三种幽门螺杆菌致病作用的实验研究
作者：宫桂花 藤冈利生 西园晃 俊藤孝之 木本真美 邵勇
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院南楼消化科(宫桂花、邵勇)；日本大分医科大学第二内科(藤冈利生、西园晃、俊藤孝之、木本真美)
关键词：螺杆菌，幽门；胃粘膜
中华医学杂志990323 【摘要】 目的 为观察3种幽门螺杆菌菌株在小鼠胃内集落形成能力及感染后对小鼠胃粘膜组织学影响。方法 C57BL/C小鼠40只，分野生型株、突变株、悉尼株及对照组4组，每组10只鼠。野生型CPY3401株[表达细胞相关基因(Cytptoxin-associated gene A, CagA)菌株(CagA+)]与野生型CPY3401株同源并去掉CagA的突变株(CagA)及悉尼株(CagA+)，分别以0.5 ml[109菌落形成单位/毫升(CFU/ml)]菌悬液通过胃管注入鼠胃内。用ELISA法检测感染前后血清IgG抗体水平，8周后处死小鼠,留取胃标本行组织病理检查。结果 (1) 悉尼株和野生型株在鼠胃粘膜集落形成良好,突变株较差；(2) 感染野生型株和悉尼株鼠胃粘膜固有层可见中到重度炎细胞浸润；(3) 血清IgG抗体在感染后2周开始升高,5周达到高峰, 悉尼株组、野生型株组与对照组比较差异有非常显著意义(P<0.01)。结论 CagA+的悉尼株和野生型株在C57BL/C小鼠胃内集落形成良好,并引起明显的炎细胞浸润及产生高水平血清IgG抗体。C57BL/C小鼠模型可用于幽门螺杆菌感染及相关疾病的研究。
, 百拇医药
Pathogenicity in mice infected with three different strains H.pylori GONG guihua*, Toshio Fuijioka, Akira Nishiaono, et al. * Department of Nanlou Gastroenterlology, General Hospital of PLA, Beijing 100853.
【Abstract】 Objective To observe the differences of colonization and histopathology between CagA+ strains and lacking CagA by three different strains infecting C57BL/C mice. Methods CPY3401 wild type strain (CagA+), CPY3401(the isogenic CagA) knockout mutant CagA-, Sydney strain (CagA+) were used. The mice were administered orally with 0.5 ml, 109 CFU/ml of the above bacterial suspensions, respectively. Serum IgG antibodies were measured by ELISA. All the mice were sacrificed at 8 weeks after inoculation and their stomaches were removed for histopathologic study. Results The colonization of the bacteria was evident in Sydney strain and mild type strain, but characterized by wild to moderate infiltration by nutrophils and momocytes histologically. Only a small number of organisms were observed in the CagAstrains group. The levels of serum IgG antibodies were the highest in Sydney and wild strains group as compared with the control group (P<0.01). There was no significant difference between the CagA-group and the control group. Conclusion A strong correlation was observed between CagA+, bacterial colonization, gastric mucosa inflammation, and serum IgG antibodies. The study of C57BL/C mice helps understand the pathogenicity with CagA+ strains in human body and study H. pylori infection and associated diseases.
