改良高效液相色谱测定尿中2-硫代噻唑烷-4-羧酸
作者：李阳 毕勇毅 谭晓东 王福元 汪春红 阎俊 苏拥军
单位：李阳 毕勇毅 谭晓东 王福元 汪春红 阎俊 苏拥军 (430071 武汉市 湖北医科大学卫生学教研室)
关键词：
改良高效液相色谱测定尿中2 二硫化碳(CS2)是生产粘胶纤维的重要原料，具有强烈的神经、心血管毒作用。自从Doorn等从CS2接触工人尿中分离并证实存在CS2代谢产物2-硫代噻唑烷-4-羧酸(2-thiothiazolidine-4-carboxylic acid，TTCA)以来，国内外众多学者都对TTCA的检测方法进行了探索。但直到目前为止，使用高效液相色谱法(HPLC)分析TTCA，尿样前处理均采用有机溶剂萃取法从尿中提取TTCA。这样做出的色谱图杂质峰较多，TTCA与杂质不能达到良好的基线分离，导致对TTCA定量分析的误差增大，方法检出限较高。用凝胶柱预分离后再用HPLC分离的方法[1]，虽然达到了基线分离，但此方法设备要求高，过程复杂，且回收率低、精密度差。
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我们采用了一种用乙醚和缓冲溶液两次提取尿中TTCA的前处理方法，消除了绝大部分杂质干扰，方法简单，分离效果好，是一种值得推广运用的简单实用的检测方法。
一、材料与方法
1.试剂：TTCA标准品(ALDRICH公司)、甲醇、冰乙酸、乙醚、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、中性氧化铝均为AR级，TTCA标准液5 mg/L，乙醚在每日临用前用中性氧化铝柱过滤1遍。
2.仪器：岛津LC-6A液相色谱仪、紫外可变波长检测器、旋涡混匀器、层析柱和Utrasphere ODS C18反相色谱柱。
3.测定方法：
(1)尿样处理：尿样经盐酸酸化后，用乙醚萃取其中TTCA，再用pH值7.2的磷酸缓冲溶液将TTCA从乙醚中反萃取出来，取溶有TTCA的缓冲溶液用于HPLC分析。
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(2)色谱条件：流动相为甲醇：冰乙酸：水＝4∶1∶95，流速1 ml/min,检测波长273 nm，柱温为室温。
(3)标准曲线绘制：取6支具塞试管，各加入空白尿样1 ml和2 mol/L盐酸0.5 ml，再分别加入TTCA标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 ml，再依次加入双蒸水0.5、0.4、0.3、0.2、0.1和0 ml，混匀，各管分别加入5 ml乙醚,旋涡混匀2分钟，静置分层，取出下层水相于另6支具塞试管，用5 ml乙醚再萃取1次，将两次萃取所用乙醚合并，混匀，取出2 ml乙醚置于另6支具塞试管，置于4℃低温保存，分析前加入2 ml Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(pH=7.2)，旋涡混匀2分钟，静置分层，立即取水相10 μl进样。
(4)阳性尿样测定：与上述处理基本相同，不同之处是以0.5 ml双蒸水代替TTCA标准溶液，进样量25 μl。将测得峰高除以2.5后再代入标准曲线回归方程计算，即可得到尿样中TTCA浓度。
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二、结果
1.分离效果：为比较本方法与其他方法分离效果的差异，取阳性尿样重复屈家瑛等[2]和Simon等[3]的实验，发现其方法做出的色谱流出曲线中TTCA峰与杂质峰并不能达到基线分离。参考文献[4]的色谱曲线，也不能达到基线分离，但本研究方法做出的色谱图中显示经两相两次萃取，样本中杂质很少，TTCA峰与杂质峰达到了良好的基线分离。
2.标准曲线回归方程和线性范围：用空白尿加标样制得标准曲线，Y=-0.025 6+0.429X，r=0.999，线性范围0～100 ng。
3.精密度：
(1)批内实验：空白尿加标样，一天内同一样本重复6次，结果见表1。
表1 空白尿加标样品批内精密度
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2-硫代噻唑烷-
