视网膜色素变性缓慢型视网膜变性基因突变的研究
作者：杨桦 罗成仁 严密 张
单位：200080 上海市第一人民医院眼科、上海市眼科研究所(杨桦、张皙)；华西医科大学附一院眼科(罗成仁、严密)
关键词：
视网膜色素变性缓慢型视网膜变性基因突变的研究 杨桦 罗成仁 严密 张杨桦 罗成仁 严密 张
视网膜色素变性(RP)是由视网膜光感受器和色素上皮细胞变性导致的，特征为夜盲和进行性视野缺损的一组常见致盲眼底病，同时又是具有遗传异质性的单基因遗传病，是遗传性视觉损害和致盲的最常见原因之一。目前全世界约有150万人患此病，其中中国人占1/4左右。由于现代分子生物学技术的发展及其在眼科遗传研究领域的应用，近5年来已在DNA分子水平逐渐发现了一些RP基因及其分子缺陷，使RP研究在眼科学和视觉科学中进展迅速。连锁分析表明某些家系RP与位于第6号染色体短臂的RDS基因位点紧密连锁[1]，近两年也查出美国、欧洲人RP患者有缓慢型视网膜变性(RDS)基因突变[2，3]。本研究对中国人RP病例进行RDS基因突变的筛查，为从DNA水平研究RP的发病机理和进一步对RP进行合理分类的研究奠定基础。
, 百拇医药
对象与方法
一、研究对象
(一) RP诊断标准[4] (1) 有夜盲史；(2) 典型眼底骨细胞样或不规则的色素沉着、视网膜血管缩窄和视盘颜色蜡黄和变淡；(3) 全视野视网膜电图异常或无波；(4) 视野缩窄或环形暗点等特征性改变和/或暗适应曲线阈值升高或杆体相缺乏。如果符合上述标准之2项，即作为RP组的研究对象。但不包括无色素性、结晶状、白点状、继发性及以综合征形式出现的RP。
(二) RP组 1994年至1996年期间在我院眼科遗传眼病门诊就诊的138例RP患者，其中男性82例，女性56例。
(三)正常对照组 130名健康人，经眼部检查排除包括RP在内的眼部疾病。
二、 RDS基因突变的研究方法
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(一) 仪器及试剂 采用美国Perkin Elmer公司生产的480型DNA Thermal Cycler仪。PCR试剂盒系德国Boeringer mannheim公司产品。限制性内切酶Dde Ⅰ系美国Promega公司产品。引物[5，6]：Primer1、2由中国科学院微生物研究所合成，Primer1:5′-AAGCCCATCTCCAGCTGTCTG-3′覆盖RDS基因的内含子1的3′末端，Primer2:5′-CTTACCCTCTACCCCCAGCTG-3′覆盖RDS基因的内含子2的5′末端。
(二) 聚合酶链反应(PCR)[7]：收集约5ml新鲜周围静脉血以苯酚/氯仿法抽提DNA[8]，PCR反应系统：10×Buffer 10μl,50mM MgCl2 3μl, 2.5mM dNTP 8μl, Primer1、2各2.5μl(10pmol/μl)，DNA模板3.5μl(30ng/μl),Taq DNA聚合酶0.5μl(5U/μl)，加水至总体积100μl。扩增条件：95°C 5分钟后加Taq DNA聚合酶，盖石蜡15μl，94°C变性1分钟，50°C退火2分钟，72°C延伸3分钟，共35个循环，再作72°C延伸6分钟。PCR产物检测：取5μl扩增样品在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳(3V/cm)检测，DNA分子量标记为pGEM-3Zf(+)/Hae ⅢDNA Marker(587bp、458bp、434bp、323bp、314bp、289bp、267bp、174bp、142bp、102bp、80bp、18bp、11bp)。0.5μg/ml溴乙啶染色15分钟后，用透射式紫外线观察，摄影。
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(三) 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 反应系统：10×Buffer 3μl, Dde Ⅰ 0.5μl(6u),PCR产物14μl，加水至30μl，置37°C水浴箱1～2小时。取限制性内切酶消化后的样品15μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳(3V/cm)，DNA分子量标记为pGEM-72f(+)/HaeⅢ DNA markers(657bp、458bp、434bp、328bp、289bp、267bp、174bp、142bp、102bp、80bp、40bp、18bp、11bp)。0.5μg/ml溴乙啶染色15分钟后，用透射式紫外线观察并摄影。
