人乳腺癌细胞MTT药敏试验评价标准的研究
作者：徐建明 宋三泰 汤仲明 江泽飞 刘晓晴 刘广贤 周莉 张婧
单位：军事医学科学院附属医院(北京，100039) △军事医学科学院放射医学研究所(北京，100850)
关键词：人乳腺癌细胞；MTT比色法；药物敏感性；评价标准
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【摘要】目的：建立人乳腺癌细胞体外药敏评价标准，预测乳癌病人的化疗疗效。方法：应用MTT试验，检测175例原代乳腺癌细胞对8种化疗药物的敏感性，采用Logistic程序对药物敏感性的指标进行分析。结果：如果Imax%>(瘤群Imax%均数+标准差)，说明药物的抑制作用较弱，临床不能应用该药；如果Imax%≤(瘤群Imax%均数+标准差)药物的抑制作用较强，可以进一步考证其IC50。IC50≤Q50，即小于本组瘤群IC50的中位值，则判定该例乳腺癌对药物相对敏感，反之则为相对耐药。结论：联合应用Imax%和IC50的药敏评价标准，能较客观地反映人乳腺癌细胞体外的药物敏感性，有利于预测乳癌病人的化疗疗效。
, 百拇医药
中图号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0260-03
Studies of evaluable criteria for in vitro chemosensitivity
using MTT assay in human breast cancer cells
XU Jian-ming, SONG San-tai, TANG Zhong-ming,et al
Beijing 307 Hospital, Cancer Center,Beijing 100039,China
【Abstract】 Objective：To establish evaluable criteria of in vitro chemosensitivity for predicting clinical response of chemotherapy in breast cancer patients.Methods：The chemosensitivity of 175 human breast cancers to 8 antitumor drugs was measured by MTT assay,respectively and the Imax% and IC50 by logistic analysis of the dose-response curve was evaluated.Results：If Imax% >mean Imax%+SD which was obtained from the Imax%s of tumor samples, the drug was ineffective to this tumor sample.If the Imax% ≤ mean Imax%+SD,the cytotoxicity was greater. Then we would compare its IC50 with the value of Q50 which was used as cut-off between sensitivity and resistance.If its IC50≤the value of Q50,this tumor sample was relatively sensitive to the drug.Otherwise,it was resistant to the drug. Conclusion：The evaluable criteria which were first determined by Imax% and IC50 form Chinese breast cancer tissues may objectively predict the in vitro chemosensitivity. It makes this assay feasible for directing chemotherapy to breast cancer patients.
, 百拇医药
Key words： Breast neoplasms;MTT colorimetry;Chemosensitivity;Criteria
近年来，MTT法的药敏试验在肿瘤预见性化疗中的作用逐渐为大家所接受〔1，2〕，但是，药敏评价体系还存在诸多缺点。为此，我们曾研究分析过32例乳腺癌MTT试验的药敏指标，初步形成了乳腺癌的体外药物敏感性评价标准〔3〕。目前，共积累175例乳腺癌标本的药敏数据，结合临床疗效的反馈信息〔4，5〕，重新修订评价标准，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、培养液及仪器见文献〔3〕
1.2抗肿瘤药物
选阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)、氨甲喋呤(MTX)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、米托蒽醌(Mx)、长春花碱酰胺(VDS)等8种。所有药物先用磷酸盐缓冲液(PBS)配成母液，-20℃贮存，测试前各种药物都用培养液稀释成6个梯度浓度。因为环磷酰胺(CTX)在体外无活性，需经体内肝微粒体酶和细胞色素P-450作用，氧化、裂环成醛磷酰胺，才能对肿瘤细胞起到杀伤作用，因此，该药不宜用作体外药敏测定。
, http://www.100md.com
1.3 标本来源及处理
175例标本均为本院及外院手术切除的新鲜乳腺癌组织，其中，原发癌84例，复发转移癌91例。先行肿瘤印片细胞学检查，以鉴别组织的细胞学性质。细胞悬液的制备见文献〔3〕。
1.4 MTT药敏试验方法见文献〔3〕
1.5 药物体外敏感性的评价指标
由于药物抑制作用与药物浓度的关系表现为乙状Logistic函数，故通过计算机采用Logistic函数程序，对高达6个梯度浓度的大跨度多点作用的量效曲线进行综合估算〔3〕。
