逆转录－多聚酶链式反应方法检测临床肝癌组织的多药耐药基因表达
作者：韩英 柴富贵 李世荣 王玉芝
单位：韩英 柴富贵 李世荣(北京军区总医院消化内科(北京，100700))；王玉芝(军事医学科学院放射医学研究所)
关键词：抗药性；多聚酶链反应(PCR)；肝脏肿瘤
癌症990343
中图号：R735.7；Q753 文献标识码：B 文章编号：1000-467X(1999)03-0357-02
化疗是治疗肿瘤的有效手段之一。肿瘤细胞耐药是导致化疗失败的主要原因，有关资料统计，90%以上肿瘤患者死因或多或少都与耐药有关〔1〕。因此，研究肿瘤耐药起因、检测病人是否出现耐药，借以指导临床化疗，提高患者治愈率和生存率，这是当前肿瘤治疗迫切需要解决的重要问题。本实验采用逆转录-多聚酶链式反应(RTPCR)技术建立了一种灵敏、特异、可靠的检测临床肝癌MDR1基因的表达方法，并探讨MDR1基因在肝癌组织中的表达与临床特征之间的关系，为临床化疗提供一项辅助的监测和判断指标，使化疗个体化并发挥更有效的作用。
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1 材料与方法
1.1 检测对象
所有标本均取自经病理证实的原发性肝细胞癌手术病人，共31例，均未接受化疗。正常肝组织5例。
1.2 主要试剂与仪器
AMV逆转录酶、RNA提取试剂盒和TaqDNA聚合酶购自Promega公司。PCR仪系美国PE公司GeneAmpPCRSystem2400。
1.3 实验方法
1.3.1 RNA制备：采用Promega公司总RNA提取试剂盒，依照操作说明书制备总RNA。
1.3.2 引物设计：参考Grunebach等〔2〕文献报道，利用PCGENE软件设计基因专一性引物，其扩增片段为一段长403bp(+207～+609，以翻译起始密码子ATG中的A为+1)的cDNA片段〔3〕。上游引物5′CGGGATCCCTGGTGTTTGGAGAAATGACAG3′，下游引物5′AACTGCAGCCCAGTGAAAAATGTTGCCATTGAC3′，内对照β微球蛋白(β-MG)，上游引物5′CGAGAAGATGACCCAGAT5′GATCTTCATGAGGTAGTCAG3′，其扩增片段长度为240bp。
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1.3.3 对照系统：耐药和敏感KB细胞分别作阳性和阴性细胞对照(购自中国医学科学院药物研究所)。
1.3.4 cDNA合成：取总RNA约3μg，加5×缓冲液4μl，2.5mmol/LdNTP2μl，RNA酶抑制剂(RNasin)30u，AMV逆转录酶15～20u，100μmol/L下游引物0.5μl，补水至20μl，混匀后42℃孵育1小时，结束后取逆转录混合产物5μl行PCR扩增。
1.3.5 PCR：取上述逆转录混合产物约5μl为模板，加10×缓冲液2μl，25mmol/L氯化镁1.5μl，2.5mmol/LdNTP2μl，100μmol/L两对引物各0.1μl，在PCR仪上，首先95℃预变性5分钟，再加TaqDNA聚合酶0.5u，而后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，扩增35个循环，最后72℃补平7分钟。取10μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳60伏50分钟，紫外灯下照相。
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2 结果
利用逆转录PCR技术和设定的两对引物，得到MDR-1和β-MG扩增产物分别为403bp和240bp(见图1)。31例肝癌标本MDR1阳性表达率为45%(14/31)，5例正常肝组织均阴性。为验证本实验的敏感性，取5×104、8×104、1×105、5×105个耐药KB细胞，分别进行RT-PCR检测，耐药KB细胞数达8×104以上时，均可得到阳性MDR-1扩增带。为进一步探讨临床内镜活检小标本MDR-1表达的检测，取一阳性表达组织标本，分别称取2.5mg,5mg,10mg,20mg，(通常纤维结肠镜活检钳夹取一块组织重约2～3mg)进行RT-PCR检测MDR-1。结果表明，重约5mg以上的标本均可得到阳性MDR-1表达(见图2)。
图1 肝癌组织MDR-1表达
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A.敏感KB细胞；B.耐药KB细胞；
C、D、.肝癌标本；M.marker
图2 不同重量肝癌细胞MRD-1扩增
A.2.5mg; B.5mg; C.10mg; D.2.0mg M.marker
3 讨论