结果
本研究设计的引物Primer 1位于人RDS基因内含子1的3′末端，引物Primer 2则在内含子2的5′末端，经此对引物可扩增包含人RDS基因外显子2的313bp DNA片段。正常人和无RDS基因216密码第887位点C→T颠换的RP病例，缺乏限制性内切酶Dde Ⅰ的酶切位点(Dde Ⅰ的识别序列为5′-C↓TNAG)，其酶切产物长度仍为313bp；如果出现杂合型基因第887位点C→T突变，则其酶切产物长度有3种，即313、215、98bp。RDS基因外显子2的第216密码887位点C→T颠换，使216密码编码的脯氨酸突变为亮氨酸(Leu)，即发生Pro216Leu突变。经筛查138例RP患者中4例有杂合型RDS基因Pro216Leu突变，其余RP患者及正常人均无此突变。
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讨论
RP是一组遗传异质性和临床异质性较强的疾病。遗传异质性除表现在遗传方式的多样性外，还表现在多种基因突变的存在，RDS基因已被列为RP候选基因。本研究通过PCR-RFLP方法从138例RP患者中筛查4例有RDS基因216密码子突变。
人RDS基因有2个内含子和3个外显子，编码在光感受器中的正常产物即盘膜边缘蛋白，该物质系杆体和锥体光感受器外节盘膜边缘区域的结构糖蛋白，其分子量约为33000，由346个氨基酸组成，是rds小鼠缓慢型视网膜变性(rds)基因蛋白产物的人类同源物。盘膜边缘蛋白有4个跨越光感受器外节盘膜的脂质双层结构的区域，对维持杆体和锥体盘膜结构的稳定性起着重要的作用[9，10]。与RDS基因功能密切相关的蛋白结合位点均位于盘膜边缘蛋白在盘膜外间隙的2个转襻区域。人RDS基因216密码子编码的氨基酸位于盘膜外间隙的第2个转襻处，该区域在基因序列上高度保守，216密码子突变可能会影响盘膜边缘蛋白的二级结构及与相关蛋白的结合。
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早在1979年Demant等已发现小鼠的遗传性缓慢型视网膜变性与第17号染色体某些位点的改变有关，后来的研究结果证明，有10kb的外源DNA插入rds基因的开放性阅读框架的5′末端，使其编码的盘膜边缘蛋白缩短了1/3，而导致相应的小鼠遗传性视网膜变性。1989年Travis等[10]发表了小鼠rds基因的全部序列，接着采用人/鼠体细胞DNA杂交分析和原位杂交直接分析，将RDS基因定位于染色体6p的近着丝粒部位[1]。用RDS基因的cDNA进行RFLP分析，发现一些RP家系与RDS基因连锁；另一方面，rds基因突变所致的小鼠视网膜变性疾病的病理表现，为早期杆体和锥体光感受器异常增长，随之开始缓慢地变性，其表型与人类的RP很相似，这种小鼠遗传性视网膜变性与rds基因突变的联系必然导致RDS基因成为RP的重要候选基因。
1991年Farrar等[2]首次报告RP患者有RDS基因突变，在60例爱尔兰RP患者中，发现1例带有RDS基因118、119密码子3bp缺失，导致盘膜边缘蛋白的第3跨膜段一对高度保守的半胱氨酸之一丧失，其余59例RP和152例无亲缘关系的正常人未发现此3bp缺失。1993年Well等[6]也发现一个ADRP家系有相同的突变。本研究在138例中国人RP中查出4例有RDS基因216密码子突变。
, 百拇医药
尽管目前已查出RDS基因突变与RP的分子发病有关，但RDS基因导致RP的分子发病机理尚不清楚。由于rds小鼠的视网膜变性是外源DNA插入rds基因所致，与RDS基因突变的形式及部位有所不同，RDS与rds基因之间尚有7.5%的非同源性，所以rds小鼠的发病机制并不能完全替代人RDS基因突变导致RP的机理研究，有关确切机制尚需深入研究。
参考文献
[1] Jordan SA,Forrar GJ, Kenna P, et al. Autosomal dominant retinitis pigmentosa (adRP; RP6): Cosegregation of RP6 and the peripherin-rds locus in a late-onset family of Irish origin. Am J Hum Genet, 1992, 50:634.