1.6 统计学方法
以矩法计算药敏指标的偏度系数和峰度系数，并进行正态性检验。对正态分布者，计算其均数±标准差；对偏态分布者，则求百分位数值〔6〕。
, 百拇医药
2 结果
2.1 同一药物对不同乳腺癌抑制程度Imax%的差异及其分布特点。
Imax%(Survivalrateatmaximalinhibition)代表了化疗药物达到最大抑制时，残存肿瘤细胞的存活率。Imax%越大，表示残存的肿瘤细胞越多，药物的抑制程度越小。不同病人及不同药物之间的Imax%存在差异。表1列出了本组瘤群中，8种化疗药物抑制作用最强、中等和最弱各5例的Imax%值。结果表明同一药物对大多数病例的Imax%值有所不同。一般相差1～2个数量级，CBP相差最大也仅1000倍(3个数量级)，而5-U则在同一级的水平。通过Imax%分布的矩法正态性检验，8种化疗药物对瘤群的Imax%都呈正态分布，偏离常态检验P>0.05(表2)。
表1 8种化疗药物达到最大抑制时残存原代乳腺癌细胞存活率(Imax%)的差异
, 百拇医药
百分位数
ADM
5-FU
VCR
MTX
DDP
CBP
Mx
VDS
例号
Imax%
例号
Imax%
, http://www.100md.com
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
Q1
, http://www.100md.com
59
0.1
108
10.9
130
4.2
55
0.5
36
0.1
117
0.1
174
, http://www.100md.com
2.4
56
4.6
62
1.0
140
12.9
95
4.9
144
3.5
111
5.9
, http://www.100md.com
58
7.9
88
6.6
58
8.6
90
2.7
64
18.0
80
5.1
147
, 百拇医药 5.5
66
9.6
111
9.0
128
7.1
108
10.1
156
6.7
122
19.3
, 百拇医药 129
13.0
111
6.6
108
9.6
112
9.9
148
9.3
65
11.1
116
, 百拇医药 6.8
166
19.5
143
15.9
108
10.6
89
10.1
32
10.0
82
10.5
, 百拇医药
117
11.9
Q50
170
35.3
117
42.5
15
40.8
30
45.0
163
31.4
, 百拇医药
152
37.1
122
32.3
138
30.8
34
35.7
114
42.5
171
40.9
94
, http://www.100md.com
45.0
117
32.2
44
37.2
154
32.8
148
30.8
151
35.7
26
42.9
, 百拇医药
123
42.1
64
45.1
146
32.2
88
37.6
161
33.1
104
30.9
50
, 百拇医药
35.8
163
43.0
154
42.9
120
45.7
161
32.2
133
37.6
29
33.5
, 百拇医药
123
30.9
71
35.9
17
43.1
124
43.1
28
46.0
151
32.4
105
, 百拇医药
38.5
64
34.4
120
31.5
Q100
131
76.7
156
81.5
21
79.0
59
, 百拇医药
85.0
18
72.7
38
77.2
88
82.2
149
69.1
155
79.8
11
82.6
, 百拇医药
5
79.8
32
86.2
9
76.9
13
77.5
85
83.5
118
75.9
10
, 百拇医药
81.3
13
83.4
115
81.6
87
88.9
13
77.4
175
92.5
121
85.6
, 百拇医药
175
78.3
36
90.0
114
86.7
38
85.0
5
89.9
175
88.0
21
, 百拇医药
100
175
87.0
159
79.9
118
93.3
36
95.0
36
88.0
175
90.0
, 百拇医药
159
90.1
23
100
168
89.3
145
80.7
注：每种化疗药都有175例标本。表内仅显示药物达最大作用的抑制是严重、抑制中等、和抑制最轻微的各5例。Q1～Q100分别代表百分位数中第1～100位。表2 175例乳腺癌病人药物达到最大抑制时残存肿瘤细胞的存活率(Imax%)的分布
药物
, http://www.100md.com Imax%
±s
Imax%
矩法正态性检验
Q25
Q50
Q75
峰度系数*
ugl
P
偏度系数Δ
, 百拇医药
ugl
P
VDS
30.1±13.4
26.0
30.9
47.0
0.20
<0.01
-0.33
>0.05
DDP
30.8±17.1
, 百拇医药
22.2
32.2
47.5
0.72
<0.01
0.33
>0.05
Mx
32.7±17.3
19.8
33.1
48.3
1.26
, 百拇医药
>0.05
0.25
>0.05
ADM
35.8±17.4
23.7
35.7
48.4
0.60
>0.05
0.27
>0.05
CBP
, http://www.100md.com
37.7±12.8
24.5
37.6
49.2
0.65
<0.01
0.29
>0.05
VCR
44.5±17.3
30.5
42.1
59.8
, 百拇医药
-0.19
>0.05
-0.26
>0.05
MTX
45.2±16.8
30.1
45.1
60.4
0.001
>0.05
-0.32
>0.05
, 百拇医药
5-FU
46.4±5.9
34.5
42.9
61.6
0.10
>0.05
-0.23
>0.05
※峰度系数等于0为正态峰；大于0为尖峭峰；小于0为平阔峰。
Δ偏度系数等于0为对称峰；大于0为正偏态峰；小于0为负偏态峰。
2.2 不同乳腺癌对同一药物的敏感性IC50的差异及其分布特点
, 百拇医药
