潜慢型克山病患者柯萨奇B组病毒特异性IgM的检测
作者：邱芬 徐仓宝 宋鸿彬 刘作功 王亚文
单位：邱芬(西安医科大学学报编辑部，西安710061)；徐仓宝宋鸿彬刘作功王亚文(西安医科大学卫生部微量元素与地方病重点实验室，西安710061)
关键词：克山病；柯萨奇B组病毒；抗体
中国地方病学杂志990318 【摘要】 目的 研究柯萨奇B组病毒(Coxsackie virus B,CVB)感染与克山病发病的关系。方法 采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)对陕西省黄陵县克山病病区潜、慢型克山病患者血清CVB1-6IgM和CVB1-6IgG进行检测。结果 ①潜在型、慢型克山病组血清CVB1-6IgM抗体阳性率明显高于非病区健康对照组(28.57%vs7.5%,P<0.05)，但明显低于心肌炎组(60.00%，P<0.05)。②潜、慢型克山病组血清CVB1-6IgG抗体阳性率明显高于非病区健康对照组(38.10%vs7.5%,P<0.05)，但与心肌炎组比较无明显差异。结论 病区潜、慢型克山病患者有CVB感染存在。
, 百拇医药
分类号：R542.3 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)03-0209-11
Detection of Coxsackievirus B specific IgM of the latent-chronic K eshan disease patients
QIU Fen,XU Cangbao,SONG Hongbin,et al.
Research Lab. of Trace Elements and Endemic Diseases,Xi'an Medical University 710061
【Abstract】 Objective To study the relationship betw een the infection of Coxsackievirus B (CVB) and the origin of Keshan disease.Methods The latent-chronic Keshan disease patients from Huangling county of Shaanxi province were investigated,and the sensitive and s pecific enzyme linked immunoassay (ELISA) was used to detect CVB1～6 IgM and CVB1 ～6IgG in the sera from the patients.Results ①The CVB1～6 IgM antibody positive rate in late nt-chronic Keshan disease patients was significantly higher than that of contro l group from non-endemic area (28.57% vs 7.5%,P<0.05),but significantly l ower than that of myocarditis patients (28.57% vs 60.00%,P<0.05);②The lat ent-chronic Keshan disease group serum antibody CVB1～6 IgG positive rate was si gnificantly higher than that of control group,but no significant difference comp ared to myocarditis group.Conclusions The infection of CVB exists in endemic area of latent-chronic Keshan disease.
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【Key words】 Keshan disease Coxsackievirus B An tibody
黄陵县是陕西省克山病重发病县之一。近年来病情监测统计结果表明，随着硒预防和生活水平的提高，急型、亚急型病例很少，但仍有新发潜在型和慢型病例[1]。故潜、慢型克山病已成为目前研究和防治的重点。近年运用分子杂交技术研究显示，亚急型和慢型克山病患者尸检心肌组织中存在柯萨奇B组病毒(CoxsackievirusB,CVB)RNA，但有关潜在型克山病患者CVB感染情况尚未见报道。本文采用ELISA法对陕西省黄陵县克山病病区潜、慢型克山病患者血清CVB特异性IgM和IgG进行检测，旨在探讨陕西潜、慢型克山病与CVB感染的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 潜、慢型克山病组：选择在陕西省黄陵县克山病病区的案角、腰坪、桃曲、厚子坪4个重病村居民及以往发现的94例潜在型和11例慢型克山病患者进行询问病史、查体、心电图及X线胸片检查，发现有新近心电图ST—T异常的潜、慢型克山病患者21例。其中男8例，女13例，年龄14～58岁，平均年龄(36.0±15.2)岁。潜在型18例，慢型3例，其中6例有急性发作史。以上病例均符合克山病诊断标准[2]。
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1.1.2 心肌炎组：为西安医科大学第一临床医学院住院的病毒性心肌炎患者共30例。男13例，女17例，年龄8～58岁，平均年龄(33.3±12.5)岁。
