幽门螺杆菌空泡毒素基因的单链构象多态性研究
作者：彭惠 潘国宗 曹世植 方福德
单位：100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化科(彭惠、潘国宗、曹世植)中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所分子生物学国家重点实验室(方福德)
关键词：螺杆菌，幽门；细胞毒性，免疫；基因；多态现象，单链构象
中华医学杂志990306 【摘要】 目的 应用PCR/SSCP分析幽门螺杆菌(Hp)的空泡毒素基因(vacA)多态性，借此区分不同来源的Hp。方法 用vacA为模板设计的引物对159例各种胃、十二指肠疾病患者胃粘膜行PCR扩增，其产物作SSCP分析和Southern印迹杂交。对3例具不同SSCP带型的十二指肠溃疡(DU)患者的Hp进行基因序列分析。结果 vacA的两种产物vacA1和vacA2各占76.5%(114/149)和23.5%(35/149)，每个胃粘膜仅能扩增出一种产物。8种不同的SSCP带型中以B型为最多(45.7%)，DU占80%。DNA测序显示Hp的vacA信号序列有不同程度的差异。结论 不同Hp vacA基因的变异度较大，利用PCR-SSCP可将不同来源的Hp区分开，从而可用于Hp流行病学研究和治疗后的追踪观察，鉴别Hp的感染和重复感染等。
, 百拇医药
A single strand comformation polymorphism of vacuolating cytotoxin gene in H. pylori PENG Hui, PAN Guozong, CHAO Shiche, et al. Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Beijing, 100730.
【Abstract】 Objective To use PCR/SSCP analysis of the vacuolating cytotoxin gene (vacA) of H.pylori for differentiation of various strains of H. pylori.Methods PCR was performed using the primers amplifing vacA gene of the bacteria embeded in the gastric mucosa of 159 patients with various gastric duodenal diseases. The products of PCR were futher processed for SSCP analysis and southern blot hybridization. In the meantime, vacA genes of three different SSCP-patterns from three patients with duodenal ulcers were sequenced. Results The rate of detection of H.pylori with the method was 100%. vacA1 and vacA2, the two subtypes of vacA, were 76.5%(114/149) and 23.5%(35/149), respectively. Eight different SSCP-patterns were distributed in various gastroduodenal diseases, and that 80% of duodenal ulcers was predominated with B pattern. Sequencing of DNA indicated a diversity of vacA gene structure. Conclusion PCR/SSCP can be used in the differentation of different strains of H. pylori in epidemology, and in the follow up study after H.pylori eradication, especially in the differentiation between H. pylori recrudescence and reinfection.
, 百拇医药
【Key words】 Helicobactor pylori Cytotoxicity, immunologic Gene Single strand comformation polymorphism
(Natl Med J China, 1999,79:181-184)