, http://www.100md.com
【Key words】 Helicobacter pylori Gastric mucosa
(Natl Med J China, 1999, 79：211-213)
幽门螺杆菌(Hp)感染在胃、十二指肠疾病中占有重要地位。近年来Hp感染动物模型的建立,对研究Hp相关疾病的发病机理、不同菌株对胃粘膜毒性作用及疾病演变过程具有十分重要的临床意义。我们用从人胃分离的3种Hp菌株感染C57BL/C小鼠,观察与疾病相关的变化，预测不同菌株感染导致不同的临床结局,为下一步疾病模型研究打下基础。
材料与方法
1.菌株：从人胃粘膜分离的3种Hp菌株为野生型CPY3401[表达细胞相关基因(CagA)菌株(CagA+)]、与野生型CPY3401同源并去掉CagA的突变株(CagA，美国范德比尔特大学医学院赠)、悉尼株(CagA+，澳大利亚悉尼新南威尔士大学微生物实验室赠)。3种菌株纯化鉴定均以含有完整CagA基因质粒(PEM3)转化到DH5大肠杆菌体内、扩增。提取质粒通过电泳方法鉴定CagA+片段，再行Southern杂交完成鉴定[1，2]。菌株于-80 ℃冰箱保存,使用前室温解冻，涂于质量分数为8%马血布氏琼脂培养基上,置厌氧罐以容积分数为85% CO2：10% N2：5% O2的环境中37 ℃孵育4天。收集菌落后再以同样环境摇动液体培养24小时,分光光度计(UV-120-01,日本产)将细菌浓度调至109菌落形成单位(CFU/ml)。
, 百拇医药
2.鼠的感染:6周雌性C57BL/C小鼠40只，体重28～32 g，由日本大分医科大学动物中心提供。随机分为4组,每组10只,感染前禁食过夜,5天中3种菌株各分3次以0.5 ml，(109CFU/ml)细菌悬液通过无菌可弯曲胃管导入鼠胃。对照组则用0.5 ml布氏培养液同法导入鼠胃,于感染后3小时允许鼠自由取食水。
3.ELISA法检测血清IgG抗体浓度：感染前及感染后1、2、3、4、5和8 周分别留取鼠尾血,对照组同步取血，3 000 r/min分离血清置-30 ℃保存待检。将ATCC 43504 Hp超声破碎液(1 μg/孔)包被聚苯乙烯反应板微孔，4℃过夜，洗后加入1∶100鼠血清，37 ℃ 1小时,洗后加入1∶2 000 HRP-抗鼠IgG，37 ℃1小时,洗后加底物溶液，室温呈色20分钟，用2 mol/L H2SO4终止反应，测410 nm吸光度(A)值。阳性对照血清用感染的蒙古沙鼠梯度稀释血清作为标准曲线，同上法操作。阴性对照用未感染鼠血清。各组鼠IgG抗体浓度以吸光度(A)值的
±s表示。
, 百拇医药
4.集落形成和组织病理学评价：感染后8周处死全部鼠，切下鼠胃，一半固定于质量浓度为10%中性甲醛液中，24小时后依次脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(4 μm厚)，脱蜡后行HE和Giemsa染色。光镜下观察细菌菌落形成及炎细胞浸润程度。菌落形成程度按标准[1]，组织病理学改变按悉尼分类法评价[3]。
5.胃活组织标本培养：将胃组织匀浆后以1、10、100倍浓度分别用BHM[4]和方法1培养，菌落数以CFU/mg表示。收集具有Hp特征形态的菌落，革兰染色，光镜下鉴定细菌。
6.统计方法：两组间数据比较采用样本均数比较的t检验。
结 果
1.细菌集落在鼠胃内的分布：感染后8周胃组织切片见细菌生长于胃腺隐窝内, 以胃窦和胃体的细菌数量为多。悉尼株组集落形成水平高,10只鼠胃均见1～2级集落形成(图1)。野生型株组6只为1级,2只为2级。突变株组10只中仅3只胃窦见少数细菌。对照组未见细菌。
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图1 感染悉尼株Hp胃窦粘膜，见炎细胞浸润 HE×200
2.组织病理学所见:胃粘膜炎细胞浸润程度与细菌集落化水平呈正比，悉尼株组胃粘膜固有层中见中至重度中性白细胞和单核细胞浸润(图2)，未见糜烂及溃疡形成, 仅见局灶性点状出血。野生型组为轻度炎细胞浸润,突变株与对照组均未见明显炎细胞浸润。
图2 悉尼株Hp在胃腺隐窝内生长(Giemsa×1 000)
3.胃组织细菌培养：3组菌株均获得阳性培养结果，其菌落形成单位分别为悉尼株3.1×10～5.3×10 CFU/mg，野生型株为3.1×10 CFU/mg，突变株仅为1.9CFU/mg。
4.血清IgG抗体水平：血清IgG抗体于感染后2周开始升高，4～5周达高峰，5周后开始下降。血清IgG抗体水平2周、5周分别为悉尼株14±4和50±8，野生型株11±3和33±11，与对照组比较，上述两组的t值分别为7.41、17.4(P<0.01)和5.4、7.9(P<0.01)。差异均有非常显著性意义。突变株组与对照组无明显差异。各组血清IgG抗体水平见图3。
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图3 感染组与对照组血清IgG抗体水平