我们以药物达到最大的抑制作用一半时，所需的药物浓度IC50(50%inhibitionconcentration)，来表示乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。IC50越小，表示肿瘤细胞对化疗药物的敏感性越大；反之则表示敏感性越小。表3列出了本组乳腺癌中，对8种化疗药最敏感、中度敏感及最不敏感各5例的IC50值。结果表明不同乳腺癌对同一药物的敏感性差异甚远，一般相差4～5个数量级，DDP竟高达10倍，而相差最小的Mx也在3个数量级。这与临床常见的，不同病人采用同一剂量的药物治疗，效果悬殊很大是相符合的。IC50分布经矩法正态性检验均呈偏移峰型分布，偏离常态检验P<0.001(表4)。
表3 药物达到最大抑制作用一半时所需药物浓度(IC50)的差异
百分
位数
ADM
, http://www.100md.com
5-FU
VCR
MTX
DDP
CBP
Mx
VDS
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
, 百拇医药
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
Q1
107
, http://www.100md.com
1.5×10-9
15
2.3×10-8
1
1.2×10-9
141
3.2×10-8
141
6.7×10-9
128
1.5×10-8
, 百拇医药
170
1.2×10-8
149
2.0×10-10
135
6.6×10-9
10
3.1×10-8
24
1.5×10-9
51
, 百拇医药
4.5×10-8
172
8.3×10-9
18
2.0×10-8
90
1.4×10-8
172
7.0×10-10
172
2.3×10-8
, 百拇医药
7
4.6×10-8
131
1.6×10-9
26
4.8×10-8
128
2.1×10-8
172
2.0×10-8
162
, http://www.100md.com
1.6×10-8
111
1.2×10-9
133
2.9×10-8
141
5.2×10-8
11
3.3×10-9
27
4.9×10-8
, http://www.100md.com
126
2.2×10-8
79
2.0×10-8
88
1.6×10-8
135
1.2×10-9
91
3.8×10-8
1
, http://www.100md.com 8.2×10-8
19
3.3×10-9
44
5.2×10-8
109
3.1×10-8
166
2.3×10-8
118
1.8×10-8
, http://www.100md.com
174
1.3×10-9
Q50
121
1.9×10-7
101
6.1×10-7
146
7.6×10-8
63
3.5×10-7
, 百拇医药
57
6.8×10-7
94
6.7×10-8
12
1.1×10-7
97
7.4×10-9
122
1.9×10-7
148
, 百拇医药
6.1×10-7
165
7.7×10-8
31
3.6×10-7
4
6.9×10-7
129
7.0×10-8
167
1.2×10-7
, 百拇医药
80
7.6×10-9
162
1.9×10-7
28
6.2×10-7
148
7.8×10-8
16
4.2×10-7
115
, 百拇医药
7.3×10-7
70
7.4×10-8
71
1.2×10-7
153
7.7×10-9
88
2.0×10-7
465
6.3×10-7
, 百拇医药
23
8.0×10-8
2
4.3×10-7
125
7.4×10-7
86
7.4×10-8
89
1.2×10-7
104
, http://www.100md.com 7.8×10-9
97
2.0×10-7
97
6.4×10-7
80
8.0×10-8
24
4.3×10-7
90
7.7×10-7
, 百拇医药
90
7.5×10-8
175
1.3×10-7
168
7.9×10-8
Q100
46
2.4×10-5
74
2.1×10-5
, 百拇医药
147
1.3×10-5
55
2.2×10-5
124
8.3×10-5
28
7.9×10-5
78
3.1×10-7
159
, 百拇医药
7.9×10-7
59
3.4×10-5
3
2.4×10-5
39
2.0×10-5
23
2.2×10-5
43
1.2×10-4
, 百拇医药
6
5.3×10-4
74
3.7×10-7
175
1.1×10-6
74
7.0×10-5
114
6.7×10-5
106
, 百拇医药
3.8×10-5
13
2.2×10-4
28
1.5×10-4
14
2.7×10-3
121
3.9×10-7
59
1.2×10-6
, 百拇医药
62
7.9×10-5
28
8.0×10-5
36
1.1×10-4
59
2.2×10-4
23
2.2×10-4
21
, 百拇医药 2.7×10-3
177
3.3×10-8
74
4.8×10-6
36
1.7×10-4
36
7.7×10-4
38
1.1×10-4
, 百拇医药
45
2.2×10-4
6
2.6×10-3
23
2.7×10-3
58
1.9×10-5
117
1.1×10-6
注：每种化疗药都有175例标本，表内仅显示最敏感，中度敏感和最抗药的各5例。
, 百拇医药
Q1～Q100分别代表百分位数中第1～100位。药物浓度：毫克分子数/毫升
表4 175例乳腺癌病人药物达到最大抑制作用一半时所需药物浓度(IC50)的分布
药物
IC50±s
IC50
矩法正态性检验
Q25
Q50
, 百拇医药 Q75
峰度系数*
ugl
P
偏度系数Δ
ugl
P
VDS
1.3±9.3×10-7
4.2×10-9
7.7×10-9
, http://www.100md.com
1.5×10-8
10.6
<0.01
120.6
<0.01
Mx
1.8±15.0×10-7
7.0×10-8
1.2×10-7
1.8×10-7
40.4
, 百拇医药
<0.01
23.2
<0.01
VCR
2.0±12.0×10-6
2.9×10-8
7.8×10-8
2.2×10-7
8.3
<0.01
70.5