1.1.3 非病区健康对照组：为西安医科大学医院健康查体者，共40例。男20例，女20例，年龄17～58岁，平均年龄(35.3±12.8)岁。
1.2 仪器和试剂 DG—I酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)；柯萨奇B组病毒IgM试剂盒(上海科宇科技开发公司)；柯萨奇B组病毒IgG试剂盒(西安于鑫科技开发研究所)。
1.3 检测方法
1.3.1 血清CVB1～6IgM抗体检测：采用ELISA法。血清用标本稀释液作1∶160倍稀释，加入包被病毒抗原的PVC板中，每孔加100μl，同时设阳性、阴性和空白对照各两孔，置37℃孵育1.5h，倒去液体，加满洗涤液，重复洗3次，拍干。加酶标记抗IgM，每孔100μl，37℃1.5h，用洗涤液重复洗4次，拍干。加底物A液和B液按1∶1混合，每孔加100μl，37℃，15～30min(以阳性对照显色为准)，观察结果。结果判断：对照比色纸，阴性为无色或微带兰色，阳性为淡兰色或兰色。
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1.3.2 血清CVB1～6IgG抗体检测：采用ELISA法。用洗涤应用液稀释标本(1∶100倍)，加入包被病毒抗原的PVC板中，每孔加100μl，设阳性、阴性和空白对照各一孔(空白孔中只加洗涤应用液100μl)，置37℃，30min后弃掉血清，用洗涤应用液洗三次，每次3～5min，甩干。加酶标抗IgG,每孔2滴，空白孔只加洗涤应用液，置37℃，20min，然后弃掉酶结合物，洗板5次，拍干。加显色底物A、B液各1滴，置37℃，10min,加5μl2mol/LH2SO4终止反应。以空白对照孔调零点，测450nm下各孔OD值。结果以待检孔所得OD值(P)和阴性对照孔OD值(N)的比值为依据，当P/N≥2.1时，判为阳性。
1.3.3 统计学方法：采用χ2检验，以P<0.05为显著性水准。
2 结果
2.1 柯萨奇B组病毒IgM检测结果 见表1。
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表1 各组CVB1～6IgM检测结果 组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
潜、慢型克山病
心肌炎
非病区健康对照
21
30
40
6
18
3
, 百拇医药
28.57
60.00
7.5
注：χ2=22.659,P<0.05
由表1可见，潜、慢型克山病和心肌炎组CVB1～6IgM阳性率明显高于非病区健康对照组(χ2=4.98,P<0.05;χ2=22.5,P<0.05)，表明克山病患者确有近期CVB感染存在；潜、慢型克山病组明显低于心肌炎组(χ2=4.01,P<0.05)。
2.2 柯萨奇B组病毒IgG检测结果 见表2。
表2 各组CVB1～6IgG检测结果 组别
例数
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阳性例数
阳性率(%)
潜、慢型克山病
心肌炎
非病区健康对照
21
29
40
8
11
3
38.10
37.93
, 百拇医药
7.50
注：χ2=9.919,P<0.05
由表2可见，三组之间有明显差异。进一步做两两比较，结果潜、慢型克山病和心肌炎组与非病区健康对照组间有明显差异(χ2=9.26,P<0.05)，而潜、慢型克山病组与心肌炎组无明显差异(χ2=0.124,P>0.05)。
3 讨论
柯萨奇病毒属微核糖核酸病毒科，肠道病毒属。无囊膜、耐乙醚、20面体核衣壳，直径20～30nm，基因组为线状的片段、单股RNA，分子量为2.5×106。该病毒分为A、B两组，A组有1～24个血清型，B组有1～6个血清型。近年来研究表明，柯萨奇B组病毒(CVB)与人类心肌炎有关[3]，特别是CVB2、3、4、5型。CVB感染后可在咽部和肠粘膜细胞中增殖，然后由血流转入靶器官如心肌等组织。
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自60年代起，国内就有学者提出克山病发病可能和某些嗜心肌病毒有关，并从亚急型克山病患者早期血液和尸检心肌组织中分离出柯萨奇B1[4]、B2[5]、B3[6]、B4[7]和B5型病毒。血清学检测发现，亚急型克山病患者CVB1～6中和抗体呈4倍增高者达35%～70%，CVB1～6IgM抗体阳性率为66.9%。而有关潜在型克山病患者，特别是陕西克山病病区患者CVB感染情况尚未见报道。本文研究结果显示，潜、慢型克山病患者血清CVB1～6IgM阳性率明显高于非病区健康对照组，但明显低于心肌炎组。有研究表明，CVB1～6IgM特异性抗体第5天就能在体内检出，2～4周达高峰，一般持续6～8周，如有持续的抗原刺激，则持续时间更长，甚至达6年之久[8]。本组潜、慢型克山病患者CVB1～6IgM增高可能与其心肌中有CVB持续存在有关。与心肌炎组的差异推测可能与心肌炎患者处于病毒感染早期有关。本文CVB1～6IgG阳性率潜、慢型克山病组明显高于非病区健康对照组，但与心肌炎组相近，提示克山病患者CVB既往感染率较高。总之，本研究结果提示：陕西潜、慢型克山病在其发生和发展中可能有CVB感染存在。
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近年来，随着分子生物学技术的推广和应用，采用原位核酸杂交和套式PCR技术，对亚急型和慢型克山病尸检心肌组织中CVB-RNA进行检测，证实其心肌中存在CVB-RNA，其阳性率为60%～90%[9，10]，表明在克山病发生和发展中确有CVB感染的参与。这种感染在克山病发病中的确切作用还有待于进一步研究探讨。