讨 论
Hp在慢性胃炎、溃疡病的发病过程中起重要作用。Hp感染实验动物模型的发展对认识不同菌株特性及致病机理具有十分重要的临床意义。
Hp可引起人胃粘膜持续性感染和炎症，大多数感染者有较好的耐受性，几十年中可有一些或无任何症状，仅一部分感染者发展为疾病。那么，在感染结局方面存在差异的关键是什么？目前从人胃活检标本分离的Hp菌株有多样性基因表型[5]，至少被分为两型。Ⅰ型为有细胞毒相关基因A(cytotoxin-associatedgene A，cagA)，表达CagA蛋白及空泡化细胞毒VacA(vacuolating cytotoxin A)。Ⅱ型无CagA，既不表达CagA蛋白也不表达VacA。Ⅰ型菌株在感染人群中约占60%，Ⅱ型约占16%,其余属中间型。尽管它们的功能尚不十分清楚，CagA和VacA是目前公认的致病因子之一，可引起较明显的胃、十二指肠粘膜病理变化。
, 百拇医药
Hp具有集落于胃粘膜并持续定位于此的许多特性。它凭借特有的尿素酶活性及产物和特殊的附着力等,穿过酸性屏障到达胃粘膜上皮并长期生存。本实验结果证明，具有CagA+特性的悉尼株和野生型株在C57BL/C鼠胃内集落形成能力强, 与文献报道一致[1]。CagA-的突变株集落形成能力差。细菌在胃粘膜集落形成后的炎性反应与集落形成程度相一致。
我们观察到悉尼株组炎细胞浸润较明显，由于感染时间短, 本实验中未见粘膜糜烂及溃疡形成。实验研究还证实[6]，CagA+菌株可使试管中胃上皮细胞产生较高水平的白细胞介素8，这一观点可解释活体中所见的炎细胞浸润现象。因此，在无条件检测CagA+菌株的情况下，可依据胃粘膜组织学炎症程度选择根除对象是可取的。
血清IgG抗体是检测Hp感染的特异抗体，特别对CagA+菌株更敏感[2]。本实验结果亦证实这一观点。血清IgG抗体与集落形成水平密切相关。悉尼株和野生型株因其在胃内集落形成能力强，均产生了高水平的血清IgG抗体，而突变株在胃内集落形成能力差，未见明显的血清IgG抗体升高现象。
, 百拇医药
本实验结果初步证实，CagA+的Hp菌株在C57BL/C 小鼠胃内集落形成良好，并引起较明显的胃粘膜炎症反应及血清IgG抗体水平升高,说明CagA+菌株感染在致病过程中起重要作用,其实验过程易于掌握，且价廉，有广泛的实用价值。Hp致病过程是复杂的，不仅由于CagA、VacA的作用，还有一系列毒性因子的协同参与, 在感染模型基础上进一步建立疾病模型，长期跟踪疾病的发展以及治疗反应，具有实际的临床意义。
本实验在日本大分医科大学第二内科完成 参考文献
1 Lee A, O′rourke J, Ungria MCD, et al. A standardized mouse model of helicobactor pylori infection: introducing the sydney strain. Gastroenterology, 1997, 112：1386-1397.
, 百拇医药
2 Cover TL. Glupezynski Y, Lage AP, et al. Serologic detection of infection with CagA+ heoicobacter pylori strains. J Clin Microbil, 1995, 33：1496-1500.
3 Dixon MF, Path FRC, Genta RM, et al. Classification and grading of gastritis the npdated sydney system. Am Surgical Pathol, 1996, 20：1161-1181.
4 Queiroz DMM, Mendes EN, Rocha GA. Indicator mediun for isolation of campylobacter pylori. J Clin Microbiol, 1987, 25：2378-2379.
, http://www.100md.com
5 Xiang Z, Gensini S, Bayeli PT, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of helicobacter pylori reveals that CagA is not nesessary for expression of the vaculating cytotoxin. Infect Immun, 1995, 63：94-98.
6 Crabtree JE, Farmety SM, Lindley IJD, et al. CagA/cytotoxic strains of helicobacter pylori and interlealcin-8 in gastric epithelial cells. J Clin pathol, 1994, 47：945-950.
