整合素α5亚基蛋白的表达与乳腺癌病理和临床的关系
作者：袁建达 邵志敏 韩企夏 沈镇宙
单位：200032 上海医科大学肿瘤医院分子生物学实验室
关键词：
中华医学杂志990318 整合素是与肿瘤转移密切相关的细胞粘附分子之一。近年来发现，它参与肿瘤细胞转移粘附过程。我们应用免疫组织化学方法检测了乳腺癌中整合素α5亚基的表达情况，探讨其与乳腺癌病理和临床生物指标的关系。
一、对象和方法
1.对象：上海医科大学肿瘤医院1988～1989年手术切除的乳腺癌标本105例，术前未曾接受放疗和化疗。随访时间在2～9年，中位随访期5.1年，均为女性病例，年龄为25～78岁，平均年龄52.8岁。
每个病例均具有完整的临床病史资料，病理诊断和随访资料。所有病例按乳腺癌的诊断标准，进行病理诊断，病理分类：参照中国常见恶性肿瘤诊治规范第8分册乳腺癌的标准。组织学分级按Scarff-Bloom-Richandsm法分为：(1) 组织分化程度(以腺管的形成为主要依据)，高分化为1分，中分化为2分，低分化为3分；(2) 核多形性：按轻、中、重分别定为1、2、3分；(3) 核分裂相：1～10个/10个高倍视野(HPE)为1分，11～20个/10个HPE为2分，>21个/10个HPE为3分。将以上三方面得分相加，确定病理分级：Ⅰ级3～5分为分化好，Ⅱ级6～7分为分化中，Ⅲ级8～9分为分化差。
, 百拇医药
2.试剂：整合素α5亚基P1D6单克隆抗体为GIBCO BRL产品，由上海医科大学生化教研室查锡良教授赠送，ABC试剂盒为Vector产品。
3.免疫组织化学染色：应用Hsu等[1]免疫组织化学方法染色，石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，胰酶消化，H2O2封闭，小牛血清孵育，加入第一抗体4 ℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，加入SABC试剂质量分数为0.04%重氮氨基苯-0.03% H2O2室温显微镜下控制显色5分钟。由于整合素α5亚基部分定位于细胞核，故未用苏木素复染，清水洗涤后常规脱水、透明，封片。以细胞膜或胞浆出现棕色颗粒为阳性细胞。根据棕色颗粒的着色深浅，将染色强度分为(Ⅰ)无反应或微弱反应；(Ⅱ)棕色反应；(Ⅲ)深棕色反应3组。计算(Ⅱ)、(Ⅲ)两组每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，并将(Ⅰ)组病例数归入染色反应(-)组，最后确定整合素α5亚基染色反应半定量分级：(-)为0%～25%，(+)为26%～74%，(++)为75%～100%。实验中省去第一抗体作为阴性 对照，同时应用MCF-7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。
, 百拇医药
4.统计学分析：采用上海医科大学流行病学教研室Epi Info(5.0版本)统计软件进行χ2检验，比较整合素α5亚基蛋白的表达水平与临床指标的关系。
二、结果
1.整合素α5亚基的定位及表达水平：免疫组织化学染色的结果，105例乳腺癌组织整合素α5亚基均定位于乳腺癌细胞膜和(或)细胞浆，其染色强度和阳性细胞百分率明显不同，呈异质性分布。癌旁乳腺良性病变整合素α5亚基定位和乳腺癌细胞相似，但对于乳腺导管增生区细胞染色相对较强，且有部分细胞染色定位于细胞浆，提示该细胞生长活跃(图1)。
图1 整合素α5亚基在乳腺癌细胞膜上阳性表达(SABC法×400)
2.整合素α5亚基蛋白表达和临床病理指标的关系：整合素α5亚基蛋白的表达与乳腺癌组织学分型、组织学分类无关，该蛋白的表达和乳腺癌细胞的组织学分级有关(P<0.05)。分化好、增殖活性低的Ⅰ级组，α5亚基的阳性率为58.1%(36/62)，而分化差、增殖活性高的Ⅲ级组，α5亚基的阳性率为1/9。
, 百拇医药
3.α5亚基蛋白的表达水平与临床指标的关系：α5亚基蛋白的表达水平与乳腺癌腋淋巴结转移，肿瘤远处转移、随访结果有关(P<0.05)。α5亚基蛋白的表达与病人的年龄、肿瘤大小、ER、PR、局部复发无关(P>0.05)，见表1。
表1 α5亚基蛋白的表达水平与临床指标的关系 临床病理指标
例数
α5亚基蛋白表达
阳性率
(%)
χ2值
P值
-
+
, 百拇医药
++
年龄
≤40
20
14
1
5
30
40-60
53
27
12
14
49
, 百拇医药
6.14
>0.05
>60
32
13
6
13
59
(v=4)
肿瘤大小
<3 cm
56
26
, 百拇医药
11
19
54
1.21
>0.05
≥3 cm
