Intralipid对吞噬细胞氧自由基产生的影响
作者：吴国豪 Connie Jarstrand Jorgen Nordenstrom
单位：吴国豪(上海医科大学附属中山医院普外科，上海 200032)；Connie Jarstrand Jorgen Nordenstrom(Department of Clinical Bacteriology and Surgery, Huddinge University Hospital,Karolinska Institute,Sweden)
关键词：吞噬细胞；Intralipid；氧自由基
肠外与肠内营养990306 摘要：目的：观察Intralipid对内毒素所致的多形核白细胞氧自由基产生的影响。 方法：取22例健康志愿者静脉血，采用Boyum法提取多形核白细胞(PMN)，并在体外培养。采用不同剂量的脂多糖(LPS)刺激PMN，并和不同剂量Intralipid共同作用。采用NBT还原试验测定氧自由基的产生量。 结果：LPS刺激各组的NBT值明显高于非刺激组，而且NBT值与LPS浓度明显相关。Intralipid可明显降低NBT值，且NBT值与Intralipid浓度呈负的线性相关。 结论：不论有无内毒素刺激，Intralipid在体外均可抑制吞噬细胞产生氧自由基。
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中图分类号：Q26 文献标识码：A 文章编号：1007-810X(1999)03-0138-03
氧自由基所致的氧化应激和组织损伤是近年来日益关注的课题。临床上，在严重创伤、感染或缺血-再灌注等情况下，机体产生大量氧自由基，从而造成组织脏器的损害。以往一些动物实验及临床研究发现，循环中各种脂蛋白可有效地抑制内毒素所致的自由基和细胞因子的产生，降低内毒素血症所致的实验动物的死亡率[1～3]。Intralipid是目前临床上肠外营养支持中应用最为广泛的一种脂肪乳剂，被认为具有与内源性脂蛋白相似的抑制内毒素所致的氧自由基产生的功能[4]。本研究目的是测定Intralipid在体外是否影响多形核白细胞(PMN)的氧自由基的产生。
1 资料和方法
1.1 多形核白细胞(PMN)提取法 选择22名健康志愿者(20～62岁)，各取40～50 ml静脉血，按照Boyum法加入含甲基泛影酸钠和甲基纤维素的柱子中，静置1 h后取上清液，加入等体积的Hanks液，混匀离心后取上清液，取样着色后在显微镜下计数PMN，再离心除去上清液后，加入pH为7.2～7.4的Eagles液，将PMN稀释成12×106/ml浓度备用。
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1.2 硝基蓝四氮唑(Nitroblue tetrazolium,NBT)还原试验 NBT是电子受体，通常被用来间接测定由PMN所产生的氧自由基的量，其表示式如下：
，黄色的水溶性NBT与氧自由基结合后可转化为暗蓝色的不溶于水的甲(formazan)，甲可通过分光光度测定法测定。该方法可以间接了解PMN在吞噬过程中氧化代谢(线粒体呼吸链的呼吸爆发)情况。
1.3 实验方法 实验分单纯PMN组(对照组)和不同剂量脂肪乳剂组。脂肪乳剂采用20%Intralipid
(Pharmacia & Upjhon Co,Stockholm,Sweden),每升脂肪乳剂含200 g大豆油、12 g磷脂和22.5 g甘油。采用大肠杆菌来源的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS,L-6529,Sigma Chemical Co)作为刺激剂。在含0.2 ml PMN液的干净玻璃试管中各加入三种不同浓度即含甘油三酯分别为0.4、2.0、10 g/L的脂肪乳剂和作为对照的Hanks液各0.1 ml。再在单纯PMN(对照)组和不同剂量脂肪乳剂各组中，分别加入三种不同浓度的LPS(20.0、2.0、0.2 mg/L)或作为对照的Hanks液各0.01 ml。然后，加入0.1 ml各健康志愿者的血浆和0.1%浓度NBT液0.5 ml。密封试管置37℃温箱中孵育60 min，然后加入1 ml 0.5%HCl终止反应。离心10 min后移去上清液，再加入1 ml的DMSO液以提取甲，试管再次密封后震荡20 min，在570 nm波长用分光光度仪测定光密度。
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1.4 统计学处理 所有数据均采用均数±标准差表示，应用变量分析软件(ANOVA)作统计学差异分析。P<0.05作为统计学显著差异界限。
2 结果
PMN介导的NBT还原反应见表1。LPS刺激各组的NBT值明显高于无LPS刺激组，NBT值与LPS浓度明显相关，差异显著(P<0.01)。脂肪乳剂可明显降低NBT值，脂肪乳剂浓度与NBT值之间呈负线性相关(r=-0.86,P<0.01)，但脂肪乳剂并不能完全消除LPS所致的氧自由基产生。在无LPS存在情况下，Intralipid同样也能抑制吞噬细胞的氧自由基产生。