(收稿：1998-03-16 修回：1998-12-09), 百拇医药
单位：100853 北京，中国人民解放军总医院南楼消化科(宫桂花、邵勇)；日本大分医科大学第二内科(藤冈利生、西园晃、俊藤孝之、木本真美)
关键词：螺杆菌，幽门；胃粘膜
中华医学杂志990323 【摘要】 目的 为观察3种幽门螺杆菌菌株在小鼠胃内集落形成能力及感染后对小鼠胃粘膜组织学影响。方法 C57BL/C小鼠40只，分野生型株、突变株、悉尼株及对照组4组，每组10只鼠。野生型CPY3401株[表达细胞相关基因(Cytptoxin-associated gene A, CagA)菌株(CagA+)]与野生型CPY3401株同源并去掉CagA的突变株(CagA)及悉尼株(CagA+)，分别以0.5 ml[109菌落形成单位/毫升(CFU/ml)]菌悬液通过胃管注入鼠胃内。用ELISA法检测感染前后血清IgG抗体水平，8周后处死小鼠,留取胃标本行组织病理检查。结果 (1) 悉尼株和野生型株在鼠胃粘膜集落形成良好,突变株较差；(2) 感染野生型株和悉尼株鼠胃粘膜固有层可见中到重度炎细胞浸润；(3) 血清IgG抗体在感染后2周开始升高,5周达到高峰, 悉尼株组、野生型株组与对照组比较差异有非常显著意义(P<0.01)。结论 CagA+的悉尼株和野生型株在C57BL/C小鼠胃内集落形成良好,并引起明显的炎细胞浸润及产生高水平血清IgG抗体。C57BL/C小鼠模型可用于幽门螺杆菌感染及相关疾病的研究。
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Pathogenicity in mice infected with three different strains H.pylori GONG guihua*, Toshio Fuijioka, Akira Nishiaono, et al. * Department of Nanlou Gastroenterlology, General Hospital of PLA, Beijing 100853.
【Abstract】 Objective To observe the differences of colonization and histopathology between CagA+ strains and lacking CagA by three different strains infecting C57BL/C mice. Methods CPY3401 wild type strain (CagA+), CPY3401(the isogenic CagA) knockout mutant CagA-, Sydney strain (CagA+) were used. The mice were administered orally with 0.5 ml, 109 CFU/ml of the above bacterial suspensions, respectively. Serum IgG antibodies were measured by ELISA. All the mice were sacrificed at 8 weeks after inoculation and their stomaches were removed for histopathologic study. Results The colonization of the bacteria was evident in Sydney strain and mild type strain, but characterized by wild to moderate infiltration by nutrophils and momocytes histologically. Only a small number of organisms were observed in the CagAstrains group. The levels of serum IgG antibodies were the highest in Sydney and wild strains group as compared with the control group (P<0.01). There was no significant difference between the CagA-group and the control group. Conclusion A strong correlation was observed between CagA+, bacterial colonization, gastric mucosa inflammation, and serum IgG antibodies. The study of C57BL/C mice helps understand the pathogenicity with CagA+ strains in human body and study H. pylori infection and associated diseases.