49
28
8
13
43
(v=2)
腋淋巴结转移
, 百拇医药
-
48
12
12
24
75
+
28
19
3
6
32
26.8
<0.01
, 百拇医药
++
29
23
4
2
21
(v=4)
ER状态
-
54
31
12
11
43
, 百拇医药
5.54
>0.05
+
51
23
7
21
55
(v=2)
PR状态
-
72
38
, http://www.100md.com 13
21
47
0.21
>0.05
+
33
16
6
11
52
(v=2)
局部复发
无
, 百拇医药
94
47
17
30
50
0.97
>0.05
有
11
7
2
2
36
(v=2)
, http://www.100md.com
远处转移
无
77
32
18
27
58
11.92
<0.01
有
28
22
1
5
, 百拇医药
21
(v=2)
随访结果
健在
81
35
18
28
57
带癌
14
12
0
2
, 百拇医药
14
10.60
<0.01
死亡
10
7
1
2
30
(v=4)
三、讨论
目前研究发现，有14种α亚单位和8种β亚单位，由此产生了不同的整合素组型。许多研究发现，整合素家族与胃癌、肠癌、黑色素瘤的恶性程度有关[1，2]。整合素α5亚基是与β1亚基组成的异型二聚体，是基质的重要成分纤连蛋白的受体(fibronectin receptor，EnR)。肿瘤细胞表达的亚基经与宿主间质细胞的纤连蛋白结合后，改变肿瘤细胞的侵袭与转移的状态。Varner等[3]转染α5β1基因至HT29肠癌细胞株中，α5β1高度抑制DNA的合成和细胞的增殖，α5β1高表达的转染细胞株的增殖明显减少，这可能是和整合素α5β1经与纤连蛋白的结合而抑制了信号的传递，从而抑制肿瘤细胞的生长有关，提示α5亚基在肿瘤中起抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用。Akiyama等[4]亦证实α5亚基的抑制肿瘤的作用。
, 百拇医药
本研究发现，整合素α5亚基蛋白在乳腺癌标本中主要定位于细胞膜，部分见于细胞浆。整合素α5亚基蛋白表达的阳性率为48.6%，α5亚基蛋白的表达和乳腺癌的组织学分级、腋淋巴结转移，远处转移，随访结果有关(P<0.05)。整合素α5亚基蛋白的表达和组织学分型、组织学分类、患者年龄、肿瘤大小、雌孕激素受体、局部复发无关。
本研究提示，整合素α5亚基蛋白的表达和乳腺癌的增殖、分化有着密切的关系，起抑制肿瘤增殖作用。淋巴结阳性乳腺癌整合素α5亚基表达率为26.3%(15/17)，而淋巴结阴性整合素α5亚基表达率为75%(36/48)，两者差别具有统计学意义(P<0.01)。由此推测整合素α5亚基起负向调节作用，抑制乳腺癌细胞的转移。本组105例病例随访9年的结果显示健在组整合素α5亚基的阳性率为56.8%(46/81)；而带癌组为14.3%(2/14)；死亡组为30%(3/10)(P<0.05)。整合素α5亚基阳性病例预后明显好于整合素α5亚基阴性组。整合素α5亚基蛋白的表达和临床的预后有关。临床上通过检测该蛋白的表达判断患者的预后，指导临床的治疗。 参考文献
, 百拇医药
1 Patriarca C, Zvaryi D, Fles D, et al. Distribution of extracellular and cytoplasmic domain of the alpha 3 and alpha 6 integrin subunits in solid tumors. Int J Cancer, 1995, 3：182-185.
2 Synythe WR, Lebel E, Bacaria, et al. Integrin expression in non-small cell carcinoma of the lung. Cancer metastasis Rev, 1995, 14：229-333.
3 Varner JH, Emerson DA, Juliano RL. Integrin alpha 5 expression negatively regulates cell growth: reversal by attachment to fibronectin. Mol Biol Cell, 1995, 6：725-729.
4 Akiyama SK, Olden K, Yamada KM. Fibronectn and integrin in invasion metastasis. Cancer metastasis Rev, 1995, 14：173-189.
