基因诊断技术在致龋菌检测中的应用
作者：康雪梅 王晓萍 冯维佳 于景翠 路娟 刘彦 王柏秋 傅松滨
单位：康雪梅 王晓萍(哈尔滨市第一医院，150010)；冯维佳(哈尔滨市第四医院，150026)；路娟(哈医大第一附属医院，150001)；于景翠 刘彦 王柏秋 傅松滨(哈医大医学遗传学研究室，150086)
关键词：
中国地方病学杂志990312 龋病被WHO列为三个重点防治疾病之一。龋病的主要致龋菌为变形链球菌(Streptococcus mutans)属兼性厌氧或微需氧菌，本菌被公认是龋病的主要致病菌，其致龋机制在于该菌能利用宿主口腔中的蔗糖合成葡聚糖，其中一部分为不溶于水的葡聚糖，这种多糖是牙菌斑的主要成份。变链菌可代谢这些多糖产生各种酸，从而使牙齿造成破坏[1]。在我国龋病的发病率为40%左右，其主要病原菌—变链菌的检测日益受到人们的关注，传统的病原微生物学检测方法，一般依据细菌的形态，生理生化特性及免疫血清分型，不但准确性差而且费时。
, 百拇医药
近年来迅速发展起来一门崭新的PCR检测技术，即DNA体外扩增技术，它是DNA技术的又一个突破。在遗传病诊断，微生物和其它癌变的检测以及分子生物学研究等许多领域得到了迅速、广泛的应用。PCR技术可在很短时间内将微量DNA选择片断进行扩增，被应用于一般实验手段难以解决病原学的检测和研究中。但在我国变链菌的PCR试剂盒制备和用PCR技术检测变链菌未见报道，我们用标准变链菌种提取特异性DNA片段制备试剂盒，用试剂盒对其所采集的样本进行检测，方法及结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 PCR(PTC-200)扩增仪，变形链球菌C标准冻干菌种，DNA耐热核酸酶，溶菌酶，DYY-Ⅲ8型电泳仪。
1.2 标本材料 患者主要来自我院门诊就诊病人及市政府第一幼儿园儿童。口腔内龋患为五颗以上牙齿(包括五颗者)为高发人群，口腔内二颗牙齿以下龋齿者为对照组，前组为106人，后组为82人，用已消毒的器械取易发龋处窝沟，邻面的菌斑及软垢或龋坏处的腐质，放入无菌试管中置于-4℃冻存(或-18℃冰箱中冻存)。
, 百拇医药
1.3 变链菌试剂盒的制备
1.3.1 变链菌液的制备：取0.2ml无菌生理盐水以无菌手续加入到变形链球菌标准冻干菌种管中，待溶解后取一接种环状溶解物接种于羊血平板，置35℃的CO2培养箱中培养48小时，菌落形态为圆形，灰白色不透明略干燥，有不完全溶血，菌体形态为革兰氏阳性链球菌。将纯化后细菌用VITEK微生物自动分析仪鉴定，结果为变形链球菌，然后将平板上菌落接种于TSD(乳酪消化大豆冻肉汤)中，置35℃CO2培养箱中培养48小时，呈均匀混浊生长的菌液。
1.3.2 纯菌DNA提取：取菌液1.5mlEppendorf管中离心，10000g10min多次收集使菌达到一定量。弃上清液，加入1×TAE(Tris-乙酸)及EDTA200μl,溶菌酶40μl(5mg/ml),混匀37℃水浴1小时，再加入10%SDS200μl,蛋白酶K40μl(10mg/ml),37℃恒温水浴过夜，酚、氯仿抽提，冰乙醇沉淀，75%乙醇清洗，TE缓冲液溶解，获得DNA。
, http://www.100md.com
1.4 标本DNA提取 将标本加入400μl生理盐水中吹打成悬浊液1000g离心，去杂质，弃上清液加入20μl溶菌酶，40μl1×TAE，37℃水浴1小时，再加入变链菌lysisbuffer100℃煮沸10min,12000g离心，上清作PCR。
1.5 PCR扩增 30μl体系，ddHO2(双蒸水)10μl，10×buffer3μl,4×dNTP1.2μl(2.5mmol/ul),引物各1.2μl(10mmol/μl),模板DNA5μl，Tab酶2u,放置在PCR仪上，94℃预变性5分钟后，94℃2min,55℃1min,72℃2min扩增30个循环，最后72℃延伸10min。
1.6 PCR产物的检测 PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶50V恒压电泳，应用凝胶成像系统分析，阳性产生1Kb特异带和0.5Kb的特异带，阴性对照不产生特异带。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com