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【Key words】 Helicobacter pylori Gastric mucosa
(Natl Med J China, 1999, 79：211-213)
幽门螺杆菌(Hp)感染在胃、十二指肠疾病中占有重要地位。近年来Hp感染动物模型的建立,对研究Hp相关疾病的发病机理、不同菌株对胃粘膜毒性作用及疾病演变过程具有十分重要的临床意义。我们用从人胃分离的3种Hp菌株感染C57BL/C小鼠,观察与疾病相关的变化，预测不同菌株感染导致不同的临床结局,为下一步疾病模型研究打下基础。
材料与方法
1.菌株：从人胃粘膜分离的3种Hp菌株为野生型CPY3401[表达细胞相关基因(CagA)菌株(CagA+)]、与野生型CPY3401同源并去掉CagA的突变株(CagA，美国范德比尔特大学医学院赠)、悉尼株(CagA+，澳大利亚悉尼新南威尔士大学微生物实验室赠)。3种菌株纯化鉴定均以含有完整CagA基因质粒(PEM3)转化到DH5大肠杆菌体内、扩增。提取质粒通过电泳方法鉴定CagA+片段，再行Southern杂交完成鉴定[1，2]。菌株于-80 ℃冰箱保存,使用前室温解冻，涂于质量分数为8%马血布氏琼脂培养基上,置厌氧罐以容积分数为85% CO2：10% N2：5% O2的环境中37 ℃孵育4天。收集菌落后再以同样环境摇动液体培养24小时,分光光度计(UV-120-01,日本产)将细菌浓度调至109菌落形成单位(CFU/ml)。
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2.鼠的感染:6周雌性C57BL/C小鼠40只，体重28～32 g，由日本大分医科大学动物中心提供。随机分为4组,每组10只,感染前禁食过夜,5天中3种菌株各分3次以0.5 ml，(109CFU/ml)细菌悬液通过无菌可弯曲胃管导入鼠胃。对照组则用0.5 ml布氏培养液同法导入鼠胃,于感染后3小时允许鼠自由取食水。
3.ELISA法检测血清IgG抗体浓度：感染前及感染后1、2、3、4、5和8 周分别留取鼠尾血,对照组同步取血，3 000 r/min分离血清置-30 ℃保存待检。将ATCC 43504 Hp超声破碎液(1 μg/孔)包被聚苯乙烯反应板微孔，4℃过夜，洗后加入1∶100鼠血清，37 ℃ 1小时,洗后加入1∶2 000 HRP-抗鼠IgG，37 ℃1小时,洗后加底物溶液，室温呈色20分钟，用2 mol/L H2SO4终止反应，测410 nm吸光度(A)值。阳性对照血清用感染的蒙古沙鼠梯度稀释血清作为标准曲线，同上法操作。阴性对照用未感染鼠血清。各组鼠IgG抗体浓度以吸光度(A)值的
±s表示。, 百拇医药
4.集落形成和组织病理学评价：感染后8周处死全部鼠，切下鼠胃，一半固定于质量浓度为10%中性甲醛液中，24小时后依次脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(4 μm厚)，脱蜡后行HE和Giemsa染色。光镜下观察细菌菌落形成及炎细胞浸润程度。菌落形成程度按标准[1]，组织病理学改变按悉尼分类法评价[3]。
5.胃活组织标本培养：将胃组织匀浆后以1、10、100倍浓度分别用BHM[4]和方法1培养，菌落数以CFU/mg表示。收集具有Hp特征形态的菌落，革兰染色，光镜下鉴定细菌。
6.统计方法：两组间数据比较采用样本均数比较的t检验。
结 果
1.细菌集落在鼠胃内的分布：感染后8周胃组织切片见细菌生长于胃腺隐窝内, 以胃窦和胃体的细菌数量为多。悉尼株组集落形成水平高,10只鼠胃均见1～2级集落形成(图1)。野生型株组6只为1级,2只为2级。突变株组10只中仅3只胃窦见少数细菌。对照组未见细菌。
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图1 感染悉尼株Hp胃窦粘膜，见炎细胞浸润 HE×200
2.组织病理学所见:胃粘膜炎细胞浸润程度与细菌集落化水平呈正比，悉尼株组胃粘膜固有层中见中至重度中性白细胞和单核细胞浸润(图2)，未见糜烂及溃疡形成, 仅见局灶性点状出血。野生型组为轻度炎细胞浸润,突变株与对照组均未见明显炎细胞浸润。
图2 悉尼株Hp在胃腺隐窝内生长(Giemsa×1 000)
3.胃组织细菌培养：3组菌株均获得阳性培养结果，其菌落形成单位分别为悉尼株3.1×10～5.3×10 CFU/mg，野生型株为3.1×10 CFU/mg，突变株仅为1.9CFU/mg。
4.血清IgG抗体水平：血清IgG抗体于感染后2周开始升高，4～5周达高峰，5周后开始下降。血清IgG抗体水平2周、5周分别为悉尼株14±4和50±8，野生型株11±3和33±11，与对照组比较，上述两组的t值分别为7.41、17.4(P<0.01)和5.4、7.9(P<0.01)。差异均有非常显著性意义。突变株组与对照组无明显差异。各组血清IgG抗体水平见图3。
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图3 感染组与对照组血清IgG抗体水平
讨 论
Hp在慢性胃炎、溃疡病的发病过程中起重要作用。Hp感染实验动物模型的发展对认识不同菌株特性及致病机理具有十分重要的临床意义。