尽管Hp的诊断方法很多，但仍有许多问题有待解决。如Hp根治性治疗后，又发现Hp感染，到底是Hp的复燃抑或Hp的再感染。为何Hp人群感染率达20%～80%[1]，但仅有少数人发病和表现严重症状，且临床症状和转归有较大的差异，是由于宿主的不同反应所致，还是由于Hp不同菌株导致不同的临床结局，或两者兼而有之。解决上述所有的问题都需要对Hp进行分型。目前，确定Hp的分型主要应用3种方法：Hp菌株或PCR产物用限制性内切酶(REA)消化[2]、限制性片段多态性分析(RFLP)[3～4]，PCR单链构象多态性分析(PCR-SSCP)[5]和随机引物扩增多态性DNA分析法(PCR-RAPD)[6]。前2种方法需要内切酶消化，成本高，操作方法要求较严格；有时酶切片段太多，不易观察和比较。PCR-RAPD法需用一组随机通用引物，较繁琐且费时，不利于临床上大规模应用。PCR-SSCP分析法，其试剂较便宜，操作方法较简单，带型较少，便于分析。王蔚红等[5]曾对用Hp特异抗原基因的PCR产物进行SSCP分析，可分辨出6组不同的单链构象，但尚未找到各型构象与胃十二指肠疾病间的潜在关系，不能将所有的Hp菌株区别开来。根据以上情况，我们采用PCR-SSCP法从分析Hp的毒力因子空泡毒素(vacA)基因多态性着手，以期区别不同来源的Hp和确定Hp菌株类型与胃十二指肠疾病类型的关系，获得了有意义的结果。
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材料和方法
一、标本
北京协和医院行胃镜检查的159例患者，Hp(+)149例，男92例，女57例，年龄为22～78岁，平均50岁。慢性胃炎(SG)30例，十二指肠溃疡(DU)30例；胃溃疡(GU)25例；复合溃疡(CU)17例；萎缩性胃炎(AG)25例；胃癌(GC)22例；Hp(-)10例，条件与阳性组基本相似。组织学银染和(或)RUT阳性即为Hp阳性。国际标准菌株11639和11637均由中国预防医学科学院流行病研究所陈晶晶研究员惠赠。
二、方法
1.基因组DNA的制备[7，8]：采用常规酚：氯仿：异戊醇提取法。
2.目的DNA片段的扩增(PCR)[7，8]： PCR反应体系终体积为50 μl，依次加入DNA模板4.0 μl，引物(5′-ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC-3′5′- CTA CTT GAA TGC GCC CAA C-3′) 0.5 μmol/L，4dNTPs各为200 μmol/L，10×PCR缓冲液5.0 μl，Taq聚合酶0.5 U，上覆100 μl矿物油。另设不含DNA模板的反应体系为阴性对照。反应条件为94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环。循环结束后72℃保温5分钟。扩增产物由质量分数为0.01～0.05的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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3.Southern 印迹杂交：采用非同位素标记探针杂交法，具体操作参照地高辛标记和探测试剂盒(Boehringer Mannheim)说明。
4.DNA-PCR单链构象多态性分析(PCR-SSCP)[5]：8 μl vacA PCR产物与8 μl变性液(质量分数为0.98的甲酰胺及0.01溴酚蓝〕在95℃变性5分钟后，迅速置于冰浴中，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(4℃，110V)3小时左右。待指示剂泳动至胶板前缘时，在质量浓度为0.001(W/V)硝酸银溶液(含质量分数为0.15的甲醛)中染色45分钟，质量浓度为0.03NaOH溶液(含质量 分数为0.15的甲醛)显色鉴定。
5.PCR产物直接测序：用电泳及低熔点胶回收纯化100 μl 3个不同的SSCP带型的DU Hp的PCR产物，用荧光自动测序仪测序。
6. 统计学处理： 采用χ2检验。
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结 果
一、胃粘膜Hp vacA基因的PCR分析
HP毒力因素vacA基因差异性较大，以它为模板设计的引物进行PCR扩增，可有效地分析该基因的多态性。采用我们设计的引物，对149例患者的分析证实有Hp感染的胃粘膜，在其结构基因区均扩增出一特异长度259 bp或286 bp的DNA片段。胃Hp的检出率达100%。vacA的两种亚型vacA1和vacA2各占76.5%(114/149)和23.5%(35/149)，每例胃粘膜仅能扩增出其中的一种片段(图1)。而10例Hp(-)胃粘膜均无此片段的扩增带。Southern印迹杂交显示PCR产物具有特异性。
M：pBR322/HinfI，1.阴性对照，2.阳性对照，3、4、5胃粘膜标本.