, 百拇医药
<0.01
ADM
2.9±15.6×10-6
1.1×10-7
1.9×10-7
7.8×10-7
8.7
<0.01
86.4
<0.01
MTX
, 百拇医药
5.7±30.0×10-6
1.2×10-7
4.2×10-7
1.0×10-6
7.2
<0.01
45.7
<0.01
5-FU
7.0±58.4×10-6
3.2×10-7
, http://www.100md.com
6.2×10-7
1.5×10-6
12.9
<0.01
169.2
<0.01
DDP
2.0±21.0×10-5
2.2×10-7
7.3×10-7
2.5×10-6
, 百拇医药
13.0
<0.01
170.4
<0.01
CBP
5.2±35.0×10-5
1.4×10-7
7.4×10-6
2.5×10-6
7.4
<0.01
, 百拇医药
53.5
<0.01
*峰度系数等于0为正态峰；大于0为尖峭峰；小于0为平阔峰。Δ偏度系数等于0为称峰；大于0为正偏态峰；小于0为负偏态峰。药物浓度IC50：毫克分子数/毫升
2.3 MTT体外药敏试验药敏评价标准的建立
鉴于上述瘤群的Imax%呈正态分布的特点，本研究用Imax%均数+1个标准差表示药物抑瘤程度强弱的界线，大于此值者为抑制作用较弱的药物；小于或等于此值者为抑制作用较强的药物。结果表明(表2)，VDS、DDP、Mx、ADM的Imax%的均数明显小于MTX、VCR、5FU(P<0.01)，说明前者抑瘤作用比后者强，这一结果与临床常识相符合。而IC50表现偏态分布的特点，可将瘤群IC50按百分位数的方法分级，以其IC50的中位值Q50，作为判断个例肿瘤对药物敏感和抗药的界线。从而确定体外药物敏感性的评价标准：
, 百拇医药
①Imax%>(瘤群Imax%均数+标准差)，说明在高浓度药物作用下，也难以抑制肿瘤细胞，故可排除临床应用的可能性。
②Imax%≤(瘤群Imax%均数+标准差)，说明该药在高浓度作用下，能够将肿瘤细胞抑制到较低水平。但该例肿瘤细胞对药物的敏感性如何，还需要进一步通过IC50来考证。如果患者IC50≤Q50(中位值)，则判定为对药物相对敏感，反之，则为相对耐药。
3 讨论
MTT体外药敏试验已开展多年，但是药物体外敏感性的评价尚无统一标准〔7〕。建立一个合理的评价体系，就能为临床肿瘤的预见性化疗提供客观的参考依据。以往MTT试验，都是以单点浓度药物作用下的抑制率，或者是药物达到最大抑制作用时的残存率作为评价指标，并人为划定以抑制50%或70%作为敏感和抗药界线〔8〕。但单点浓度随意性太大，各实验室之间无法比较。而最大抑制时的残存率，可能因药物浓度已大大超过患者所能达到的血浆药物浓度水平，难以指导临床应用。我们还发现，达到最大抑制作用后，不同病人细胞存活率的差别也并不十分明显，因此，很难判断其耐药程度。也有少数学者〔9〕以多点作用后的半数抑制浓度作为评价指标，但他们只是在针对同一细胞株的不同化疗药物之间进行比较，并没有临床实际应用价值。
, http://www.100md.com
我们根据乳腺癌瘤群的药敏指标的实测数据，研究设计针对中国乳腺癌病人实际情况的评价系统。具体探索过程是，在研究初期曾以32例乳腺癌材料为基础，将其药敏指标Imax%及IC50，按数值大小排序，发现我国乳腺癌群体IC50呈偏态分布，初步建立了药敏评价标准〔3〕。目前我们通过累计175例病人的数据排序，发现Imax%呈正态分布，IC50仍保持偏态分布。再结合其中解救化疗的疗效反馈信息，修正了第一阶段的评价标准，并由此选药，使一组难治性病人获得出人预料的良好效果〔4，5〕，体外药敏与体内疗效的总符合率为79.5%〔4〕，在确定评价标准后，我们还分析了病人乳腺癌组织多药耐药基因md r-1表达水平与药敏指标Imax%及IC50的关系〔10〕，发现md r-1基因的表达水平与Imax%无关，而与IC50相关并具有统计学意义，再次证明国外学者单独应用Imax%判断药物敏感性的不合理性。
根据1983年以来MEDLINE等三个中英文医学、生物学光盘数据库的联机检索表明，本评价系统通过拟合大跨度多点作用的量效曲线，首次联合应用两个药敏指标。先经Imax%初筛，回答了该药能不能抑制肿瘤；然后再通过IC50，了解在多大浓度抑制肿瘤细胞。我们通过临床病例的积累，不断丰富Imax%及IC50的数据，使前者的均数及后者的中位数更加接近中国人群的实际情况。再通过临床治疗的反复印证〔4，5〕，使这些标准渐趋稳定成熟，而能在临床推广应用。
, 百拇医药
收稿日期：1998-04-24；修回日期：1998-11-13
参考文献
1 Sargent J, Elgie A, Taylor CG, et al.The identification of drug resistance in ovarian cancer and breast cancer： application of the MTT assay〔J〕.Contrib Gynecol Obstet,1994,19：64.
2 Tonn JC, Schachenmayr W, Kraemer HP. In vitro chemosensitivity test of malignant gliomas： clinical relevance of test results independent of adjuvant chemotherapy〔J〕.Anticancer Res, 1994,14：1371～ 1375.
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3 徐建明，汤仲明，宋三泰，等.人乳腺癌原代培养体外药敏试验的评价〔J〕.中华肿瘤杂志，1995，17：100.
4 徐建明，宋三泰，汤仲明，等.MTT体外药敏试验指导下的乳癌预见性化疗〔J〕.中华肿瘤杂志，1997，19：153.
5 江泽飞，宋三泰，徐建明，等.局部晚期乳癌新辅助化疗.中国实用外科杂志，1997，12：717.
6 杨树勤.百分位数〔A .中国医学百科全书编辑委员会主编.中国医学百科全书〔M〕.医学统计学分册.第1版.上海：上海科学技术出版社，1985：15.