, 百拇医药
[2] Farrar GJ. Kenna P, Jordan SA, et al. A three-base-pair deletion in the peripherin-RDS gene in one form of retinitis pigmentosa. Nature, 1991, 354: 478.
[3] Kajiwara K, Hahn LB, Mukai S, et al. Mutations in the human retinal degeneration slow gene in autosomal dominant retinitis pigmentosa. Nature, 1991,354:480.
[4] Gilbert C, Rahi J, Eckstein M, et al. Hereditary disease as a cause of childhood blindness: regional variation. Ophthalmic Genetics, 1995, 16:1.
, 百拇医药
[5] Travis GH, Christerson L, Danielson PE, et al. The human degeneration slow (RDS) gene: Chromosome assignment and structure of mRNA. Genomics, 1991,10:733.
[6] Wells J, Wroblewski J, Keen J, et al. Mutations in the human retinal degeneration slow(RDS) gene can cause either retinitis pigmentosa or macular dystrophy. Nature Genet, 1993, 3:213.
[7] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239:487.
, http://www.100md.com
[8] Sambrook J, Frish EF, Manistis T. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, P463-690.
[9] Connell G, Bascom R, Molday L, et al. Photoreceptor peripherin is the normal product of the gene responsible for retinal degeneration in the rds mouse. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:723.
[10] Travis GH, Brennan MB, Danielson PE, et al. Identification of a photoreceptor-specific mRNA encoded by the gene responsible for retinal degeneration slow (rds). Nature, 1989, 338:70.
(收稿：1998-09-21 修回：1998-12-01), http://www.100md.com
单位：200080 上海市第一人民医院眼科、上海市眼科研究所(杨桦、张皙)；华西医科大学附一院眼科(罗成仁、严密)
关键词：
视网膜色素变性缓慢型视网膜变性基因突变的研究 杨桦 罗成仁 严密 张杨桦 罗成仁 严密 张
视网膜色素变性(RP)是由视网膜光感受器和色素上皮细胞变性导致的，特征为夜盲和进行性视野缺损的一组常见致盲眼底病，同时又是具有遗传异质性的单基因遗传病，是遗传性视觉损害和致盲的最常见原因之一。目前全世界约有150万人患此病，其中中国人占1/4左右。由于现代分子生物学技术的发展及其在眼科遗传研究领域的应用，近5年来已在DNA分子水平逐渐发现了一些RP基因及其分子缺陷，使RP研究在眼科学和视觉科学中进展迅速。连锁分析表明某些家系RP与位于第6号染色体短臂的RDS基因位点紧密连锁[1]，近两年也查出美国、欧洲人RP患者有缓慢型视网膜变性(RDS)基因突变[2，3]。本研究对中国人RP病例进行RDS基因突变的筛查，为从DNA水平研究RP的发病机理和进一步对RP进行合理分类的研究奠定基础。
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对象与方法
一、研究对象
(一) RP诊断标准[4] (1) 有夜盲史；(2) 典型眼底骨细胞样或不规则的色素沉着、视网膜血管缩窄和视盘颜色蜡黄和变淡；(3) 全视野视网膜电图异常或无波；(4) 视野缩窄或环形暗点等特征性改变和/或暗适应曲线阈值升高或杆体相缺乏。如果符合上述标准之2项，即作为RP组的研究对象。但不包括无色素性、结晶状、白点状、继发性及以综合征形式出现的RP。
(二) RP组 1994年至1996年期间在我院眼科遗传眼病门诊就诊的138例RP患者，其中男性82例，女性56例。
(三)正常对照组 130名健康人，经眼部检查排除包括RP在内的眼部疾病。
二、 RDS基因突变的研究方法