基金来源：陕西省科委基金资助项目
作者简介：邱芬，女，1963年生，副编审
4 参考文献
[1] 刘作功，梁文升，张春明，等.1996年黄陵县克山病监测阶段小结[J].中国地方病防治杂志，1997，12(A)：44
[2] 克山病防治工作标准(试行)[S].中国地方病学杂志，1983，2(2)：115
, 百拇医药
[3] 顾国浩.柯萨奇B组病毒感染性心肌炎血清学分型及其临床意义[J].苏州医学院学报，1997，17(3)：419
[4] 重庆医学院微生物学教研组.从克山病病理标本分离培养病毒的初步报告[J].重庆医学院学报，1978，2(1)：1
[5] 汪国芹.克山病病人的病毒分离及其实验感染的研究[J].中国地方病防治杂志，1989，4(6)：339
[6] 张鸿源，孙利群，郑永晨，等.克山病同柯萨奇B组病毒关系的研究[J].中国地方病防治杂志，1987，2(1)：14
[7] 苏诚钦，龚春梅，李靖，等.克山病病毒病因研究初步总结[J].中华医学杂志，1979，59(8)：46
[8] 马官福，马连华，刘哲伟，等.测定病毒性心肌炎患儿柯萨奇B特异性IgM的病原学意义[J].中华儿科杂志，1996,34(1):29
[9] 钟学宽，张凤民，江自然，等.原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与云南亚急型克山病的关系[J].中国地方病学杂志，1993，12(4)：193
[10] 李延文，杨英珍，陈灏珠，等.克山病心肌蜡块标本的肠道病毒RNA的检测[J].中华医学杂志，1995，75(6)：344
*收稿日期：1998-11-18, 百拇医药
单位：邱芬(西安医科大学学报编辑部，西安710061)；徐仓宝宋鸿彬刘作功王亚文(西安医科大学卫生部微量元素与地方病重点实验室，西安710061)
关键词：克山病；柯萨奇B组病毒；抗体
中国地方病学杂志990318 【摘要】 目的 研究柯萨奇B组病毒(Coxsackie virus B,CVB)感染与克山病发病的关系。方法 采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)对陕西省黄陵县克山病病区潜、慢型克山病患者血清CVB1-6IgM和CVB1-6IgG进行检测。结果 ①潜在型、慢型克山病组血清CVB1-6IgM抗体阳性率明显高于非病区健康对照组(28.57%vs7.5%,P<0.05)，但明显低于心肌炎组(60.00%，P<0.05)。②潜、慢型克山病组血清CVB1-6IgG抗体阳性率明显高于非病区健康对照组(38.10%vs7.5%,P<0.05)，但与心肌炎组比较无明显差异。结论 病区潜、慢型克山病患者有CVB感染存在。
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分类号：R542.3 文献标识码：A 论文编号：1000-4955(1999)03-0209-11
Detection of Coxsackievirus B specific IgM of the latent-chronic K eshan disease patients
QIU Fen,XU Cangbao,SONG Hongbin,et al.
Research Lab. of Trace Elements and Endemic Diseases,Xi'an Medical University 710061
【Abstract】 Objective To study the relationship betw een the infection of Coxsackievirus B (CVB) and the origin of Keshan disease.Methods The latent-chronic Keshan disease patients from Huangling county of Shaanxi province were investigated,and the sensitive and s pecific enzyme linked immunoassay (ELISA) was used to detect CVB1～6 IgM and CVB1 ～6IgG in the sera from the patients.Results ①The CVB1～6 IgM antibody positive rate in late nt-chronic Keshan disease patients was significantly higher than that of contro l group from non-endemic area (28.57% vs 7.5%,P<0.05),but significantly l ower than that of myocarditis patients (28.57% vs 60.00%,P<0.05);②The lat ent-chronic Keshan disease group serum antibody CVB1～6 IgG positive rate was si gnificantly higher than that of control group,but no significant difference comp ared to myocarditis group.Conclusions The infection of CVB exists in endemic area of latent-chronic Keshan disease.