7 Wilson JK, Sargent JM, Eligie AW,et al. A feasibility study of the MTT assay for chemosensitivity testing in ovarian malignancy〔J〕. Br J Cancer，1990, 62：189.
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8 Saikawa Y, Kubota T, Furukawa T, et al.Single-cell suspension assay with an MTT end point is useful for evaluating the optimal adjuvant chemotherapy for advanced gastric cancer〔J〕. Jpn J Cancer Res,1994,85： 762.
9 Mirski SF, Gerlach JH, Cole SP.Multidrug resistance in a human small cell lung cancer cell line selected in adriamycin〔J〕. Cancer Res,1987,47：2594.
10 徐建明，宋三泰，汤仲明，等.乳腺癌多药抗药相关药物的体外敏感性与mdr-1基因表达的关系〔J〕.中华医 学杂志，1997，77：371., 百拇医药
单位：军事医学科学院附属医院(北京，100039) △军事医学科学院放射医学研究所(北京，100850)
关键词：人乳腺癌细胞；MTT比色法；药物敏感性；评价标准
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【摘要】目的：建立人乳腺癌细胞体外药敏评价标准，预测乳癌病人的化疗疗效。方法：应用MTT试验，检测175例原代乳腺癌细胞对8种化疗药物的敏感性，采用Logistic程序对药物敏感性的指标进行分析。结果：如果Imax%>(瘤群Imax%均数+标准差)，说明药物的抑制作用较弱，临床不能应用该药；如果Imax%≤(瘤群Imax%均数+标准差)药物的抑制作用较强，可以进一步考证其IC50。IC50≤Q50，即小于本组瘤群IC50的中位值，则判定该例乳腺癌对药物相对敏感，反之则为相对耐药。结论：联合应用Imax%和IC50的药敏评价标准，能较客观地反映人乳腺癌细胞体外的药物敏感性，有利于预测乳癌病人的化疗疗效。
, 百拇医药
中图号：R737.9 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)03-0260-03
Studies of evaluable criteria for in vitro chemosensitivity
using MTT assay in human breast cancer cells
XU Jian-ming, SONG San-tai, TANG Zhong-ming,et al
Beijing 307 Hospital, Cancer Center,Beijing 100039,China
【Abstract】 Objective：To establish evaluable criteria of in vitro chemosensitivity for predicting clinical response of chemotherapy in breast cancer patients.Methods：The chemosensitivity of 175 human breast cancers to 8 antitumor drugs was measured by MTT assay,respectively and the Imax% and IC50 by logistic analysis of the dose-response curve was evaluated.Results：If Imax% >mean Imax%+SD which was obtained from the Imax%s of tumor samples, the drug was ineffective to this tumor sample.If the Imax% ≤ mean Imax%+SD,the cytotoxicity was greater. Then we would compare its IC50 with the value of Q50 which was used as cut-off between sensitivity and resistance.If its IC50≤the value of Q50,this tumor sample was relatively sensitive to the drug.Otherwise,it was resistant to the drug. Conclusion：The evaluable criteria which were first determined by Imax% and IC50 form Chinese breast cancer tissues may objectively predict the in vitro chemosensitivity. It makes this assay feasible for directing chemotherapy to breast cancer patients.
, 百拇医药
Key words： Breast neoplasms;MTT colorimetry;Chemosensitivity;Criteria
近年来，MTT法的药敏试验在肿瘤预见性化疗中的作用逐渐为大家所接受〔1，2〕，但是，药敏评价体系还存在诸多缺点。为此，我们曾研究分析过32例乳腺癌MTT试验的药敏指标，初步形成了乳腺癌的体外药物敏感性评价标准〔3〕。目前，共积累175例乳腺癌标本的药敏数据，结合临床疗效的反馈信息〔4，5〕，重新修订评价标准，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、培养液及仪器见文献〔3〕