多药耐药(MDR)是患者对化疗药物产生耐药的主要形式。实验研究表明，P糖蛋白(P-gp)过度表达，DNA拓扑异构酶活性或结构异常，多药耐药相关蛋白基因过度表达，均可导致MDR。其中，P-gp介导的耐药称为典型MDR。目前，检测P-gp介导的多药耐药现象的主要方法有P-gp水平，MDR-1mRNA水平及P-gp功能活性3个方面。其中，RT-PCR方法检测MDR-1mRNA被认为是最敏感，最特异，且最可靠的方法。本实验应用RT-PCR方法，对临床肝癌标本MDR1mRNA进行检测，同时选择了在大多数细胞膜上表达较稳定的β-MG作为内对照。对于阴性表达的患者，如果β-MG表达阳性则可证实PCR反应成功，可除外因实验本身的操作失败所致假阴性。此外，本实验同时以耐药和敏感细胞系作为外对照系统，灵敏度达8×104。本方法虽然是以肝癌标本确定的实验条件，也适用于其它临床活检小标本的MDR-1表达的检测，如胃镜、纤维结肠镜活检标本。
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本组受检的肝癌患者，均接受手术治疗，且术前均未进行过化疗，其MDR-1阳性表达率为45%，表明原发性肝细胞癌患者存在较高比例的内在性耐药性，与文献报道相一致〔4〕。此种内在耐药性的存在，可解释为何临床肝癌患者化疗效果不佳。值得注意的是14例MDR-1阳性病例中有9例伴有癌转移，表明MDR-1高表达也可能预示癌细胞恶性程度高，侵袭力强，有转移倾向。
肝癌患者的内在耐药性比例较高；对化疗药物的耐药性与MDR-1表达增高有关。RT-PCR方法检测MDR-1mRNA可以作为临床判断多药耐药的指标，对临床选择化疗方案和估计预后有参考价值。
参考文献
1 杨纯正.肿瘤细胞耐药基因研究进展〔J〕.中国肿瘤，1996，5(7)：15
2 Grunebach F, Griese EU, Shumacher K. Competitive nested polymerase chain reaction for quantification of human MDR1 gene expression 〔J〕. J Cancer Res Clin Oncol, 1994,120：539～544.
, 百拇医药
3 Chen CJ, Clark D, Uedak. Genomic organization of the human multidrug resistance (MDR1) gene and origin of P-glycoproteins〔J〕.J Biol Chem, 1990,265(1)：505～514.
4 Goldstein LJ, Galski H, Fojo A, et al. Expression of multidrug resistance gene in human cancers〔J〕. J Natl Cancer Inst, 1989,81(2)：116～124.
收稿日期：1998-07-07；修回日期：1998-08-25, 百拇医药
单位：韩英 柴富贵 李世荣(北京军区总医院消化内科(北京，100700))；王玉芝(军事医学科学院放射医学研究所)
关键词：抗药性；多聚酶链反应(PCR)；肝脏肿瘤
癌症990343
中图号：R735.7；Q753 文献标识码：B 文章编号：1000-467X(1999)03-0357-02
化疗是治疗肿瘤的有效手段之一。肿瘤细胞耐药是导致化疗失败的主要原因，有关资料统计，90%以上肿瘤患者死因或多或少都与耐药有关〔1〕。因此，研究肿瘤耐药起因、检测病人是否出现耐药，借以指导临床化疗，提高患者治愈率和生存率，这是当前肿瘤治疗迫切需要解决的重要问题。本实验采用逆转录-多聚酶链式反应(RTPCR)技术建立了一种灵敏、特异、可靠的检测临床肝癌MDR1基因的表达方法，并探讨MDR1基因在肝癌组织中的表达与临床特征之间的关系，为临床化疗提供一项辅助的监测和判断指标，使化疗个体化并发挥更有效的作用。
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1 材料与方法
1.1 检测对象
所有标本均取自经病理证实的原发性肝细胞癌手术病人，共31例，均未接受化疗。正常肝组织5例。
1.2 主要试剂与仪器
AMV逆转录酶、RNA提取试剂盒和TaqDNA聚合酶购自Promega公司。PCR仪系美国PE公司GeneAmpPCRSystem2400。
1.3 实验方法
1.3.1 RNA制备：采用Promega公司总RNA提取试剂盒，依照操作说明书制备总RNA。
1.3.2 引物设计：参考Grunebach等〔2〕文献报道，利用PCGENE软件设计基因专一性引物，其扩增片段为一段长403bp(+207～+609，以翻译起始密码子ATG中的A为+1)的cDNA片段〔3〕。上游引物5′CGGGATCCCTGGTGTTTGGAGAAATGACAG3′，下游引物5′AACTGCAGCCCAGTGAAAAATGTTGCCATTGAC3′，内对照β微球蛋白(β-MG)，上游引物5′CGAGAAGATGACCCAGAT5′GATCTTCATGAGGTAGTCAG3′，其扩增片段长度为240bp。
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1.3.3 对照系统：耐药和敏感KB细胞分别作阳性和阴性细胞对照(购自中国医学科学院药物研究所)。