表1 LPS和Intralipid对吞噬细胞的NBT还原反应的作用
Tab.1 Effect of LPS and Intratipid on NBT reduction LPS浓度
, 百拇医药
(mg/L)
单纯PMN组
Intralipid组(g/L)
0.4
2.0
10
20
0.66±0.09#
0.56±0.08*
0.45±0.05*
0.34±0.05*
, 百拇医药
2
0.58±0.05#
0.50±0.06*
0.42±0.05*
0.35±0.06*
0.2
0.50±0.05#
0.45±0.05*
0.39±0.04*
0.33±0.03*
, 百拇医药
0
0.35±0.03
0.28±0.01*
0.20±0.02*
0.12±0.01*
*与LPS同浓度的单纯PMN组比较，P<0.01;#与无LPS刺激的单纯PMN组比较，P<0.01
3 讨论
革兰阴性杆菌的LPS可导致吞噬细胞释放氧自由基等介质，在革兰阴性菌败血症的病理生理中起重要作用。有学者认为，该现象是LPS通过与吞噬细胞膜上含胆固醇脂的脂蛋白相结合而起作用[4，5]。体外实验发现，LPS与极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、乳糜微粒和吞噬细胞一起孵育时，可有抑制内毒素的作用，降低吞噬细胞氧自由基和细胞因子的产生。体内研究证明，LPS在体内能与各种脂蛋白结合，从而缓解内毒素引起的炎症反应。另一方面，革兰阴性菌感染可促使肝的内源性脂蛋白的产生，中和、缓解内毒素的作用[6]。LPS与各种脂蛋白结合，减少了其与吞噬细胞的结合量，从而降低了吞噬细胞介导的自由基和细胞因子等介质的产生，减轻了炎性反应和组织损伤程度[7，8]。
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Intralipid是一种由大豆甘油三酯和卵磷脂制作而成的脂肪乳剂，其颗粒大小、体内代谢特征均类似于乳糜微粒。动物实验表明，Intralipid可降低内毒素所致的大鼠的死亡率[9]。本研究结果显示，经LPS刺激后，吞噬细胞的NBT还原试验值明显增加。这是因为LPS中的脂质A部分与吞噬细胞胞膜中的磷脂和(或)甘油-磷脂受体结合，激活了吞噬细胞。吞噬细胞线粒体内氧化反应(呼吸爆发)增加，产生大量氧自由基。吞噬细胞的氧化应激增加，是机体抵御外界病原菌入侵的正常防御机制，但同时也可造成组织损伤。本研究结果表明，在体外孵育和刺激吞噬细胞这一类似体内感染环境的系统中，加入Intralipid后可明显抑制吞噬细胞氧自由基的产生，且抑制程度与Intralipid的浓度明显相关。我们认为其机制可能是：①LPS中的脂质A部分与Intralipid颗粒中的磷脂相结合，从而减少了LPS与吞噬细胞胞膜中的磷脂和(或)甘油-磷脂受体的结合，减少了氧自由基的产生；②Intralipid可能改变吞噬细胞胞膜结构或掩盖了吞噬细胞胞膜上与LPS中脂质A相结合的位点，从而导致吞噬细胞的氧自由基产生减少。本研究还发现，Intralipid并不能完全消除LPS所致的氧自由基的产生。我们认为可能是因为除脂质A部分外，尚有其他与吞噬细胞结合的位点。此外，在无LPS存在情况下，Intralipid同样也可抑制吞噬细胞的氧自由基产生，这一现象与我们早年的研究结果相一致[10]。我们认为是Intralipid改变了吞噬细胞胞膜上磷脂结构，降低吞噬细胞活性，从而影响其氧自由基的产生。
, 百拇医药
由此可见，在体外，临床上常用的脂肪乳剂Intralipid具有与血浆脂蛋白相似的功能，可抑制吞噬细胞介导的氧自由基的产生。但是，临床上输注脂肪乳剂是否会抑制吞噬细胞介导的氧化应激、组织损伤，尚有待进一步的研究。
参考文献：
[1]Harris HW,Grunfeld C,Feingold KR et al.Human very low density lipoproteins and chylomicrons can protect against endotoxin-induced death in mice[J].J Clin Invest,1990,86:696
[2]Feingold KR,Funk JL,Moser AH et al.Role for circulating lipoproteins in protection from endotoxin toxicity[J].Infect Immun,1995,63:2041
, http://www.100md.com
[3]Poll T,Braxton CC,Coyle SM et al.Effect of hypertriglyceridemia on endotoxin responsiveness in humans[J].Infect Immun,1995,63:3396