1.2抗肿瘤药物
选阿霉素(ADM)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、长春新碱(VCR)、氨甲喋呤(MTX)、顺铂(DDP)、卡铂(CBP)、米托蒽醌(Mx)、长春花碱酰胺(VDS)等8种。所有药物先用磷酸盐缓冲液(PBS)配成母液，-20℃贮存，测试前各种药物都用培养液稀释成6个梯度浓度。因为环磷酰胺(CTX)在体外无活性，需经体内肝微粒体酶和细胞色素P-450作用，氧化、裂环成醛磷酰胺，才能对肿瘤细胞起到杀伤作用，因此，该药不宜用作体外药敏测定。
, http://www.100md.com
1.3 标本来源及处理
175例标本均为本院及外院手术切除的新鲜乳腺癌组织，其中，原发癌84例，复发转移癌91例。先行肿瘤印片细胞学检查，以鉴别组织的细胞学性质。细胞悬液的制备见文献〔3〕。
1.4 MTT药敏试验方法见文献〔3〕
1.5 药物体外敏感性的评价指标
由于药物抑制作用与药物浓度的关系表现为乙状Logistic函数，故通过计算机采用Logistic函数程序，对高达6个梯度浓度的大跨度多点作用的量效曲线进行综合估算〔3〕。
1.6 统计学方法
以矩法计算药敏指标的偏度系数和峰度系数，并进行正态性检验。对正态分布者，计算其均数±标准差；对偏态分布者，则求百分位数值〔6〕。
, 百拇医药
2 结果
2.1 同一药物对不同乳腺癌抑制程度Imax%的差异及其分布特点。
Imax%(Survivalrateatmaximalinhibition)代表了化疗药物达到最大抑制时，残存肿瘤细胞的存活率。Imax%越大，表示残存的肿瘤细胞越多，药物的抑制程度越小。不同病人及不同药物之间的Imax%存在差异。表1列出了本组瘤群中，8种化疗药物抑制作用最强、中等和最弱各5例的Imax%值。结果表明同一药物对大多数病例的Imax%值有所不同。一般相差1～2个数量级，CBP相差最大也仅1000倍(3个数量级)，而5-U则在同一级的水平。通过Imax%分布的矩法正态性检验，8种化疗药物对瘤群的Imax%都呈正态分布，偏离常态检验P>0.05(表2)。
表1 8种化疗药物达到最大抑制时残存原代乳腺癌细胞存活率(Imax%)的差异
, 百拇医药
百分位数
ADM
5-FU
VCR
MTX
DDP
CBP
Mx
VDS
例号
Imax%
例号
Imax%
, http://www.100md.com
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
例号
Imax%
Q1
, http://www.100md.com
59
0.1
108
10.9
130
4.2
55
0.5
36
0.1
117
0.1
174
, http://www.100md.com
2.4
56
4.6
62
1.0
140
12.9
95
4.9
144
3.5
111
5.9
, http://www.100md.com
58
7.9
88
6.6
58
8.6
90
2.7
64
18.0
80
5.1
147
, 百拇医药 5.5
66
9.6
111
9.0
128
7.1
108
10.1
156
6.7
122
19.3
, 百拇医药 129
13.0
111
6.6
108
9.6
112
9.9
148
9.3
65
11.1
116
, 百拇医药 6.8
166
19.5
143
15.9
108
10.6
89
10.1
32
10.0
82
10.5
, 百拇医药
117
11.9
Q50
170
35.3
117
42.5
15
40.8
30
45.0
163
31.4
, 百拇医药
152
37.1
122
32.3
138
30.8
34
35.7
114
42.5
171
40.9
94
, http://www.100md.com
45.0
117
32.2
44
37.2
154
32.8
148
30.8
151
35.7
26
42.9
, 百拇医药
123
42.1
64
45.1
146
32.2
88
37.6
161
33.1
104
30.9
50
, 百拇医药
35.8
163
43.0
154
42.9
120
45.7
161
32.2
133
37.6
29
33.5
, 百拇医药
123
30.9
71
35.9
17
43.1
124
43.1
28
46.0
151
32.4
105
, 百拇医药
38.5
64
34.4
120
31.5
Q100
131
76.7
156
81.5
21
79.0
59
, 百拇医药
85.0
18
72.7
38
77.2
88
82.2
149
69.1
155
79.8
11
82.6
, 百拇医药
5
79.8
32
86.2
9
76.9
13
77.5
85
83.5
118
75.9
10
, 百拇医药
81.3
13
83.4
115
81.6
87
88.9
13
77.4
175
92.5
121
85.6
, 百拇医药
175
78.3
36
90.0
114
86.7
38
85.0
5
89.9
175
88.0
21
, 百拇医药
100
175
87.0
159
79.9
118
93.3
36
95.0
36
88.0
175
90.0
, 百拇医药
159
90.1
23
100
168
89.3
145
80.7
注：每种化疗药都有175例标本。表内仅显示药物达最大作用的抑制是严重、抑制中等、和抑制最轻微的各5例。Q1～Q100分别代表百分位数中第1～100位。表2 175例乳腺癌病人药物达到最大抑制时残存肿瘤细胞的存活率(Imax%)的分布
药物
, http://www.100md.com Imax%
±sImax%
矩法正态性检验
Q25
Q50
Q75
峰度系数*
ugl
P
偏度系数Δ
, 百拇医药
ugl
P
VDS
30.1±13.4
26.0
30.9
47.0
0.20
<0.01
-0.33
>0.05
DDP
30.8±17.1
, 百拇医药
22.2
32.2
47.5
0.72
<0.01
0.33
>0.05
Mx
32.7±17.3