1.3.4 cDNA合成：取总RNA约3μg，加5×缓冲液4μl，2.5mmol/LdNTP2μl，RNA酶抑制剂(RNasin)30u，AMV逆转录酶15～20u，100μmol/L下游引物0.5μl，补水至20μl，混匀后42℃孵育1小时，结束后取逆转录混合产物5μl行PCR扩增。
1.3.5 PCR：取上述逆转录混合产物约5μl为模板，加10×缓冲液2μl，25mmol/L氯化镁1.5μl，2.5mmol/LdNTP2μl，100μmol/L两对引物各0.1μl，在PCR仪上，首先95℃预变性5分钟，再加TaqDNA聚合酶0.5u，而后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，扩增35个循环，最后72℃补平7分钟。取10μl扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳60伏50分钟，紫外灯下照相。
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2 结果
利用逆转录PCR技术和设定的两对引物，得到MDR-1和β-MG扩增产物分别为403bp和240bp(见图1)。31例肝癌标本MDR1阳性表达率为45%(14/31)，5例正常肝组织均阴性。为验证本实验的敏感性，取5×104、8×104、1×105、5×105个耐药KB细胞，分别进行RT-PCR检测，耐药KB细胞数达8×104以上时，均可得到阳性MDR-1扩增带。为进一步探讨临床内镜活检小标本MDR-1表达的检测，取一阳性表达组织标本，分别称取2.5mg,5mg,10mg,20mg，(通常纤维结肠镜活检钳夹取一块组织重约2～3mg)进行RT-PCR检测MDR-1。结果表明，重约5mg以上的标本均可得到阳性MDR-1表达(见图2)。
图1 肝癌组织MDR-1表达
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A.敏感KB细胞；B.耐药KB细胞；
C、D、.肝癌标本；M.marker
图2 不同重量肝癌细胞MRD-1扩增
A.2.5mg; B.5mg; C.10mg; D.2.0mg M.marker
3 讨论
多药耐药(MDR)是患者对化疗药物产生耐药的主要形式。实验研究表明，P糖蛋白(P-gp)过度表达，DNA拓扑异构酶活性或结构异常，多药耐药相关蛋白基因过度表达，均可导致MDR。其中，P-gp介导的耐药称为典型MDR。目前，检测P-gp介导的多药耐药现象的主要方法有P-gp水平，MDR-1mRNA水平及P-gp功能活性3个方面。其中，RT-PCR方法检测MDR-1mRNA被认为是最敏感，最特异，且最可靠的方法。本实验应用RT-PCR方法，对临床肝癌标本MDR1mRNA进行检测，同时选择了在大多数细胞膜上表达较稳定的β-MG作为内对照。对于阴性表达的患者，如果β-MG表达阳性则可证实PCR反应成功，可除外因实验本身的操作失败所致假阴性。此外，本实验同时以耐药和敏感细胞系作为外对照系统，灵敏度达8×104。本方法虽然是以肝癌标本确定的实验条件，也适用于其它临床活检小标本的MDR-1表达的检测，如胃镜、纤维结肠镜活检标本。
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本组受检的肝癌患者，均接受手术治疗，且术前均未进行过化疗，其MDR-1阳性表达率为45%，表明原发性肝细胞癌患者存在较高比例的内在性耐药性，与文献报道相一致〔4〕。此种内在耐药性的存在，可解释为何临床肝癌患者化疗效果不佳。值得注意的是14例MDR-1阳性病例中有9例伴有癌转移，表明MDR-1高表达也可能预示癌细胞恶性程度高，侵袭力强，有转移倾向。
肝癌患者的内在耐药性比例较高；对化疗药物的耐药性与MDR-1表达增高有关。RT-PCR方法检测MDR-1mRNA可以作为临床判断多药耐药的指标，对临床选择化疗方案和估计预后有参考价值。
参考文献
1 杨纯正.肿瘤细胞耐药基因研究进展〔J〕.中国肿瘤，1996，5(7)：15
2 Grunebach F, Griese EU, Shumacher K. Competitive nested polymerase chain reaction for quantification of human MDR1 gene expression 〔J〕. J Cancer Res Clin Oncol, 1994,120：539～544.
, 百拇医药
3 Chen CJ, Clark D, Uedak. Genomic organization of the human multidrug resistance (MDR1) gene and origin of P-glycoproteins〔J〕.J Biol Chem, 1990,265(1)：505～514.
4 Goldstein LJ, Galski H, Fojo A, et al. Expression of multidrug resistance gene in human cancers〔J〕. J Natl Cancer Inst, 1989,81(2)：116～124.
收稿日期：1998-07-07；修回日期：1998-08-25, 百拇医药