(收稿：1998-01-24 修回：1998-09-29), 百拇医药
单位：200032 上海医科大学肿瘤医院分子生物学实验室
关键词：
中华医学杂志990318 整合素是与肿瘤转移密切相关的细胞粘附分子之一。近年来发现，它参与肿瘤细胞转移粘附过程。我们应用免疫组织化学方法检测了乳腺癌中整合素α5亚基的表达情况，探讨其与乳腺癌病理和临床生物指标的关系。
一、对象和方法
1.对象：上海医科大学肿瘤医院1988～1989年手术切除的乳腺癌标本105例，术前未曾接受放疗和化疗。随访时间在2～9年，中位随访期5.1年，均为女性病例，年龄为25～78岁，平均年龄52.8岁。
每个病例均具有完整的临床病史资料，病理诊断和随访资料。所有病例按乳腺癌的诊断标准，进行病理诊断，病理分类：参照中国常见恶性肿瘤诊治规范第8分册乳腺癌的标准。组织学分级按Scarff-Bloom-Richandsm法分为：(1) 组织分化程度(以腺管的形成为主要依据)，高分化为1分，中分化为2分，低分化为3分；(2) 核多形性：按轻、中、重分别定为1、2、3分；(3) 核分裂相：1～10个/10个高倍视野(HPE)为1分，11～20个/10个HPE为2分，>21个/10个HPE为3分。将以上三方面得分相加，确定病理分级：Ⅰ级3～5分为分化好，Ⅱ级6～7分为分化中，Ⅲ级8～9分为分化差。
, 百拇医药
2.试剂：整合素α5亚基P1D6单克隆抗体为GIBCO BRL产品，由上海医科大学生化教研室查锡良教授赠送，ABC试剂盒为Vector产品。
3.免疫组织化学染色：应用Hsu等[1]免疫组织化学方法染色，石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，胰酶消化，H2O2封闭，小牛血清孵育，加入第一抗体4 ℃冰箱过夜，PBS洗3次，加入生物素化马抗鼠IgG 50 μl，加入SABC试剂质量分数为0.04%重氮氨基苯-0.03% H2O2室温显微镜下控制显色5分钟。由于整合素α5亚基部分定位于细胞核，故未用苏木素复染，清水洗涤后常规脱水、透明，封片。以细胞膜或胞浆出现棕色颗粒为阳性细胞。根据棕色颗粒的着色深浅，将染色强度分为(Ⅰ)无反应或微弱反应；(Ⅱ)棕色反应；(Ⅲ)深棕色反应3组。计算(Ⅱ)、(Ⅲ)两组每例切片5个高倍视野中阳性染色反应细胞的百分率，并将(Ⅰ)组病例数归入染色反应(-)组，最后确定整合素α5亚基染色反应半定量分级：(-)为0%～25%，(+)为26%～74%，(++)为75%～100%。实验中省去第一抗体作为阴性 对照，同时应用MCF-7人乳腺癌细胞爬片染色作为阳性对照。
, 百拇医药
4.统计学分析：采用上海医科大学流行病学教研室Epi Info(5.0版本)统计软件进行χ2检验，比较整合素α5亚基蛋白的表达水平与临床指标的关系。
二、结果
1.整合素α5亚基的定位及表达水平：免疫组织化学染色的结果，105例乳腺癌组织整合素α5亚基均定位于乳腺癌细胞膜和(或)细胞浆，其染色强度和阳性细胞百分率明显不同，呈异质性分布。癌旁乳腺良性病变整合素α5亚基定位和乳腺癌细胞相似，但对于乳腺导管增生区细胞染色相对较强，且有部分细胞染色定位于细胞浆，提示该细胞生长活跃(图1)。
图1 整合素α5亚基在乳腺癌细胞膜上阳性表达(SABC法×400)
2.整合素α5亚基蛋白表达和临床病理指标的关系：整合素α5亚基蛋白的表达与乳腺癌组织学分型、组织学分类无关，该蛋白的表达和乳腺癌细胞的组织学分级有关(P<0.05)。分化好、增殖活性低的Ⅰ级组，α5亚基的阳性率为58.1%(36/62)，而分化差、增殖活性高的Ⅲ级组，α5亚基的阳性率为1/9。
, 百拇医药
3.α5亚基蛋白的表达水平与临床指标的关系：α5亚基蛋白的表达水平与乳腺癌腋淋巴结转移，肿瘤远处转移、随访结果有关(P<0.05)。α5亚基蛋白的表达与病人的年龄、肿瘤大小、ER、PR、局部复发无关(P>0.05)，见表1。
表1 α5亚基蛋白的表达水平与临床指标的关系 临床病理指标
例数
α5亚基蛋白表达
阳性率
(%)
χ2值
P值
-
+
, 百拇医药
++
年龄
≤40
20
14
1
5
30
40-60
53
27
12
14
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, 百拇医药
6.14
>0.05
>60
32
13
6
13
59
(v=4)
肿瘤大小
<3 cm
56
26
, 百拇医药
11
19
54
1.21
>0.05
≥3 cm
49
28
8
13
43
(v=2)
腋淋巴结转移
, 百拇医药
-
48
12
12
24
75
+
28
19
3
6
32