[4]Jarstrand C,Rasool O.Intralipid decreases the bacterial lipopolysaccharide induced release of oxygen radicals and lysozyme from human neutrophils[J].Scand J Infect Dis,1991,23:481
[5]Ulevitch RJ.Interactions of bacterial lipoplysaccharides and plasma high density lipoproteins.In cellular biology of endotoxin[J].Handb Endotoxin,1985,3:372
, http://www.100md.com
[6]Liao W,CH Floren.Hyperlipidemic response to endotoxin——a part of the host defense mechanism[J].Scand J Infect Dis,1993,25:675
[7]Eichbaum EB,Harris HW,Kane JP et al.Chylomicrons can inhibit endotoxin activity in vitro[J].J Surg Res,1991,51:413
[8]Grunfeld C,Feingold KR.Tumor necrosis factor,cytokines,and the hyperlipidemia of infection[J].Trends Endoctinol Metab,1991,2:213
[9]Read TEC,Grunfeld Z,Kumwenda MC et al.Triglyceride-rich lipoproteins improve survival when given after endotoxin in rats[J].Surgery,1995,117:62
[10]Jarstrand C,Berghem L,Lahnborg G.Human granulocyte and reticuloendothelial system function during Intralipid infusion[J].JPEN,1978,2:663
收稿日期：1998-11-26；修订日期：1999-05-10, 百拇医药
单位：吴国豪(上海医科大学附属中山医院普外科，上海 200032)；Connie Jarstrand Jorgen Nordenstrom(Department of Clinical Bacteriology and Surgery, Huddinge University Hospital,Karolinska Institute,Sweden)
关键词：吞噬细胞；Intralipid；氧自由基
肠外与肠内营养990306 摘要：目的：观察Intralipid对内毒素所致的多形核白细胞氧自由基产生的影响。 方法：取22例健康志愿者静脉血，采用Boyum法提取多形核白细胞(PMN)，并在体外培养。采用不同剂量的脂多糖(LPS)刺激PMN，并和不同剂量Intralipid共同作用。采用NBT还原试验测定氧自由基的产生量。 结果：LPS刺激各组的NBT值明显高于非刺激组，而且NBT值与LPS浓度明显相关。Intralipid可明显降低NBT值，且NBT值与Intralipid浓度呈负的线性相关。 结论：不论有无内毒素刺激，Intralipid在体外均可抑制吞噬细胞产生氧自由基。
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中图分类号：Q26 文献标识码：A 文章编号：1007-810X(1999)03-0138-03
氧自由基所致的氧化应激和组织损伤是近年来日益关注的课题。临床上，在严重创伤、感染或缺血-再灌注等情况下，机体产生大量氧自由基，从而造成组织脏器的损害。以往一些动物实验及临床研究发现，循环中各种脂蛋白可有效地抑制内毒素所致的自由基和细胞因子的产生，降低内毒素血症所致的实验动物的死亡率[1～3]。Intralipid是目前临床上肠外营养支持中应用最为广泛的一种脂肪乳剂，被认为具有与内源性脂蛋白相似的抑制内毒素所致的氧自由基产生的功能[4]。本研究目的是测定Intralipid在体外是否影响多形核白细胞(PMN)的氧自由基的产生。
1 资料和方法
1.1 多形核白细胞(PMN)提取法 选择22名健康志愿者(20～62岁)，各取40～50 ml静脉血，按照Boyum法加入含甲基泛影酸钠和甲基纤维素的柱子中，静置1 h后取上清液，加入等体积的Hanks液，混匀离心后取上清液，取样着色后在显微镜下计数PMN，再离心除去上清液后，加入pH为7.2～7.4的Eagles液，将PMN稀释成12×106/ml浓度备用。