4-羟酸(ng)
2-硫代噻唑烷-4-羧酸峰高值(cm)
1
2
3
4
5
6
CV(%)
6
3.5
3.4
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3.4
3.6
3.6
3.6
2.9
8
4.8
4.8
4.8
4.9
4.9
4.8
1.1
, 百拇医药
9
5.8
5.7
5.9
5.9
5.9
5.8
1.4
(2)批间实验：空白尿加标样10 ng，每日测试样本中夹带1个作为质控样品，连续8天，变异系数为1.2%。
4.方法的准确度：取空白尿加标样测得标准曲线值与直接测量5 mg/ L TTCA标准液比较，回收率78%～81%。取噪声值3倍，方法最低检测浓度为5μg/L。用本方法测定比利时根特大学提供的空白人工尿加入标准TTCA所成的质控样本,测得值与真值误差仅为1.6%。
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5.方法应用：对某化纤厂50名接触工人(接触水平10～20 mg/m3)班末尿中TTCA进行检测结果用肌酐值校正，仅2人未检出, 余者TTCA浓度在0～5 mg/g肌酐之间，其中33人在0～1.0 mg/g肌酐之间，11人在1～2 mg/g肌酐之间，6人在3～5 mg/g肌酐之间，10名未接触者无1例检出。
三、结果与讨论
本方法的主要优点是通过对前处理方法的改进，克服了以前方法中仅用有机溶剂一次萃取而导致样本杂质过多，TTCA与杂质不能很好分离的缺点。根据极性相似者相溶的规律，有机溶剂萃取TTCA时，除去了无机杂质和极性大的有机杂质，但尚混存大量极性较小的有机杂质。利用TTCA在弱碱性环境下呈离子状态，而在水中溶解度远大于乙醚中的性质，用pH值为7.2的磷酸缓冲溶液将TTCA从乙醚溶液中反萃取出来，从而除去了大部分极性较小的有机杂质，使TTCA样品峰与杂质峰达到了基线分离，最低检测浓度达5 μg/L(取尿样1 ml)，且回收率很稳定(CV=2.7%)，可不用内标物校正实验结果。
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本方法的可靠性经过比利时根特大学提供的质控样本检验，证明准确可靠。此外用本方法测得接触CS2工人尿中TTCA水平与空气中CS2浓度的关系与文献报道的结果基本一致[5]。
有关TTCA的检测方法，国内外报道较多，但对未接触CS2者尿中是否能检测到TTCA的问题，一直存在着争论。经过对文献报道的结果进行分析，发现凡是达到基线分离和杂质干扰少的方法，均认为未接触CS2者尿中不含有TTCA。本研究也未从对照组工人尿中检测到TTCA。有的方法之所以与本方法结果不同，可能是由于方法本身分离效果不佳，杂质峰与TTCA峰发生重叠，故将空白尿中的杂质误认为是TTCA。但这一问题的阐明，尚有赖于GC-MS实验的证明。
参考文献
1 Thienpont LM, Depourcq GC, Nelis HJ, et al. Liquid chromatographic determination of 2-thioxothiazolidine-4-caboxylic acid isolated from urine by affinity chromatography on organomercurial agarose gel. Anal Chem, 1990,62.2673-2675.
, http://www.100md.com
2 屈家瑛，黄磊，张如午，等.高压液相色谱法测定尿中2-硫代噻唑烷-4-羧酸浓度.上海医科大学学报，1987，14：293-296.
3 Simon P, Nicot T, Dieudonne M. Dietary habits, a non-negligible source of 2-thiothiazolidine-4-carboxylic acid and possible overestimation of carbon disulfide exposure. Int Arch Occup Environ Health, 1994,66:85-90.
4 引林，李金泰，王敢峰，等.生物材料中有毒物质分析方法手册.北京：人民卫生出版社，1994.223-227.