26.8
<0.01
, 百拇医药
++
29
23
4
2
21
(v=4)
ER状态
-
54
31
12
11
43
, 百拇医药
5.54
>0.05
+
51
23
7
21
55
(v=2)
PR状态
-
72
38
, http://www.100md.com 13
21
47
0.21
>0.05
+
33
16
6
11
52
(v=2)
局部复发
无
, 百拇医药
94
47
17
30
50
0.97
>0.05
有
11
7
2
2
36
(v=2)
, http://www.100md.com
远处转移
无
77
32
18
27
58
11.92
<0.01
有
28
22
1
5
, 百拇医药
21
(v=2)
随访结果
健在
81
35
18
28
57
带癌
14
12
0
2
, 百拇医药
14
10.60
<0.01
死亡
10
7
1
2
30
(v=4)
三、讨论
目前研究发现，有14种α亚单位和8种β亚单位，由此产生了不同的整合素组型。许多研究发现，整合素家族与胃癌、肠癌、黑色素瘤的恶性程度有关[1，2]。整合素α5亚基是与β1亚基组成的异型二聚体，是基质的重要成分纤连蛋白的受体(fibronectin receptor，EnR)。肿瘤细胞表达的亚基经与宿主间质细胞的纤连蛋白结合后，改变肿瘤细胞的侵袭与转移的状态。Varner等[3]转染α5β1基因至HT29肠癌细胞株中，α5β1高度抑制DNA的合成和细胞的增殖，α5β1高表达的转染细胞株的增殖明显减少，这可能是和整合素α5β1经与纤连蛋白的结合而抑制了信号的传递，从而抑制肿瘤细胞的生长有关，提示α5亚基在肿瘤中起抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用。Akiyama等[4]亦证实α5亚基的抑制肿瘤的作用。
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本研究发现，整合素α5亚基蛋白在乳腺癌标本中主要定位于细胞膜，部分见于细胞浆。整合素α5亚基蛋白表达的阳性率为48.6%，α5亚基蛋白的表达和乳腺癌的组织学分级、腋淋巴结转移，远处转移，随访结果有关(P<0.05)。整合素α5亚基蛋白的表达和组织学分型、组织学分类、患者年龄、肿瘤大小、雌孕激素受体、局部复发无关。
本研究提示，整合素α5亚基蛋白的表达和乳腺癌的增殖、分化有着密切的关系，起抑制肿瘤增殖作用。淋巴结阳性乳腺癌整合素α5亚基表达率为26.3%(15/17)，而淋巴结阴性整合素α5亚基表达率为75%(36/48)，两者差别具有统计学意义(P<0.01)。由此推测整合素α5亚基起负向调节作用，抑制乳腺癌细胞的转移。本组105例病例随访9年的结果显示健在组整合素α5亚基的阳性率为56.8%(46/81)；而带癌组为14.3%(2/14)；死亡组为30%(3/10)(P<0.05)。整合素α5亚基阳性病例预后明显好于整合素α5亚基阴性组。整合素α5亚基蛋白的表达和临床的预后有关。临床上通过检测该蛋白的表达判断患者的预后，指导临床的治疗。 参考文献
, 百拇医药
1 Patriarca C, Zvaryi D, Fles D, et al. Distribution of extracellular and cytoplasmic domain of the alpha 3 and alpha 6 integrin subunits in solid tumors. Int J Cancer, 1995, 3：182-185.
2 Synythe WR, Lebel E, Bacaria, et al. Integrin expression in non-small cell carcinoma of the lung. Cancer metastasis Rev, 1995, 14：229-333.
3 Varner JH, Emerson DA, Juliano RL. Integrin alpha 5 expression negatively regulates cell growth: reversal by attachment to fibronectin. Mol Biol Cell, 1995, 6：725-729.
4 Akiyama SK, Olden K, Yamada KM. Fibronectn and integrin in invasion metastasis. Cancer metastasis Rev, 1995, 14：173-189.
(收稿：1998-01-24 修回：1998-09-29), 百拇医药