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图1 胃粘膜Hp vacA基因的PCR分析
二、Hp vacA基因单链构象多态性及其与胃十二指肠疾病的关系
采用PCR-SSCP分析6组不同的胃十二指肠疾病Hp vacA基因多态性表明，同一患者Hp的PCR产物vacA1和vacA2，在相同条件下不同批次的实验中呈现相同的带型，其重复性很好。2株国际标准菌株和149例Hp(+)患者出现8种不同的单链构象谱(图2)，可见于各种胃十二指肠疾病 (表1)。 由表1可知，单链构象多态性B型在各种胃十二指肠疾病中出现频率为最高(45.7%)，多见于DU (80%)和CU (70.6%)，在GU、GC、AG、SG中出现频率相对较低，分别为38.5%(10/26)、36.4%(8/22)、30.8%(8/26)和23.3%(7/30)。其他类型的单链构象(A、C-H)出现频率则在2.0%至14.4%不等。1例病人在根治性治疗失败后相隔2个月胃粘膜检出的Hp，其259 bp片段与治疗前呈现相同的单链构象；3例病人胃窦和胃体的3对Hp菌株呈相同的单链构象(图3)。以上结果提示我们所鉴定的8种类型的单链构象可用于区分不同来源的Hp。
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图2 PCR-SSCP谱型鉴定
1、2、3、4、5、6、7、8各来自于同一病人，其中1、3、5、7来源于胃窦，2、4、6、8来源于胃体，5、6是1例Hp阴性患者
图3 3例Hp感染患者的胃窦和胃体的PCR-SSCP分析
表1 8种PCR-SSCP带型在各种胃十二指肠疾病中的分布频率 组别
例数
A
B
C
D
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E
F
G
H
慢性胃炎
30
2
7
6
3
2
1
6
3
, 百拇医药
十二指肠溃疡
30
1
24
1
1
1
0
2
0
胃溃疡
25
1
10
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6
1
2
0
4
2
复合溃疡
17
1
12
1
0
0
0
, 百拇医药
2
1
萎缩性胃炎
25
2
8
5
2
2
1
5
1
胃癌
22
, 百拇医药
2
8
3
2
3
1
2
1
Hp标准菌株
2
1*
1△
合计
, 百拇医药
149
9
70
22
9
10
3
22
8
%
100.0
5.9
45.7
14.4
, 百拇医药
5.9
6.5
2.0
14.4
5.2
注：* 为Hp 11637 △ 为Hp 11639
三、不同单链构象类型Hp vacA基因序列测定
我们对3例具有不同SSCP带型的十二指肠溃疡患者Hp的vacA信号序列进行测定，显示vacA信号序列确有不同程度的变化，存在着某些点突变或核苷酸缺失(图4)，从而使Hp vacA信号序列呈现出较大的变异性和多样性。
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* 碱基缺失
图4 3例十二指肠溃疡患者Hp vacA基因的信号序列的比较
讨 论
vacA是Hp的主要致病因子之一，它存在于所有的Hp菌株中，但只有部分Hp表达vacA蛋白。项兆英等将是否表达vacA、CagA蛋白的Hp分为TypeⅠ和TypeⅡ，前者是两种蛋白均表达，称为高毒力菌株；后者为两种蛋白均不表达，称为低毒力菌株。本研究首次采用以此毒力因子基因为模板设计的引物直接对胃内Hp进行检测，特异性高，灵敏性好。本研究PCR法所得两种片段是以vacA基因的特殊部位为模板设计的引物扩增的结果。其中259 bp片段源于可表达VacA蛋白的60190菌株的信号序列；286 bp片段则源于不表达VacA蛋白的Tx30a菌株的信号序列[7，9]。通过简单的PCR法可将Hp初步分为两种类型，以便鉴别不同来源的Hp，不失为一种在分子水平的方便实用的Hp诊断法。文献报道，不同Hp菌株DNA分子具有多态性[2-5]。本研究所得PCR产物小于300 bp，运用SSCP法鉴别Hp vacA信号序列的差异性，有可能检出这一多态性，从而区分不同来源的Hp菌株。
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本结果显示，有8种不同的单链构象类型可见于各种胃十二指肠疾病；3例不同SSCP带型的DU ，其Hp vacA基因序列均有差异，提示该基因具有多样性和变异性[9，10]，这为区分不同来源的Hp提供了理论依据和实际指导。1例Hp根治性治疗失败后，其治疗前后具有相同的单链构象类型，提示此患者可能为Hp的复燃。 荷兰学者[11]用随机引物多态性扩增DNA法(RAPD)分析了一个有消化性溃疡病史家庭的8个成员，发现有1个成员同时感染了多株Hp菌株。本文对3例病人胃的不同部位的3对Hp行PCR/SSCP分析均呈相同的单链构象带型，未发现国外文献报道的混合感染现象[11]。其原因可能有(1)此分型法尚不足以将所有Hp的差异性区别开来；(2)未收集到多株Hp菌株同时感染的病例标本。但本方法不失为一种鉴别不同来源Hp和区分Hp复燃抑或复发的简便、实用的方法。
我们鉴定的8种不同单链构象类型中以B型为最多(占45.7%)，在DU和CU组中各占80%和70.6%，显著高于其它疾病组。B型单链构象在DU和CU的出现频率高，提示某类型的Hp与某一临床疾病可能有关。尽管尚未找到与某一疾病绝对相关的Hp菌株，但本研究至少为有效区分不同来源的Hp提供了新的思路和有效途径，并有可能用于Hp流行病学调查和Hp治疗后的疗效评价。