5 Meuling WJ, Bragt PC, Braun CL. Biological monitoring of carbon disulfide. Am J Ind Med, 1990,17:247-254.
收稿日期：1998-03-26 修回日期：1998-09-08, 百拇医药
单位：李阳 毕勇毅 谭晓东 王福元 汪春红 阎俊 苏拥军 (430071 武汉市 湖北医科大学卫生学教研室)
关键词：
改良高效液相色谱测定尿中2 二硫化碳(CS2)是生产粘胶纤维的重要原料，具有强烈的神经、心血管毒作用。自从Doorn等从CS2接触工人尿中分离并证实存在CS2代谢产物2-硫代噻唑烷-4-羧酸(2-thiothiazolidine-4-carboxylic acid，TTCA)以来，国内外众多学者都对TTCA的检测方法进行了探索。但直到目前为止，使用高效液相色谱法(HPLC)分析TTCA，尿样前处理均采用有机溶剂萃取法从尿中提取TTCA。这样做出的色谱图杂质峰较多，TTCA与杂质不能达到良好的基线分离，导致对TTCA定量分析的误差增大，方法检出限较高。用凝胶柱预分离后再用HPLC分离的方法[1]，虽然达到了基线分离，但此方法设备要求高，过程复杂，且回收率低、精密度差。
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我们采用了一种用乙醚和缓冲溶液两次提取尿中TTCA的前处理方法，消除了绝大部分杂质干扰，方法简单，分离效果好，是一种值得推广运用的简单实用的检测方法。
一、材料与方法
1.试剂：TTCA标准品(ALDRICH公司)、甲醇、冰乙酸、乙醚、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、中性氧化铝均为AR级，TTCA标准液5 mg/L，乙醚在每日临用前用中性氧化铝柱过滤1遍。
2.仪器：岛津LC-6A液相色谱仪、紫外可变波长检测器、旋涡混匀器、层析柱和Utrasphere ODS C18反相色谱柱。
3.测定方法：
(1)尿样处理：尿样经盐酸酸化后，用乙醚萃取其中TTCA，再用pH值7.2的磷酸缓冲溶液将TTCA从乙醚中反萃取出来，取溶有TTCA的缓冲溶液用于HPLC分析。
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(2)色谱条件：流动相为甲醇：冰乙酸：水＝4∶1∶95，流速1 ml/min,检测波长273 nm，柱温为室温。
(3)标准曲线绘制：取6支具塞试管，各加入空白尿样1 ml和2 mol/L盐酸0.5 ml，再分别加入TTCA标准液0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 ml，再依次加入双蒸水0.5、0.4、0.3、0.2、0.1和0 ml，混匀，各管分别加入5 ml乙醚,旋涡混匀2分钟，静置分层，取出下层水相于另6支具塞试管，用5 ml乙醚再萃取1次，将两次萃取所用乙醚合并，混匀，取出2 ml乙醚置于另6支具塞试管，置于4℃低温保存，分析前加入2 ml Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(pH=7.2)，旋涡混匀2分钟，静置分层，立即取水相10 μl进样。
(4)阳性尿样测定：与上述处理基本相同，不同之处是以0.5 ml双蒸水代替TTCA标准溶液，进样量25 μl。将测得峰高除以2.5后再代入标准曲线回归方程计算，即可得到尿样中TTCA浓度。
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二、结果
1.分离效果：为比较本方法与其他方法分离效果的差异，取阳性尿样重复屈家瑛等[2]和Simon等[3]的实验，发现其方法做出的色谱流出曲线中TTCA峰与杂质峰并不能达到基线分离。参考文献[4]的色谱曲线，也不能达到基线分离，但本研究方法做出的色谱图中显示经两相两次萃取，样本中杂质很少，TTCA峰与杂质峰达到了良好的基线分离。
2.标准曲线回归方程和线性范围：用空白尿加标样制得标准曲线，Y=-0.025 6+0.429X，r=0.999，线性范围0～100 ng。
3.精密度：
(1)批内实验：空白尿加标样，一天内同一样本重复6次，结果见表1。
表1 空白尿加标样品批内精密度
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2-硫代噻唑烷-