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1.2 硝基蓝四氮唑(Nitroblue tetrazolium,NBT)还原试验 NBT是电子受体，通常被用来间接测定由PMN所产生的氧自由基的量，其表示式如下：
，黄色的水溶性NBT与氧自由基结合后可转化为暗蓝色的不溶于水的甲(formazan)，甲可通过分光光度测定法测定。该方法可以间接了解PMN在吞噬过程中氧化代谢(线粒体呼吸链的呼吸爆发)情况。1.3 实验方法 实验分单纯PMN组(对照组)和不同剂量脂肪乳剂组。脂肪乳剂采用20%Intralipid
(Pharmacia & Upjhon Co,Stockholm,Sweden),每升脂肪乳剂含200 g大豆油、12 g磷脂和22.5 g甘油。采用大肠杆菌来源的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS,L-6529,Sigma Chemical Co)作为刺激剂。在含0.2 ml PMN液的干净玻璃试管中各加入三种不同浓度即含甘油三酯分别为0.4、2.0、10 g/L的脂肪乳剂和作为对照的Hanks液各0.1 ml。再在单纯PMN(对照)组和不同剂量脂肪乳剂各组中，分别加入三种不同浓度的LPS(20.0、2.0、0.2 mg/L)或作为对照的Hanks液各0.01 ml。然后，加入0.1 ml各健康志愿者的血浆和0.1%浓度NBT液0.5 ml。密封试管置37℃温箱中孵育60 min，然后加入1 ml 0.5%HCl终止反应。离心10 min后移去上清液，再加入1 ml的DMSO液以提取甲，试管再次密封后震荡20 min，在570 nm波长用分光光度仪测定光密度。, http://www.100md.com
1.4 统计学处理 所有数据均采用均数±标准差表示，应用变量分析软件(ANOVA)作统计学差异分析。P<0.05作为统计学显著差异界限。
2 结果
PMN介导的NBT还原反应见表1。LPS刺激各组的NBT值明显高于无LPS刺激组，NBT值与LPS浓度明显相关，差异显著(P<0.01)。脂肪乳剂可明显降低NBT值，脂肪乳剂浓度与NBT值之间呈负线性相关(r=-0.86,P<0.01)，但脂肪乳剂并不能完全消除LPS所致的氧自由基产生。在无LPS存在情况下，Intralipid同样也能抑制吞噬细胞的氧自由基产生。
表1 LPS和Intralipid对吞噬细胞的NBT还原反应的作用
Tab.1 Effect of LPS and Intratipid on NBT reduction LPS浓度
, 百拇医药
(mg/L)
单纯PMN组
Intralipid组(g/L)
0.4
2.0
10
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0.66±0.09#
0.56±0.08*
0.45±0.05*
0.34±0.05*
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*与LPS同浓度的单纯PMN组比较，P<0.01;#与无LPS刺激的单纯PMN组比较，P<0.01
3 讨论
革兰阴性杆菌的LPS可导致吞噬细胞释放氧自由基等介质，在革兰阴性菌败血症的病理生理中起重要作用。有学者认为，该现象是LPS通过与吞噬细胞膜上含胆固醇脂的脂蛋白相结合而起作用[4，5]。体外实验发现，LPS与极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)、乳糜微粒和吞噬细胞一起孵育时，可有抑制内毒素的作用，降低吞噬细胞氧自由基和细胞因子的产生。体内研究证明，LPS在体内能与各种脂蛋白结合，从而缓解内毒素引起的炎症反应。另一方面，革兰阴性菌感染可促使肝的内源性脂蛋白的产生，中和、缓解内毒素的作用[6]。LPS与各种脂蛋白结合，减少了其与吞噬细胞的结合量，从而降低了吞噬细胞介导的自由基和细胞因子等介质的产生，减轻了炎性反应和组织损伤程度[7，8]。
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Intralipid是一种由大豆甘油三酯和卵磷脂制作而成的脂肪乳剂，其颗粒大小、体内代谢特征均类似于乳糜微粒。动物实验表明，Intralipid可降低内毒素所致的大鼠的死亡率[9]。本研究结果显示，经LPS刺激后，吞噬细胞的NBT还原试验值明显增加。这是因为LPS中的脂质A部分与吞噬细胞胞膜中的磷脂和(或)甘油-磷脂受体结合，激活了吞噬细胞。吞噬细胞线粒体内氧化反应(呼吸爆发)增加，产生大量氧自由基。吞噬细胞的氧化应激增加，是机体抵御外界病原菌入侵的正常防御机制，但同时也可造成组织损伤。本研究结果表明，在体外孵育和刺激吞噬细胞这一类似体内感染环境的系统中，加入Intralipid后可明显抑制吞噬细胞氧自由基的产生，且抑制程度与Intralipid的浓度明显相关。