
LMW-Cr
0.475
0.417
0.453
0.510
0.425
, 百拇医药
MMW-Cr
未检出
未检出
未检出
未检出
未检出
染毒组
HMW-Cr
1.956①
3.148②
8.667②
18.488②
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2.977①
LMW-Cr
6.645②
14.746②
24.685②
29.078②
6.933②
MMW-Cr
0.187②
0.444②
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1.324②
2.506②
0.206
与对照组比较：①P<0.05;②P<0.01表2 大鼠肾组织铬结合物中铬含量结果(μg.g-1;n=50) 组别
染毒后(d)
停止染毒后(d)
1
2
3
7
7
, 百拇医药
对照组
HMW-Cr
0.202
0.180
0.178
0.226
0.209
LMW-Cr
0.424
0.384
0.396
0.454
0.455
, 百拇医药
MMW-Cr
未检出
未检出
未检出
未检出
未检出
染毒组
HMW-Cr
2.670①
7.967②
13.151②
18.043②
, 百拇医药
3.352①
LMW-Cr
6.547②
14.400②
18.846②
19.543②
5.825②
MMW-Cr
0.273②
0.859②
, 百拇医药
1.898②
2.960②
0.267
与对照组比较：①P<0.05;②P<0.01
3 讨 论
近年的研究发现，铬及其化合物对机体的肝脏和肾脏具有毒性作用，特别是对肾脏组织的危害性更大，因为肾脏既是铬的主要蓄积器官，又是铬的主要排泄器官，动物试验资料[1，5]表明，铬引起的动物急性中毒可导致肾小管坏死、肾功能障碍，甚至肾功能衰竭死亡。
我室以前的试验[6]结果表明，动物染毒后第一天即出现肝、肾、血和尿中铬含量显著高于对照组(P<0.01)，并先后出现谷草转氨酶(SGOT)、谷丙转氨酶(SGPT)、尿蛋白、尿N-乙酰-β-D-胺基葡萄糖苷酶(NAG)、β2-微球蛋白(MG)升高及肾小球滤过率(GFR)下降的肝肾损害指征，光镜和电镜均发现肝肾的病理学改变，说明笔者建立的铬性肝肾损害的动物模型成功。
, http://www.100md.com
铬进入肝肾组织后，与肝肾组织中分子量约为1500D的低分子蛋白结合结合，形成低分子铬的结合物而蓄积在肝肾组织中[1，5]，当达到一定浓度时，对肝肾组织产生损害。Yamamote等[5]将重铬酸钾染毒的小鼠肝细胞匀浆上清液用葡聚糖凝胶层析分离，发现铬分布于高分子和低分子两个区带中，且80%为低分子铬结合物(LMW-Cr)。本次试验结果为染毒1天后，首先LMW-Cr显著升高，随之是HMW-Cr，第三天才有MMW-Cr，可说明铬进入肝肾组织后，与LMW蛋白特异性结合，当这种配位体大量消耗后，才与HMW和MMW蛋白结合。虽然MMW-Cr出现较晚，但是对照组未检出，说明这种小分子的铬结合物仅染毒组动物所特有，对于铬中毒的诊断和观察治疗效果具有特殊的意义。
从肝肾组织中铬结合物分析结果可以看出，肝脏中铬结合物略高于肾脏，说明肝脏组织合成的低分子蛋白配位体的量略高于肾脏组织。Wada等[2]报道：用去除铬的LMW配位体与无机铬同时给动物染毒，可明显降低铬中毒的死亡率，因此认为LMW配位体对铬有一定的解毒作用。
, http://www.100md.com
本试验采用葡聚糖凝胶柱层析法分离低分子铬结合物，所采用的spehadex G-50葡聚糖凝胶，对低分子蛋白质具有很好的分离效果。
①国家自然科学基金资助项目(编号 39300113)
作者：高泽宣 男 53岁 高级实验师
参考文献
1 Yamaguch S, Sano K, Shimojo N, et al. On the biological half-time of hexavalent chromium in Rats. Indust Health, 1983,21:24～27
2 Wada O, Wu GY, Yanamoto A, et al. Purification and chromium-exeretory function of low-molecular-weight, chromium-binding substance for dog liver. Environ Res, 1983,32:228～229
, 百拇医药
3 吴国用.关于机体内特异的铬结合物质的精制及其意义的研究.延边医学院学报，1992，5(3)：1～4
4 高泽宣，杜理国，王翔朴，等.原子吸收法分析肾脏亚细胞组分中的镉.中华预防医学杂志，1997，31(2)：127～128
5 Yamamote A, Wada O, Ono T, et al. A low-molecular-weight chromium-binding substance in mammals. Toxicol Appl Pharmacol, 1981,59:515～519
6 曾明，王翔朴，安飞云，等.铬中毒性肾损害与铬结合物关系的研究.职业医学，1998，25(3)：1～4
1998-03-03 收稿, 百拇医药