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参考文献
1 Taylar DN, Blazer MJ. The epidemiology of helicobactor pylori infection. Epidemiol Rev. 1991, 34:42-59.
2 Langenberg W, Rarws EA, Widjojokusumo A, et al. Identification of campylobacter pyloridis isolates by restriction endonulease DNA analysis. J Clin Microbiol 1986; 24: 414-417.
3 Akopyanz N, Bukanov NO, Westblom TU, et al. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen helicobacter pylori. Nucleic Acids Res. 1992; 20:6221-6225.
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4 Fujimoto SB, Marshall B, Blazer MJ. PCR-based restriction fragment length polymorphism typing of Helicobacter pylori. J Clin Microbiol，1994; 32: 331-334.
5 王蔚红，胡伏莲，贾博琦，等.用PCR-SSCP分析区分不同来源的幽门螺杆菌.中华消化杂志.1995; 15: 9-11.
6 Berg DE, Akopyants NO, Kersulyte D. Fingerprinting microbial genomes using the RAPD or AP-PCR method. methods mol. Cell Biol 1994, 5:13-24.
7 Shortridge VD, Stone GG, Flamm RK, et al. Molecular typing of helicobacter pylori isolates from a multicenter U.S. clinical trial by ureC restriction fragment length poly morphism. J Clin Microbiol, 1997, 35:471-473.
, 百拇医药
8 Cover Tl, Tummuru MKR, Cao P, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among helicobacter pylori strains. J Biol Chem 1994, 269:10566-10573.
9 Atherton JC, Coa P, Peek RM, et al. Mosaicism in vacuolation cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. J Biol Chem 1995, 270: 17771-17777.
10 Weiss J, Elvira JM, Sliva DA, et al. Comparison of PCR and other diagnostic techniques for detection of Helicobacter pylori in dyspeptic patients. J Clin Microbiol, 1994, 32:1663-1668.
11 Ende AVD, Rauwa EAJ, Feller M, et al. Heterogeneous Helicobacter pylori isolates from members of a family with a history of peptic ulcer disease. Gastroenterology, 1996, 11: 638-647.
(收稿：1998-04-16 修回：1998-11-30), 百拇医药
单位：100730 北京，中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院消化科(彭惠、潘国宗、曹世植)中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所分子生物学国家重点实验室(方福德)
关键词：螺杆菌，幽门；细胞毒性，免疫；基因；多态现象，单链构象
中华医学杂志990306 【摘要】 目的 应用PCR/SSCP分析幽门螺杆菌(Hp)的空泡毒素基因(vacA)多态性，借此区分不同来源的Hp。方法 用vacA为模板设计的引物对159例各种胃、十二指肠疾病患者胃粘膜行PCR扩增，其产物作SSCP分析和Southern印迹杂交。对3例具不同SSCP带型的十二指肠溃疡(DU)患者的Hp进行基因序列分析。结果 vacA的两种产物vacA1和vacA2各占76.5%(114/149)和23.5%(35/149)，每个胃粘膜仅能扩增出一种产物。8种不同的SSCP带型中以B型为最多(45.7%)，DU占80%。DNA测序显示Hp的vacA信号序列有不同程度的差异。结论 不同Hp vacA基因的变异度较大，利用PCR-SSCP可将不同来源的Hp区分开，从而可用于Hp流行病学研究和治疗后的追踪观察，鉴别Hp的感染和重复感染等。
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A single strand comformation polymorphism of vacuolating cytotoxin gene in H. pylori PENG Hui, PAN Guozong, CHAO Shiche, et al. Department of Gastroenterology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Beijing, 100730.