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【Key words】 Keshan disease Coxsackievirus B An tibody
黄陵县是陕西省克山病重发病县之一。近年来病情监测统计结果表明，随着硒预防和生活水平的提高，急型、亚急型病例很少，但仍有新发潜在型和慢型病例[1]。故潜、慢型克山病已成为目前研究和防治的重点。近年运用分子杂交技术研究显示，亚急型和慢型克山病患者尸检心肌组织中存在柯萨奇B组病毒(CoxsackievirusB,CVB)RNA，但有关潜在型克山病患者CVB感染情况尚未见报道。本文采用ELISA法对陕西省黄陵县克山病病区潜、慢型克山病患者血清CVB特异性IgM和IgG进行检测，旨在探讨陕西潜、慢型克山病与CVB感染的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 潜、慢型克山病组：选择在陕西省黄陵县克山病病区的案角、腰坪、桃曲、厚子坪4个重病村居民及以往发现的94例潜在型和11例慢型克山病患者进行询问病史、查体、心电图及X线胸片检查，发现有新近心电图ST—T异常的潜、慢型克山病患者21例。其中男8例，女13例，年龄14～58岁，平均年龄(36.0±15.2)岁。潜在型18例，慢型3例，其中6例有急性发作史。以上病例均符合克山病诊断标准[2]。
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1.1.2 心肌炎组：为西安医科大学第一临床医学院住院的病毒性心肌炎患者共30例。男13例，女17例，年龄8～58岁，平均年龄(33.3±12.5)岁。
1.1.3 非病区健康对照组：为西安医科大学医院健康查体者，共40例。男20例，女20例，年龄17～58岁，平均年龄(35.3±12.8)岁。
1.2 仪器和试剂 DG—I酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)；柯萨奇B组病毒IgM试剂盒(上海科宇科技开发公司)；柯萨奇B组病毒IgG试剂盒(西安于鑫科技开发研究所)。
1.3 检测方法
1.3.1 血清CVB1～6IgM抗体检测：采用ELISA法。血清用标本稀释液作1∶160倍稀释，加入包被病毒抗原的PVC板中，每孔加100μl，同时设阳性、阴性和空白对照各两孔，置37℃孵育1.5h，倒去液体，加满洗涤液，重复洗3次，拍干。加酶标记抗IgM，每孔100μl，37℃1.5h，用洗涤液重复洗4次，拍干。加底物A液和B液按1∶1混合，每孔加100μl，37℃，15～30min(以阳性对照显色为准)，观察结果。结果判断：对照比色纸，阴性为无色或微带兰色，阳性为淡兰色或兰色。
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1.3.2 血清CVB1～6IgG抗体检测：采用ELISA法。用洗涤应用液稀释标本(1∶100倍)，加入包被病毒抗原的PVC板中，每孔加100μl，设阳性、阴性和空白对照各一孔(空白孔中只加洗涤应用液100μl)，置37℃，30min后弃掉血清，用洗涤应用液洗三次，每次3～5min，甩干。加酶标抗IgG,每孔2滴，空白孔只加洗涤应用液，置37℃，20min，然后弃掉酶结合物，洗板5次，拍干。加显色底物A、B液各1滴，置37℃，10min,加5μl2mol/LH2SO4终止反应。以空白对照孔调零点，测450nm下各孔OD值。结果以待检孔所得OD值(P)和阴性对照孔OD值(N)的比值为依据，当P/N≥2.1时，判为阳性。
1.3.3 统计学方法：采用χ2检验，以P<0.05为显著性水准。
2 结果
2.1 柯萨奇B组病毒IgM检测结果 见表1。
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表1 各组CVB1～6IgM检测结果 组别
例数
阳性例数
阳性率(%)
潜、慢型克山病
心肌炎
非病区健康对照
21
30
40
6
18
3
, 百拇医药
28.57
60.00
7.5
注：χ2=22.659,P<0.05
由表1可见，潜、慢型克山病和心肌炎组CVB1～6IgM阳性率明显高于非病区健康对照组(χ2=4.98,P<0.05;χ2=22.5,P<0.05)，表明克山病患者确有近期CVB感染存在；潜、慢型克山病组明显低于心肌炎组(χ2=4.01,P<0.05)。
2.2 柯萨奇B组病毒IgG检测结果 见表2。
表2 各组CVB1～6IgG检测结果 组别
例数