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(一) 仪器及试剂 采用美国Perkin Elmer公司生产的480型DNA Thermal Cycler仪。PCR试剂盒系德国Boeringer mannheim公司产品。限制性内切酶Dde Ⅰ系美国Promega公司产品。引物[5，6]：Primer1、2由中国科学院微生物研究所合成，Primer1:5′-AAGCCCATCTCCAGCTGTCTG-3′覆盖RDS基因的内含子1的3′末端，Primer2:5′-CTTACCCTCTACCCCCAGCTG-3′覆盖RDS基因的内含子2的5′末端。
(二) 聚合酶链反应(PCR)[7]：收集约5ml新鲜周围静脉血以苯酚/氯仿法抽提DNA[8]，PCR反应系统：10×Buffer 10μl,50mM MgCl2 3μl, 2.5mM dNTP 8μl, Primer1、2各2.5μl(10pmol/μl)，DNA模板3.5μl(30ng/μl),Taq DNA聚合酶0.5μl(5U/μl)，加水至总体积100μl。扩增条件：95°C 5分钟后加Taq DNA聚合酶，盖石蜡15μl，94°C变性1分钟，50°C退火2分钟，72°C延伸3分钟，共35个循环，再作72°C延伸6分钟。PCR产物检测：取5μl扩增样品在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳(3V/cm)检测，DNA分子量标记为pGEM-3Zf(+)/Hae ⅢDNA Marker(587bp、458bp、434bp、323bp、314bp、289bp、267bp、174bp、142bp、102bp、80bp、18bp、11bp)。0.5μg/ml溴乙啶染色15分钟后，用透射式紫外线观察，摄影。
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(三) 限制性片段长度多态性(RFLP)分析 反应系统：10×Buffer 3μl, Dde Ⅰ 0.5μl(6u),PCR产物14μl，加水至30μl，置37°C水浴箱1～2小时。取限制性内切酶消化后的样品15μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳(3V/cm)，DNA分子量标记为pGEM-72f(+)/HaeⅢ DNA markers(657bp、458bp、434bp、328bp、289bp、267bp、174bp、142bp、102bp、80bp、40bp、18bp、11bp)。0.5μg/ml溴乙啶染色15分钟后，用透射式紫外线观察并摄影。
结果
本研究设计的引物Primer 1位于人RDS基因内含子1的3′末端，引物Primer 2则在内含子2的5′末端，经此对引物可扩增包含人RDS基因外显子2的313bp DNA片段。正常人和无RDS基因216密码第887位点C→T颠换的RP病例，缺乏限制性内切酶Dde Ⅰ的酶切位点(Dde Ⅰ的识别序列为5′-C↓TNAG)，其酶切产物长度仍为313bp；如果出现杂合型基因第887位点C→T突变，则其酶切产物长度有3种，即313、215、98bp。RDS基因外显子2的第216密码887位点C→T颠换，使216密码编码的脯氨酸突变为亮氨酸(Leu)，即发生Pro216Leu突变。经筛查138例RP患者中4例有杂合型RDS基因Pro216Leu突变，其余RP患者及正常人均无此突变。
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讨论
RP是一组遗传异质性和临床异质性较强的疾病。遗传异质性除表现在遗传方式的多样性外，还表现在多种基因突变的存在，RDS基因已被列为RP候选基因。本研究通过PCR-RFLP方法从138例RP患者中筛查4例有RDS基因216密码子突变。
人RDS基因有2个内含子和3个外显子，编码在光感受器中的正常产物即盘膜边缘蛋白，该物质系杆体和锥体光感受器外节盘膜边缘区域的结构糖蛋白，其分子量约为33000，由346个氨基酸组成，是rds小鼠缓慢型视网膜变性(rds)基因蛋白产物的人类同源物。盘膜边缘蛋白有4个跨越光感受器外节盘膜的脂质双层结构的区域，对维持杆体和锥体盘膜结构的稳定性起着重要的作用[9，10]。与RDS基因功能密切相关的蛋白结合位点均位于盘膜边缘蛋白在盘膜外间隙的2个转襻区域。人RDS基因216密码子编码的氨基酸位于盘膜外间隙的第2个转襻处，该区域在基因序列上高度保守，216密码子突变可能会影响盘膜边缘蛋白的二级结构及与相关蛋白的结合。
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早在1979年Demant等已发现小鼠的遗传性缓慢型视网膜变性与第17号染色体某些位点的改变有关，后来的研究结果证明，有10kb的外源DNA插入rds基因的开放性阅读框架的5′末端，使其编码的盘膜边缘蛋白缩短了1/3，而导致相应的小鼠遗传性视网膜变性。1989年Travis等[10]发表了小鼠rds基因的全部序列，接着采用人/鼠体细胞DNA杂交分析和原位杂交直接分析，将RDS基因定位于染色体6p的近着丝粒部位[1]。用RDS基因的cDNA进行RFLP分析，发现一些RP家系与RDS基因连锁；另一方面，rds基因突变所致的小鼠视网膜变性疾病的病理表现，为早期杆体和锥体光感受器异常增长，随之开始缓慢地变性，其表型与人类的RP很相似，这种小鼠遗传性视网膜变性与rds基因突变的联系必然导致RDS基因成为RP的重要候选基因。