【Abstract】 Objective To use PCR/SSCP analysis of the vacuolating cytotoxin gene (vacA) of H.pylori for differentiation of various strains of H. pylori.Methods PCR was performed using the primers amplifing vacA gene of the bacteria embeded in the gastric mucosa of 159 patients with various gastric duodenal diseases. The products of PCR were futher processed for SSCP analysis and southern blot hybridization. In the meantime, vacA genes of three different SSCP-patterns from three patients with duodenal ulcers were sequenced. Results The rate of detection of H.pylori with the method was 100%. vacA1 and vacA2, the two subtypes of vacA, were 76.5%(114/149) and 23.5%(35/149), respectively. Eight different SSCP-patterns were distributed in various gastroduodenal diseases, and that 80% of duodenal ulcers was predominated with B pattern. Sequencing of DNA indicated a diversity of vacA gene structure. Conclusion PCR/SSCP can be used in the differentation of different strains of H. pylori in epidemology, and in the follow up study after H.pylori eradication, especially in the differentiation between H. pylori recrudescence and reinfection.
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【Key words】 Helicobactor pylori Cytotoxicity, immunologic Gene Single strand comformation polymorphism
(Natl Med J China, 1999,79:181-184)
尽管Hp的诊断方法很多，但仍有许多问题有待解决。如Hp根治性治疗后，又发现Hp感染，到底是Hp的复燃抑或Hp的再感染。为何Hp人群感染率达20%～80%[1]，但仅有少数人发病和表现严重症状，且临床症状和转归有较大的差异，是由于宿主的不同反应所致，还是由于Hp不同菌株导致不同的临床结局，或两者兼而有之。解决上述所有的问题都需要对Hp进行分型。目前，确定Hp的分型主要应用3种方法：Hp菌株或PCR产物用限制性内切酶(REA)消化[2]、限制性片段多态性分析(RFLP)[3～4]，PCR单链构象多态性分析(PCR-SSCP)[5]和随机引物扩增多态性DNA分析法(PCR-RAPD)[6]。前2种方法需要内切酶消化，成本高，操作方法要求较严格；有时酶切片段太多，不易观察和比较。PCR-RAPD法需用一组随机通用引物，较繁琐且费时，不利于临床上大规模应用。PCR-SSCP分析法，其试剂较便宜，操作方法较简单，带型较少，便于分析。王蔚红等[5]曾对用Hp特异抗原基因的PCR产物进行SSCP分析，可分辨出6组不同的单链构象，但尚未找到各型构象与胃十二指肠疾病间的潜在关系，不能将所有的Hp菌株区别开来。根据以上情况，我们采用PCR-SSCP法从分析Hp的毒力因子空泡毒素(vacA)基因多态性着手，以期区别不同来源的Hp和确定Hp菌株类型与胃十二指肠疾病类型的关系，获得了有意义的结果。
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材料和方法
一、标本