Hp可引起人胃粘膜持续性感染和炎症，大多数感染者有较好的耐受性，几十年中可有一些或无任何症状，仅一部分感染者发展为疾病。那么，在感染结局方面存在差异的关键是什么？目前从人胃活检标本分离的Hp菌株有多样性基因表型[5]，至少被分为两型。Ⅰ型为有细胞毒相关基因A(cytotoxin-associatedgene A，cagA)，表达CagA蛋白及空泡化细胞毒VacA(vacuolating cytotoxin A)。Ⅱ型无CagA，既不表达CagA蛋白也不表达VacA。Ⅰ型菌株在感染人群中约占60%，Ⅱ型约占16%,其余属中间型。尽管它们的功能尚不十分清楚，CagA和VacA是目前公认的致病因子之一，可引起较明显的胃、十二指肠粘膜病理变化。
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Hp具有集落于胃粘膜并持续定位于此的许多特性。它凭借特有的尿素酶活性及产物和特殊的附着力等,穿过酸性屏障到达胃粘膜上皮并长期生存。本实验结果证明，具有CagA+特性的悉尼株和野生型株在C57BL/C鼠胃内集落形成能力强, 与文献报道一致[1]。CagA-的突变株集落形成能力差。细菌在胃粘膜集落形成后的炎性反应与集落形成程度相一致。
我们观察到悉尼株组炎细胞浸润较明显，由于感染时间短, 本实验中未见粘膜糜烂及溃疡形成。实验研究还证实[6]，CagA+菌株可使试管中胃上皮细胞产生较高水平的白细胞介素8，这一观点可解释活体中所见的炎细胞浸润现象。因此，在无条件检测CagA+菌株的情况下，可依据胃粘膜组织学炎症程度选择根除对象是可取的。
血清IgG抗体是检测Hp感染的特异抗体，特别对CagA+菌株更敏感[2]。本实验结果亦证实这一观点。血清IgG抗体与集落形成水平密切相关。悉尼株和野生型株因其在胃内集落形成能力强，均产生了高水平的血清IgG抗体，而突变株在胃内集落形成能力差，未见明显的血清IgG抗体升高现象。
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本实验结果初步证实，CagA+的Hp菌株在C57BL/C 小鼠胃内集落形成良好，并引起较明显的胃粘膜炎症反应及血清IgG抗体水平升高,说明CagA+菌株感染在致病过程中起重要作用,其实验过程易于掌握，且价廉，有广泛的实用价值。Hp致病过程是复杂的，不仅由于CagA、VacA的作用，还有一系列毒性因子的协同参与, 在感染模型基础上进一步建立疾病模型，长期跟踪疾病的发展以及治疗反应，具有实际的临床意义。
本实验在日本大分医科大学第二内科完成 参考文献
1 Lee A, O′rourke J, Ungria MCD, et al. A standardized mouse model of helicobactor pylori infection: introducing the sydney strain. Gastroenterology, 1997, 112：1386-1397.
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2 Cover TL. Glupezynski Y, Lage AP, et al. Serologic detection of infection with CagA+ heoicobacter pylori strains. J Clin Microbil, 1995, 33：1496-1500.
3 Dixon MF, Path FRC, Genta RM, et al. Classification and grading of gastritis the npdated sydney system. Am Surgical Pathol, 1996, 20：1161-1181.
4 Queiroz DMM, Mendes EN, Rocha GA. Indicator mediun for isolation of campylobacter pylori. J Clin Microbiol, 1987, 25：2378-2379.
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5 Xiang Z, Gensini S, Bayeli PT, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of helicobacter pylori reveals that CagA is not nesessary for expression of the vaculating cytotoxin. Infect Immun, 1995, 63：94-98.
6 Crabtree JE, Farmety SM, Lindley IJD, et al. CagA/cytotoxic strains of helicobacter pylori and interlealcin-8 in gastric epithelial cells. J Clin pathol, 1994, 47：945-950.
(收稿：1998-03-16 修回：1998-12-09), 百拇医药