1991年Farrar等[2]首次报告RP患者有RDS基因突变，在60例爱尔兰RP患者中，发现1例带有RDS基因118、119密码子3bp缺失，导致盘膜边缘蛋白的第3跨膜段一对高度保守的半胱氨酸之一丧失，其余59例RP和152例无亲缘关系的正常人未发现此3bp缺失。1993年Well等[6]也发现一个ADRP家系有相同的突变。本研究在138例中国人RP中查出4例有RDS基因216密码子突变。
, 百拇医药
尽管目前已查出RDS基因突变与RP的分子发病有关，但RDS基因导致RP的分子发病机理尚不清楚。由于rds小鼠的视网膜变性是外源DNA插入rds基因所致，与RDS基因突变的形式及部位有所不同，RDS与rds基因之间尚有7.5%的非同源性，所以rds小鼠的发病机制并不能完全替代人RDS基因突变导致RP的机理研究，有关确切机制尚需深入研究。
参考文献
[1] Jordan SA,Forrar GJ, Kenna P, et al. Autosomal dominant retinitis pigmentosa (adRP; RP6): Cosegregation of RP6 and the peripherin-rds locus in a late-onset family of Irish origin. Am J Hum Genet, 1992, 50:634.
, 百拇医药
[2] Farrar GJ. Kenna P, Jordan SA, et al. A three-base-pair deletion in the peripherin-RDS gene in one form of retinitis pigmentosa. Nature, 1991, 354: 478.
[3] Kajiwara K, Hahn LB, Mukai S, et al. Mutations in the human retinal degeneration slow gene in autosomal dominant retinitis pigmentosa. Nature, 1991,354:480.
[4] Gilbert C, Rahi J, Eckstein M, et al. Hereditary disease as a cause of childhood blindness: regional variation. Ophthalmic Genetics, 1995, 16:1.
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[5] Travis GH, Christerson L, Danielson PE, et al. The human degeneration slow (RDS) gene: Chromosome assignment and structure of mRNA. Genomics, 1991,10:733.
[6] Wells J, Wroblewski J, Keen J, et al. Mutations in the human retinal degeneration slow(RDS) gene can cause either retinitis pigmentosa or macular dystrophy. Nature Genet, 1993, 3:213.
[7] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 1988, 239:487.
, http://www.100md.com
[8] Sambrook J, Frish EF, Manistis T. Molecular Cloning. A laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, P463-690.
[9] Connell G, Bascom R, Molday L, et al. Photoreceptor peripherin is the normal product of the gene responsible for retinal degeneration in the rds mouse. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:723.
[10] Travis GH, Brennan MB, Danielson PE, et al. Identification of a photoreceptor-specific mRNA encoded by the gene responsible for retinal degeneration slow (rds). Nature, 1989, 338:70.
(收稿：1998-09-21 修回：1998-12-01), http://www.100md.com