北京协和医院行胃镜检查的159例患者，Hp(+)149例，男92例，女57例，年龄为22～78岁，平均50岁。慢性胃炎(SG)30例，十二指肠溃疡(DU)30例；胃溃疡(GU)25例；复合溃疡(CU)17例；萎缩性胃炎(AG)25例；胃癌(GC)22例；Hp(-)10例，条件与阳性组基本相似。组织学银染和(或)RUT阳性即为Hp阳性。国际标准菌株11639和11637均由中国预防医学科学院流行病研究所陈晶晶研究员惠赠。
二、方法
1.基因组DNA的制备[7，8]：采用常规酚：氯仿：异戊醇提取法。
2.目的DNA片段的扩增(PCR)[7，8]： PCR反应体系终体积为50 μl，依次加入DNA模板4.0 μl，引物(5′-ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC-3′5′- CTA CTT GAA TGC GCC CAA C-3′) 0.5 μmol/L，4dNTPs各为200 μmol/L，10×PCR缓冲液5.0 μl，Taq聚合酶0.5 U，上覆100 μl矿物油。另设不含DNA模板的反应体系为阴性对照。反应条件为94℃变性1分钟，59℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环。循环结束后72℃保温5分钟。扩增产物由质量分数为0.01～0.05的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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3.Southern 印迹杂交：采用非同位素标记探针杂交法，具体操作参照地高辛标记和探测试剂盒(Boehringer Mannheim)说明。
4.DNA-PCR单链构象多态性分析(PCR-SSCP)[5]：8 μl vacA PCR产物与8 μl变性液(质量分数为0.98的甲酰胺及0.01溴酚蓝〕在95℃变性5分钟后，迅速置于冰浴中，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(4℃，110V)3小时左右。待指示剂泳动至胶板前缘时，在质量浓度为0.001(W/V)硝酸银溶液(含质量分数为0.15的甲醛)中染色45分钟，质量浓度为0.03NaOH溶液(含质量 分数为0.15的甲醛)显色鉴定。
5.PCR产物直接测序：用电泳及低熔点胶回收纯化100 μl 3个不同的SSCP带型的DU Hp的PCR产物，用荧光自动测序仪测序。
6. 统计学处理： 采用χ2检验。
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结 果
一、胃粘膜Hp vacA基因的PCR分析
HP毒力因素vacA基因差异性较大，以它为模板设计的引物进行PCR扩增，可有效地分析该基因的多态性。采用我们设计的引物，对149例患者的分析证实有Hp感染的胃粘膜，在其结构基因区均扩增出一特异长度259 bp或286 bp的DNA片段。胃Hp的检出率达100%。vacA的两种亚型vacA1和vacA2各占76.5%(114/149)和23.5%(35/149)，每例胃粘膜仅能扩增出其中的一种片段(图1)。而10例Hp(-)胃粘膜均无此片段的扩增带。Southern印迹杂交显示PCR产物具有特异性。
M：pBR322/HinfI，1.阴性对照，2.阳性对照，3、4、5胃粘膜标本.
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图1 胃粘膜Hp vacA基因的PCR分析
二、Hp vacA基因单链构象多态性及其与胃十二指肠疾病的关系
采用PCR-SSCP分析6组不同的胃十二指肠疾病Hp vacA基因多态性表明，同一患者Hp的PCR产物vacA1和vacA2，在相同条件下不同批次的实验中呈现相同的带型，其重复性很好。2株国际标准菌株和149例Hp(+)患者出现8种不同的单链构象谱(图2)，可见于各种胃十二指肠疾病 (表1)。 由表1可知，单链构象多态性B型在各种胃十二指肠疾病中出现频率为最高(45.7%)，多见于DU (80%)和CU (70.6%)，在GU、GC、AG、SG中出现频率相对较低，分别为38.5%(10/26)、36.4%(8/22)、30.8%(8/26)和23.3%(7/30)。其他类型的单链构象(A、C-H)出现频率则在2.0%至14.4%不等。1例病人在根治性治疗失败后相隔2个月胃粘膜检出的Hp，其259 bp片段与治疗前呈现相同的单链构象；3例病人胃窦和胃体的3对Hp菌株呈相同的单链构象(图3)。以上结果提示我们所鉴定的8种类型的单链构象可用于区分不同来源的Hp。
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图2 PCR-SSCP谱型鉴定
1、2、3、4、5、6、7、8各来自于同一病人，其中1、3、5、7来源于胃窦，2、4、6、8来源于胃体，5、6是1例Hp阴性患者
图3 3例Hp感染患者的胃窦和胃体的PCR-SSCP分析