变链菌是人类口腔中常见并与龋病有关的细菌，其四种抗原中，抗原Ⅰ/Ⅱ具有重要意义，它位于细胞表面，是免疫显性抗原，可诱导血清IgG抗体生成和口腔中分泌型IgA生成及调动T辅助细胞，T抑制细胞的功能，因而通过分子生物学技术对该抗原结构基因进行检测，可实现对变链菌可靠的诊断[2～5]。Kelly按照变链菌的NG5株抗原Ⅰ/Ⅱ核苷酸序3985～4002及MT8148核苷酸序5151～5170，设计CAAATGGGACAAACAGGC和AAGGCAGTGCGAAGTACC一对引物，应用PCR方法扩增出抗原结构基因中包含SpaP3′区的长1Kb的片断[6]。另外一对引物依照NG5株核苷酸序1965～1981和2454～2470设计，序列为GCTTCTGCTTATACAGG和GGAAGATTAACGGCACG，PCR扩增出0.5kbDNA片段[7]。本实验应用以上两对引物分别对标准变链菌，无龋病和高发龋病人菌斑、软垢及龋坏处的软化牙本质进行PCR扩增检测，标准菌应用溶菌酶破坏细胞壁，PK消化的方法提取DNA所提菌体DNA经琼脂糖电泳检测，产量和特异性良好PCR扩增得到了清晰的1Kb和0.5Kb特异片段。对106例高发龋病患者检测有43例产生阳性片段，相对无龋病患者82例产生了3例阳性。检测数据经统计学分析如下：
, http://www.100md.com
高发龋病患者及无龋患者PCR检测结果 PCR检测结果
高龋患者
无龋患者
合计
+
-
合计
43
63
106
3
79
82
, 百拇医药
46
142
188
阳性符合率93.5%，阴性符合率55.6%，假阳性率3.6%，假阴性率33.5%。特异性为93.34%，准确度为64.89%。PCR方法近年来逐渐成为疾病检测中快速简便的手段，它有着较高的分辨率和敏感度，而同时该方法一直有假阳性和假阴性的问题存在，究其原因有标本取材不足，污染及PCR操作不严格等几方面，本实验中检出率不理想的主要原因为取材方面的限制，即标本取材量少及患者本身的机体和口腔状态，含菌量低(小于4～40CFU的最低分辨率)[8]及位置较难控制所致。所以取材方面的进一步完善以及体外增菌技术的应用将有助于PCR方法尽快应用于临床变链菌及龋病的检测。
基金来源：哈尔滨市科委科技计划项目
作者简介：康雪梅，女，1955年生，副主任医师，学士
4 参考文献
[1] Russell RRB.The application of molecular genetics to micro biology of dental caries[J].Caries Res,1994,28(1):69～72
以下略
*收稿日期：1998-10-05；修订日期：1999-03-01, 百拇医药
单位：康雪梅 王晓萍(哈尔滨市第一医院，150010)；冯维佳(哈尔滨市第四医院，150026)；路娟(哈医大第一附属医院，150001)；于景翠 刘彦 王柏秋 傅松滨(哈医大医学遗传学研究室，150086)
关键词：
中国地方病学杂志990312 龋病被WHO列为三个重点防治疾病之一。龋病的主要致龋菌为变形链球菌(Streptococcus mutans)属兼性厌氧或微需氧菌，本菌被公认是龋病的主要致病菌，其致龋机制在于该菌能利用宿主口腔中的蔗糖合成葡聚糖，其中一部分为不溶于水的葡聚糖，这种多糖是牙菌斑的主要成份。变链菌可代谢这些多糖产生各种酸，从而使牙齿造成破坏[1]。在我国龋病的发病率为40%左右，其主要病原菌—变链菌的检测日益受到人们的关注，传统的病原微生物学检测方法，一般依据细菌的形态，生理生化特性及免疫血清分型，不但准确性差而且费时。
, 百拇医药
近年来迅速发展起来一门崭新的PCR检测技术，即DNA体外扩增技术，它是DNA技术的又一个突破。在遗传病诊断，微生物和其它癌变的检测以及分子生物学研究等许多领域得到了迅速、广泛的应用。PCR技术可在很短时间内将微量DNA选择片断进行扩增，被应用于一般实验手段难以解决病原学的检测和研究中。但在我国变链菌的PCR试剂盒制备和用PCR技术检测变链菌未见报道，我们用标准变链菌种提取特异性DNA片段制备试剂盒，用试剂盒对其所采集的样本进行检测，方法及结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 PCR(PTC-200)扩增仪，变形链球菌C标准冻干菌种，DNA耐热核酸酶，溶菌酶，DYY-Ⅲ8型电泳仪。
1.2 标本材料 患者主要来自我院门诊就诊病人及市政府第一幼儿园儿童。口腔内龋患为五颗以上牙齿(包括五颗者)为高发人群，口腔内二颗牙齿以下龋齿者为对照组，前组为106人，后组为82人，用已消毒的器械取易发龋处窝沟，邻面的菌斑及软垢或龋坏处的腐质，放入无菌试管中置于-4℃冻存(或-18℃冰箱中冻存)。
, 百拇医药
1.3 变链菌试剂盒的制备