我们认为其机制可能是：①LPS中的脂质A部分与Intralipid颗粒中的磷脂相结合，从而减少了LPS与吞噬细胞胞膜中的磷脂和(或)甘油-磷脂受体的结合，减少了氧自由基的产生；②Intralipid可能改变吞噬细胞胞膜结构或掩盖了吞噬细胞胞膜上与LPS中脂质A相结合的位点，从而导致吞噬细胞的氧自由基产生减少。本研究还发现，Intralipid并不能完全消除LPS所致的氧自由基的产生。我们认为可能是因为除脂质A部分外，尚有其他与吞噬细胞结合的位点。此外，在无LPS存在情况下，Intralipid同样也可抑制吞噬细胞的氧自由基产生，这一现象与我们早年的研究结果相一致[10]。我们认为是Intralipid改变了吞噬细胞胞膜上磷脂结构，降低吞噬细胞活性，从而影响其氧自由基的产生。
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由此可见，在体外，临床上常用的脂肪乳剂Intralipid具有与血浆脂蛋白相似的功能，可抑制吞噬细胞介导的氧自由基的产生。但是，临床上输注脂肪乳剂是否会抑制吞噬细胞介导的氧化应激、组织损伤，尚有待进一步的研究。
参考文献：
[1]Harris HW,Grunfeld C,Feingold KR et al.Human very low density lipoproteins and chylomicrons can protect against endotoxin-induced death in mice[J].J Clin Invest,1990,86:696
[2]Feingold KR,Funk JL,Moser AH et al.Role for circulating lipoproteins in protection from endotoxin toxicity[J].Infect Immun,1995,63:2041
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[3]Poll T,Braxton CC,Coyle SM et al.Effect of hypertriglyceridemia on endotoxin responsiveness in humans[J].Infect Immun,1995,63:3396
[4]Jarstrand C,Rasool O.Intralipid decreases the bacterial lipopolysaccharide induced release of oxygen radicals and lysozyme from human neutrophils[J].Scand J Infect Dis,1991,23:481
[5]Ulevitch RJ.Interactions of bacterial lipoplysaccharides and plasma high density lipoproteins.In cellular biology of endotoxin[J].Handb Endotoxin,1985,3:372
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[6]Liao W,CH Floren.Hyperlipidemic response to endotoxin——a part of the host defense mechanism[J].Scand J Infect Dis,1993,25:675
[7]Eichbaum EB,Harris HW,Kane JP et al.Chylomicrons can inhibit endotoxin activity in vitro[J].J Surg Res,1991,51:413
[8]Grunfeld C,Feingold KR.Tumor necrosis factor,cytokines,and the hyperlipidemia of infection[J].Trends Endoctinol Metab,1991,2:213
[9]Read TEC,Grunfeld Z,Kumwenda MC et al.Triglyceride-rich lipoproteins improve survival when given after endotoxin in rats[J].Surgery,1995,117:62
[10]Jarstrand C,Berghem L,Lahnborg G.Human granulocyte and reticuloendothelial system function during Intralipid infusion[J].JPEN,1978,2:663
收稿日期：1998-11-26；修订日期：1999-05-10, 百拇医药