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阳性例数
阳性率(%)
潜、慢型克山病
心肌炎
非病区健康对照
21
29
40
8
11
3
38.10
37.93
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7.50
注：χ2=9.919,P<0.05
由表2可见，三组之间有明显差异。进一步做两两比较，结果潜、慢型克山病和心肌炎组与非病区健康对照组间有明显差异(χ2=9.26,P<0.05)，而潜、慢型克山病组与心肌炎组无明显差异(χ2=0.124,P>0.05)。
3 讨论
柯萨奇病毒属微核糖核酸病毒科，肠道病毒属。无囊膜、耐乙醚、20面体核衣壳，直径20～30nm，基因组为线状的片段、单股RNA，分子量为2.5×106。该病毒分为A、B两组，A组有1～24个血清型，B组有1～6个血清型。近年来研究表明，柯萨奇B组病毒(CVB)与人类心肌炎有关[3]，特别是CVB2、3、4、5型。CVB感染后可在咽部和肠粘膜细胞中增殖，然后由血流转入靶器官如心肌等组织。
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自60年代起，国内就有学者提出克山病发病可能和某些嗜心肌病毒有关，并从亚急型克山病患者早期血液和尸检心肌组织中分离出柯萨奇B1[4]、B2[5]、B3[6]、B4[7]和B5型病毒。血清学检测发现，亚急型克山病患者CVB1～6中和抗体呈4倍增高者达35%～70%，CVB1～6IgM抗体阳性率为66.9%。而有关潜在型克山病患者，特别是陕西克山病病区患者CVB感染情况尚未见报道。本文研究结果显示，潜、慢型克山病患者血清CVB1～6IgM阳性率明显高于非病区健康对照组，但明显低于心肌炎组。有研究表明，CVB1～6IgM特异性抗体第5天就能在体内检出，2～4周达高峰，一般持续6～8周，如有持续的抗原刺激，则持续时间更长，甚至达6年之久[8]。本组潜、慢型克山病患者CVB1～6IgM增高可能与其心肌中有CVB持续存在有关。与心肌炎组的差异推测可能与心肌炎患者处于病毒感染早期有关。本文CVB1～6IgG阳性率潜、慢型克山病组明显高于非病区健康对照组，但与心肌炎组相近，提示克山病患者CVB既往感染率较高。总之，本研究结果提示：陕西潜、慢型克山病在其发生和发展中可能有CVB感染存在。
, http://www.100md.com
近年来，随着分子生物学技术的推广和应用，采用原位核酸杂交和套式PCR技术，对亚急型和慢型克山病尸检心肌组织中CVB-RNA进行检测，证实其心肌中存在CVB-RNA，其阳性率为60%～90%[9，10]，表明在克山病发生和发展中确有CVB感染的参与。这种感染在克山病发病中的确切作用还有待于进一步研究探讨。
基金来源：陕西省科委基金资助项目
作者简介：邱芬，女，1963年生，副编审
4 参考文献
[1] 刘作功，梁文升，张春明，等.1996年黄陵县克山病监测阶段小结[J].中国地方病防治杂志，1997，12(A)：44
[2] 克山病防治工作标准(试行)[S].中国地方病学杂志，1983，2(2)：115
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[3] 顾国浩.柯萨奇B组病毒感染性心肌炎血清学分型及其临床意义[J].苏州医学院学报，1997，17(3)：419
[4] 重庆医学院微生物学教研组.从克山病病理标本分离培养病毒的初步报告[J].重庆医学院学报，1978，2(1)：1
[5] 汪国芹.克山病病人的病毒分离及其实验感染的研究[J].中国地方病防治杂志，1989，4(6)：339
[6] 张鸿源，孙利群，郑永晨，等.克山病同柯萨奇B组病毒关系的研究[J].中国地方病防治杂志，1987，2(1)：14
[7] 苏诚钦，龚春梅，李靖，等.克山病病毒病因研究初步总结[J].中华医学杂志，1979，59(8)：46
[8] 马官福，马连华，刘哲伟，等.测定病毒性心肌炎患儿柯萨奇B特异性IgM的病原学意义[J].中华儿科杂志，1996,34(1):29
[9] 钟学宽，张凤民，江自然，等.原位核酸杂交法探讨柯萨奇B组病毒与云南亚急型克山病的关系[J].中国地方病学杂志，1993，12(4)：193
[10] 李延文，杨英珍，陈灏珠，等.克山病心肌蜡块标本的肠道病毒RNA的检测[J].中华医学杂志，1995，75(6)：344
*收稿日期：1998-11-18, 百拇医药
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