表1 8种PCR-SSCP带型在各种胃十二指肠疾病中的分布频率 组别
例数
A
B
C
D
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E
F
G
H
慢性胃炎
30
2
7
6
3
2
1
6
3
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十二指肠溃疡
30
1
24
1
1
1
0
2
0
胃溃疡
25
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10
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6
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4
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复合溃疡
17
1
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2
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萎缩性胃炎
25
2
8
5
2
2
1
5
1
胃癌
22
, 百拇医药
2
8
3
2
3
1
2
1
Hp标准菌株
2
1*
1△
合计
, 百拇医药
149
9
70
22
9
10
3
22
8
%
100.0
5.9
45.7
14.4
, 百拇医药
5.9
6.5
2.0
14.4
5.2
注：* 为Hp 11637 △ 为Hp 11639
三、不同单链构象类型Hp vacA基因序列测定
我们对3例具有不同SSCP带型的十二指肠溃疡患者Hp的vacA信号序列进行测定，显示vacA信号序列确有不同程度的变化，存在着某些点突变或核苷酸缺失(图4)，从而使Hp vacA信号序列呈现出较大的变异性和多样性。
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* 碱基缺失
图4 3例十二指肠溃疡患者Hp vacA基因的信号序列的比较
讨 论
vacA是Hp的主要致病因子之一，它存在于所有的Hp菌株中，但只有部分Hp表达vacA蛋白。项兆英等将是否表达vacA、CagA蛋白的Hp分为TypeⅠ和TypeⅡ，前者是两种蛋白均表达，称为高毒力菌株；后者为两种蛋白均不表达，称为低毒力菌株。本研究首次采用以此毒力因子基因为模板设计的引物直接对胃内Hp进行检测，特异性高，灵敏性好。本研究PCR法所得两种片段是以vacA基因的特殊部位为模板设计的引物扩增的结果。其中259 bp片段源于可表达VacA蛋白的60190菌株的信号序列；286 bp片段则源于不表达VacA蛋白的Tx30a菌株的信号序列[7，9]。通过简单的PCR法可将Hp初步分为两种类型，以便鉴别不同来源的Hp，不失为一种在分子水平的方便实用的Hp诊断法。文献报道，不同Hp菌株DNA分子具有多态性[2-5]。本研究所得PCR产物小于300 bp，运用SSCP法鉴别Hp vacA信号序列的差异性，有可能检出这一多态性，从而区分不同来源的Hp菌株。
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本结果显示，有8种不同的单链构象类型可见于各种胃十二指肠疾病；3例不同SSCP带型的DU ，其Hp vacA基因序列均有差异，提示该基因具有多样性和变异性[9，10]，这为区分不同来源的Hp提供了理论依据和实际指导。1例Hp根治性治疗失败后，其治疗前后具有相同的单链构象类型，提示此患者可能为Hp的复燃。 荷兰学者[11]用随机引物多态性扩增DNA法(RAPD)分析了一个有消化性溃疡病史家庭的8个成员，发现有1个成员同时感染了多株Hp菌株。本文对3例病人胃的不同部位的3对Hp行PCR/SSCP分析均呈相同的单链构象带型，未发现国外文献报道的混合感染现象[11]。其原因可能有(1)此分型法尚不足以将所有Hp的差异性区别开来；(2)未收集到多株Hp菌株同时感染的病例标本。但本方法不失为一种鉴别不同来源Hp和区分Hp复燃抑或复发的简便、实用的方法。
我们鉴定的8种不同单链构象类型中以B型为最多(占45.7%)，在DU和CU组中各占80%和70.6%，显著高于其它疾病组。B型单链构象在DU和CU的出现频率高，提示某类型的Hp与某一临床疾病可能有关。尽管尚未找到与某一疾病绝对相关的Hp菌株，但本研究至少为有效区分不同来源的Hp提供了新的思路和有效途径，并有可能用于Hp流行病学调查和Hp治疗后的疗效评价。
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(收稿：1998-04-16 修回：1998-11-30), 百拇医药