4-羟酸(ng)
2-硫代噻唑烷-4-羧酸峰高值(cm)
1
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CV(%)
6
3.5
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(2)批间实验：空白尿加标样10 ng，每日测试样本中夹带1个作为质控样品，连续8天，变异系数为1.2%。
4.方法的准确度：取空白尿加标样测得标准曲线值与直接测量5 mg/ L TTCA标准液比较，回收率78%～81%。取噪声值3倍，方法最低检测浓度为5μg/L。用本方法测定比利时根特大学提供的空白人工尿加入标准TTCA所成的质控样本,测得值与真值误差仅为1.6%。
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5.方法应用：对某化纤厂50名接触工人(接触水平10～20 mg/m3)班末尿中TTCA进行检测结果用肌酐值校正，仅2人未检出, 余者TTCA浓度在0～5 mg/g肌酐之间，其中33人在0～1.0 mg/g肌酐之间，11人在1～2 mg/g肌酐之间，6人在3～5 mg/g肌酐之间，10名未接触者无1例检出。
三、结果与讨论
本方法的主要优点是通过对前处理方法的改进，克服了以前方法中仅用有机溶剂一次萃取而导致样本杂质过多，TTCA与杂质不能很好分离的缺点。根据极性相似者相溶的规律，有机溶剂萃取TTCA时，除去了无机杂质和极性大的有机杂质，但尚混存大量极性较小的有机杂质。利用TTCA在弱碱性环境下呈离子状态，而在水中溶解度远大于乙醚中的性质，用pH值为7.2的磷酸缓冲溶液将TTCA从乙醚溶液中反萃取出来，从而除去了大部分极性较小的有机杂质，使TTCA样品峰与杂质峰达到了基线分离，最低检测浓度达5 μg/L(取尿样1 ml)，且回收率很稳定(CV=2.7%)，可不用内标物校正实验结果。
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本方法的可靠性经过比利时根特大学提供的质控样本检验，证明准确可靠。此外用本方法测得接触CS2工人尿中TTCA水平与空气中CS2浓度的关系与文献报道的结果基本一致[5]。
有关TTCA的检测方法，国内外报道较多，但对未接触CS2者尿中是否能检测到TTCA的问题，一直存在着争论。经过对文献报道的结果进行分析，发现凡是达到基线分离和杂质干扰少的方法，均认为未接触CS2者尿中不含有TTCA。本研究也未从对照组工人尿中检测到TTCA。有的方法之所以与本方法结果不同，可能是由于方法本身分离效果不佳，杂质峰与TTCA峰发生重叠，故将空白尿中的杂质误认为是TTCA。但这一问题的阐明，尚有赖于GC-MS实验的证明。
参考文献
1 Thienpont LM, Depourcq GC, Nelis HJ, et al. Liquid chromatographic determination of 2-thioxothiazolidine-4-caboxylic acid isolated from urine by affinity chromatography on organomercurial agarose gel. Anal Chem, 1990,62.2673-2675.
, http://www.100md.com
2 屈家瑛，黄磊，张如午，等.高压液相色谱法测定尿中2-硫代噻唑烷-4-羧酸浓度.上海医科大学学报，1987，14：293-296.
3 Simon P, Nicot T, Dieudonne M. Dietary habits, a non-negligible source of 2-thiothiazolidine-4-carboxylic acid and possible overestimation of carbon disulfide exposure. Int Arch Occup Environ Health, 1994,66:85-90.
4 引林，李金泰，王敢峰，等.生物材料中有毒物质分析方法手册.北京：人民卫生出版社，1994.223-227.
5 Meuling WJ, Bragt PC, Braun CL. Biological monitoring of carbon disulfide. Am J Ind Med, 1990,17:247-254.
收稿日期：1998-03-26 修回日期：1998-09-08, 百拇医药