19.8
33.1
48.3
1.26
, 百拇医药
>0.05
0.25
>0.05
ADM
35.8±17.4
23.7
35.7
48.4
0.60
>0.05
0.27
>0.05
CBP
, http://www.100md.com
37.7±12.8
24.5
37.6
49.2
0.65
<0.01
0.29
>0.05
VCR
44.5±17.3
30.5
42.1
59.8
, 百拇医药
-0.19
>0.05
-0.26
>0.05
MTX
45.2±16.8
30.1
45.1
60.4
0.001
>0.05
-0.32
>0.05
, 百拇医药
5-FU
46.4±5.9
34.5
42.9
61.6
0.10
>0.05
-0.23
>0.05
※峰度系数等于0为正态峰；大于0为尖峭峰；小于0为平阔峰。
Δ偏度系数等于0为对称峰；大于0为正偏态峰；小于0为负偏态峰。
2.2 不同乳腺癌对同一药物的敏感性IC50的差异及其分布特点
, 百拇医药
我们以药物达到最大的抑制作用一半时，所需的药物浓度IC50(50%inhibitionconcentration)，来表示乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。IC50越小，表示肿瘤细胞对化疗药物的敏感性越大；反之则表示敏感性越小。表3列出了本组乳腺癌中，对8种化疗药最敏感、中度敏感及最不敏感各5例的IC50值。结果表明不同乳腺癌对同一药物的敏感性差异甚远，一般相差4～5个数量级，DDP竟高达10倍，而相差最小的Mx也在3个数量级。这与临床常见的，不同病人采用同一剂量的药物治疗，效果悬殊很大是相符合的。IC50分布经矩法正态性检验均呈偏移峰型分布，偏离常态检验P<0.001(表4)。
表3 药物达到最大抑制作用一半时所需药物浓度(IC50)的差异
百分
位数
ADM
, http://www.100md.com
5-FU
VCR
MTX
DDP
CBP
Mx
VDS
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
, 百拇医药
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
例号
IC50
Q1
107
, http://www.100md.com
1.5×10-9
15
2.3×10-8
1
1.2×10-9
141
3.2×10-8
141
6.7×10-9
128
1.5×10-8
, 百拇医药
170
1.2×10-8
149
2.0×10-10
135
6.6×10-9
10
3.1×10-8
24
1.5×10-9
51
, 百拇医药
4.5×10-8
172
8.3×10-9
18
2.0×10-8
90
1.4×10-8
172
7.0×10-10
172
2.3×10-8
, 百拇医药
7
4.6×10-8
131
1.6×10-9
26
4.8×10-8
128
2.1×10-8
172
2.0×10-8
162
, http://www.100md.com
1.6×10-8
111
1.2×10-9
133
2.9×10-8
141
5.2×10-8
11
3.3×10-9
27
4.9×10-8
, http://www.100md.com
126
2.2×10-8
79
2.0×10-8
88
1.6×10-8
135
1.2×10-9
91
3.8×10-8
1
, http://www.100md.com 8.2×10-8
19
3.3×10-9
44
5.2×10-8
109
3.1×10-8
166
2.3×10-8
118
1.8×10-8
, http://www.100md.com
174
1.3×10-9
Q50
121
1.9×10-7
101
6.1×10-7
146
7.6×10-8
63
3.5×10-7
, 百拇医药
57
6.8×10-7
94
6.7×10-8
12
1.1×10-7
97
7.4×10-9
122
1.9×10-7
148
, 百拇医药
6.1×10-7
165
7.7×10-8
31
3.6×10-7
4
6.9×10-7
129
7.0×10-8
167
1.2×10-7
, 百拇医药
80
7.6×10-9
162
1.9×10-7
28
6.2×10-7
148
7.8×10-8
16
4.2×10-7
115
, 百拇医药
7.3×10-7
70
7.4×10-8
71
1.2×10-7
153
7.7×10-9
88
2.0×10-7
465
6.3×10-7
, 百拇医药
23
8.0×10-8
2
4.3×10-7
125
7.4×10-7
86
7.4×10-8
89
1.2×10-7
104
, http://www.100md.com 7.8×10-9
97
2.0×10-7
97
6.4×10-7
80
8.0×10-8
24
4.3×10-7
90
7.7×10-7
, 百拇医药
90
7.5×10-8
175
1.3×10-7
168
7.9×10-8
Q100
46
2.4×10-5
74
2.1×10-5
, 百拇医药
147
1.3×10-5
55
2.2×10-5
124
8.3×10-5
28
7.9×10-5
78
3.1×10-7
159
, 百拇医药
7.9×10-7
59
3.4×10-5
3
2.4×10-5
39
2.0×10-5
23
2.2×10-5
43
1.2×10-4
, 百拇医药
6
5.3×10-4
74
3.7×10-7
175
1.1×10-6
74
7.0×10-5
114
6.7×10-5
106
, 百拇医药
3.8×10-5
13
2.2×10-4
28
1.5×10-4
14
2.7×10-3
121
3.9×10-7
59
1.2×10-6
, 百拇医药
62
7.9×10-5
28
8.0×10-5
36
1.1×10-4
59
2.2×10-4
23
2.2×10-4
21
, 百拇医药 2.7×10-3
177
3.3×10-8
74
4.8×10-6
36
1.7×10-4
36
7.7×10-4
38
1.1×10-4
, 百拇医药
45