1.3.1 变链菌液的制备：取0.2ml无菌生理盐水以无菌手续加入到变形链球菌标准冻干菌种管中，待溶解后取一接种环状溶解物接种于羊血平板，置35℃的CO2培养箱中培养48小时，菌落形态为圆形，灰白色不透明略干燥，有不完全溶血，菌体形态为革兰氏阳性链球菌。将纯化后细菌用VITEK微生物自动分析仪鉴定，结果为变形链球菌，然后将平板上菌落接种于TSD(乳酪消化大豆冻肉汤)中，置35℃CO2培养箱中培养48小时，呈均匀混浊生长的菌液。
1.3.2 纯菌DNA提取：取菌液1.5mlEppendorf管中离心，10000g10min多次收集使菌达到一定量。弃上清液，加入1×TAE(Tris-乙酸)及EDTA200μl,溶菌酶40μl(5mg/ml),混匀37℃水浴1小时，再加入10%SDS200μl,蛋白酶K40μl(10mg/ml),37℃恒温水浴过夜，酚、氯仿抽提，冰乙醇沉淀，75%乙醇清洗，TE缓冲液溶解，获得DNA。
, http://www.100md.com
1.4 标本DNA提取 将标本加入400μl生理盐水中吹打成悬浊液1000g离心，去杂质，弃上清液加入20μl溶菌酶，40μl1×TAE，37℃水浴1小时，再加入变链菌lysisbuffer100℃煮沸10min,12000g离心，上清作PCR。
1.5 PCR扩增 30μl体系，ddHO2(双蒸水)10μl，10×buffer3μl,4×dNTP1.2μl(2.5mmol/ul),引物各1.2μl(10mmol/μl),模板DNA5μl，Tab酶2u,放置在PCR仪上，94℃预变性5分钟后，94℃2min,55℃1min,72℃2min扩增30个循环，最后72℃延伸10min。
1.6 PCR产物的检测 PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶50V恒压电泳，应用凝胶成像系统分析，阳性产生1Kb特异带和0.5Kb的特异带，阴性对照不产生特异带。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com
变链菌是人类口腔中常见并与龋病有关的细菌，其四种抗原中，抗原Ⅰ/Ⅱ具有重要意义，它位于细胞表面，是免疫显性抗原，可诱导血清IgG抗体生成和口腔中分泌型IgA生成及调动T辅助细胞，T抑制细胞的功能，因而通过分子生物学技术对该抗原结构基因进行检测，可实现对变链菌可靠的诊断[2～5]。Kelly按照变链菌的NG5株抗原Ⅰ/Ⅱ核苷酸序3985～4002及MT8148核苷酸序5151～5170，设计CAAATGGGACAAACAGGC和AAGGCAGTGCGAAGTACC一对引物，应用PCR方法扩增出抗原结构基因中包含SpaP3′区的长1Kb的片断[6]。另外一对引物依照NG5株核苷酸序1965～1981和2454～2470设计，序列为GCTTCTGCTTATACAGG和GGAAGATTAACGGCACG，PCR扩增出0.5kbDNA片段[7]。本实验应用以上两对引物分别对标准变链菌，无龋病和高发龋病人菌斑、软垢及龋坏处的软化牙本质进行PCR扩增检测，标准菌应用溶菌酶破坏细胞壁，PK消化的方法提取DNA所提菌体DNA经琼脂糖电泳检测，产量和特异性良好PCR扩增得到了清晰的1Kb和0.5Kb特异片段。对106例高发龋病患者检测有43例产生阳性片段，相对无龋病患者82例产生了3例阳性。检测数据经统计学分析如下：
, http://www.100md.com
高发龋病患者及无龋患者PCR检测结果 PCR检测结果
高龋患者
无龋患者
合计
+
-
合计
43
63
106
3
79
82
, 百拇医药
46
142
188
阳性符合率93.5%，阴性符合率55.6%，假阳性率3.6%，假阴性率33.5%。特异性为93.34%，准确度为64.89%。PCR方法近年来逐渐成为疾病检测中快速简便的手段，它有着较高的分辨率和敏感度，而同时该方法一直有假阳性和假阴性的问题存在，究其原因有标本取材不足，污染及PCR操作不严格等几方面，本实验中检出率不理想的主要原因为取材方面的限制，即标本取材量少及患者本身的机体和口腔状态，含菌量低(小于4～40CFU的最低分辨率)[8]及位置较难控制所致。所以取材方面的进一步完善以及体外增菌技术的应用将有助于PCR方法尽快应用于临床变链菌及龋病的检测。
基金来源：哈尔滨市科委科技计划项目
作者简介：康雪梅，女，1955年生，副主任医师，学士
4 参考文献
[1] Russell RRB.The application of molecular genetics to micro biology of dental caries[J].Caries Res,1994,28(1):69～72
以下略
*收稿日期：1998-10-05；修订日期：1999-03-01, 百拇医药