2.2×10-4
6
2.6×10-3
23
2.7×10-3
58
1.9×10-5
117
1.1×10-6
注：每种化疗药都有175例标本，表内仅显示最敏感，中度敏感和最抗药的各5例。
, 百拇医药
Q1～Q100分别代表百分位数中第1～100位。药物浓度：毫克分子数/毫升
表4 175例乳腺癌病人药物达到最大抑制作用一半时所需药物浓度(IC50)的分布
药物
IC50
±sIC50
矩法正态性检验
Q25
Q50
, 百拇医药 Q75
峰度系数*
ugl
P
偏度系数Δ
ugl
P
VDS
1.3±9.3×10-7
4.2×10-9
7.7×10-9
, http://www.100md.com
1.5×10-8
10.6
<0.01
120.6
<0.01
Mx
1.8±15.0×10-7
7.0×10-8
1.2×10-7
1.8×10-7
40.4
, 百拇医药
<0.01
23.2
<0.01
VCR
2.0±12.0×10-6
2.9×10-8
7.8×10-8
2.2×10-7
8.3
<0.01
70.5
, 百拇医药
<0.01
ADM
2.9±15.6×10-6
1.1×10-7
1.9×10-7
7.8×10-7
8.7
<0.01
86.4
<0.01
MTX
, 百拇医药
5.7±30.0×10-6
1.2×10-7
4.2×10-7
1.0×10-6
7.2
<0.01
45.7
<0.01
5-FU
7.0±58.4×10-6
3.2×10-7
, http://www.100md.com
6.2×10-7
1.5×10-6
12.9
<0.01
169.2
<0.01
DDP
2.0±21.0×10-5
2.2×10-7
7.3×10-7
2.5×10-6
, 百拇医药
13.0
<0.01
170.4
<0.01
CBP
5.2±35.0×10-5
1.4×10-7
7.4×10-6
2.5×10-6
7.4
<0.01
, 百拇医药
53.5
<0.01
*峰度系数等于0为正态峰；大于0为尖峭峰；小于0为平阔峰。Δ偏度系数等于0为称峰；大于0为正偏态峰；小于0为负偏态峰。药物浓度IC50：毫克分子数/毫升
2.3 MTT体外药敏试验药敏评价标准的建立
鉴于上述瘤群的Imax%呈正态分布的特点，本研究用Imax%均数+1个标准差表示药物抑瘤程度强弱的界线，大于此值者为抑制作用较弱的药物；小于或等于此值者为抑制作用较强的药物。结果表明(表2)，VDS、DDP、Mx、ADM的Imax%的均数明显小于MTX、VCR、5FU(P<0.01)，说明前者抑瘤作用比后者强，这一结果与临床常识相符合。而IC50表现偏态分布的特点，可将瘤群IC50按百分位数的方法分级，以其IC50的中位值Q50，作为判断个例肿瘤对药物敏感和抗药的界线。从而确定体外药物敏感性的评价标准：
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①Imax%>(瘤群Imax%均数+标准差)，说明在高浓度药物作用下，也难以抑制肿瘤细胞，故可排除临床应用的可能性。
②Imax%≤(瘤群Imax%均数+标准差)，说明该药在高浓度作用下，能够将肿瘤细胞抑制到较低水平。但该例肿瘤细胞对药物的敏感性如何，还需要进一步通过IC50来考证。如果患者IC50≤Q50(中位值)，则判定为对药物相对敏感，反之，则为相对耐药。
3 讨论
MTT体外药敏试验已开展多年，但是药物体外敏感性的评价尚无统一标准〔7〕。建立一个合理的评价体系，就能为临床肿瘤的预见性化疗提供客观的参考依据。以往MTT试验，都是以单点浓度药物作用下的抑制率，或者是药物达到最大抑制作用时的残存率作为评价指标，并人为划定以抑制50%或70%作为敏感和抗药界线〔8〕。但单点浓度随意性太大，各实验室之间无法比较。而最大抑制时的残存率，可能因药物浓度已大大超过患者所能达到的血浆药物浓度水平，难以指导临床应用。我们还发现，达到最大抑制作用后，不同病人细胞存活率的差别也并不十分明显，因此，很难判断其耐药程度。也有少数学者〔9〕以多点作用后的半数抑制浓度作为评价指标，但他们只是在针对同一细胞株的不同化疗药物之间进行比较，并没有临床实际应用价值。
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我们根据乳腺癌瘤群的药敏指标的实测数据，研究设计针对中国乳腺癌病人实际情况的评价系统。具体探索过程是，在研究初期曾以32例乳腺癌材料为基础，将其药敏指标Imax%及IC50，按数值大小排序，发现我国乳腺癌群体IC50呈偏态分布，初步建立了药敏评价标准〔3〕。目前我们通过累计175例病人的数据排序，发现Imax%呈正态分布，IC50仍保持偏态分布。再结合其中解救化疗的疗效反馈信息，修正了第一阶段的评价标准，并由此选药，使一组难治性病人获得出人预料的良好效果〔4，5〕，体外药敏与体内疗效的总符合率为79.5%〔4〕，在确定评价标准后，我们还分析了病人乳腺癌组织多药耐药基因md r-1表达水平与药敏指标Imax%及IC50的关系〔10〕，发现md r-1基因的表达水平与Imax%无关，而与IC50相关并具有统计学意义，再次证明国外学者单独应用Imax%判断药物敏感性的不合理性。
根据1983年以来MEDLINE等三个中英文医学、生物学光盘数据库的联机检索表明，本评价系统通过拟合大跨度多点作用的量效曲线，首次联合应用两个药敏指标。先经Imax%初筛，回答了该药能不能抑制肿瘤；然后再通过IC50，了解在多大浓度抑制肿瘤细胞。我们通过临床病例的积累，不断丰富Imax%及IC50的数据，使前者的均数及后者的中位数更加接近中国人群的实际情况。再通过临床治疗的反复印证〔4，5〕，使这些标准渐趋稳定成熟，而能在临床推广应用。
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收稿日期：1998-04-24；修回日期：1998-11-13
参考文献
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10 徐建明，宋三泰，汤仲明，等.乳腺癌多药抗药相关药物的体外敏感性与mdr-1基因表达的关系〔J〕.中华医 学杂志，1997，77：371., 百拇医药