A+G连接介导PCR方法的建立及其在体内足迹研究中的应用△
作者：纪新军 刘德培 徐冬冬 李磊 王晶 梁植权
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005
关键词：连接介导PCR；A>G化学裂解法；序列测定；硫酸二甲酯；体内足迹法
中国医学科学院学报990314 摘要 目的 建立一种新的连接介导聚合酶链反应(ligation-mediated polymerase chain reaction,LM-PCR)方法，使之能够对G-残基含量过低或不含G-残基的区域进行体内足迹研究。方法 对原化学测序法中的A>G法进行修改，化学裂解后进行连接介导的PCR反应，通过测序胶分离分析PCR反应结果。结果 建立了A+G LM-PCR方法，本法能够应用于体内足迹研究。结论 应用本实验建立的方法可分析A-残基和G-残基上的蛋白质-DNA相互作用状况，可获得更多信息及扩大使用范围。
, 百拇医药
中图号 Q5
Establishment of A+G Ligation Mediated Polymerase Chain Reaction and Its Application in in vivo Footprinting Study
Ji Xinjun Liu Depei Xu Dongdong Li Lei Wang Jing,et al
(National Laboratory of Medical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences,PUMC and CAMS,Beijing 100005)
Objective To establish a new ligation mediated PCR method for the work in in vivo footprinting study of some regions of low G-residue content or some regions of G-residue free.Methods The A>G chemical cleavage method of Maxam-Gilbert sequencing was modified for ligation mediated PCR after A+G chemical cleavage and separate the PCR products by sequencing PAGE.Results A new A+G ligation mediated method was established and could be used in in vivo footprinting study.Conclusions Our results indicated that the newly developed method could analyze the DNA-Protein interaction at both A-residue and G-residue,enabled us to get more information and enlarged the scope of its application.
, 百拇医药
Key words ligation mediated PCR;A>G chemical cleavage;sequencing;dimethyl sulfate;in vivo footprinting
研究DNA-蛋白质间相互作用的方法很多，但只有体内足迹法能真实反映体内DNA-蛋白质间相互作用的情况。连接介导聚合酶链反应的引入大大推动了体内足迹研究的进展[1]。体内足迹法通过比较先用探针(烷化剂或核酸酶)处理活细胞后再提取基因组DNA样品和先提取基因组DNA后再用探针处理样品结果间的差异展示体内蛋白质-DNA间的相互作用。硫酸二甲酯(dimethyl sulfate,DMS)是最常用的烷基化试剂探针，因为它可以自由地出入细胞膜和细胞核膜，从而甲基化基因组DNA。DNA与蛋白质结合后常可改变硫酸二甲酯对DNA链上A-残基和G-残基的接触，这种不同可以通过体内足迹研究揭示出来。笔者已建立了用体内足迹法分析G-残基的反应性方法。但在实际应用中，发现只分析G-残基反应性，获得的信息量较小，并且对某些重要区域，如G-残基含量过低或不含G-残基的区域其实用价值受到限制。本实验建立了一种新的A+G LM-PCR方法，分析DNA链A-残基和G-残基上的蛋白质-DNA相互作用，以获得更多的信息并扩大其使用范围。
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1 材料和方法
细胞培养 鼠源性红白血病细胞系MEL置含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5% CO2培养细胞生长至对数生长期。
体内甲基化 采用Becker和Schutz[2]介绍的方法。500 r/min离心2 min，用新鲜无血清DMEM培养基重悬细胞，调整浓度至5×107个细胞/ml。细胞悬液中加入10%硫酸二甲酯(溶于乙醇)至终浓度为0.3%，37℃反应2 min。立即将反应悬液加入到50 ml预冷至0℃的PBS中，混匀，4℃条件下，1600 r/min离心5 min。重复PBS洗涤(3次)。
基因组DNA的提取 体内甲基化细胞和体外对照细胞基因组DNA的提取按常规方法[3]进行。蛋白酶K和RNaseA消化后，苯酚抽提3次，苯酚/氯仿抽提1次，氯仿：异戊醇抽提1次，乙醇沉淀，最后样品溶解于TE(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)中。
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体外甲基化 对照DNA的体外甲基化处理按Maxam-Gilbert[4]介绍的方法进行。
碱基特异的裂解 体内甲基化和体外甲基化DNA样品的G-残基特异吡啶裂解按照分子克隆所介绍的方法进行。A+G裂解：对Maxam-Gilbert[5]化学测序法中的A>G处理方法进行部分修改，使其能用于体内足迹分析：将30 μg体内或体外甲基化DNA溶于100 μl消毒去离子水中，加入25μl 0.5 mol/L HCl，混匀，置于冰上，偶尔混匀一下。2 h后，乙醇沉淀DNA样品，-70℃放置30 min；4℃，13 000 r/min离心20 min，70%乙醇洗盐后，DNA样品重悬于50 μl的0.1 mol/L NaOH/1 mmol/L EDTA中，90℃裂解30 min；再用乙醇沉淀，-70℃放置30 min。4℃，13000r/min离心20 min。70%乙醇洗盐后，DNA样品溶于TE，调整浓度至0.4 μg/μl。
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连接介导的PCR 连接介导的PCR反应严格按照Garrity和Wold[6]所介绍的方法进行。最后，样品溶于测序加样缓冲液中。
测序电泳 对标记样品进行8 mol/L尿素6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，35 W电泳3 h。干胶后，于-70℃对X光片曝光2 d，放射自显影。
引物和连接子 以鼠β-珠蛋白基因的启动子为例，所用引物和连接子如下：
P1：GGGGTTGTGAGTCAACAC，P2：GTGAGTCAACTCAACTATGTCAGAAGC，P3：GTCAGAAGCAAATGTGAGGAGC。
Linker：OH-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC-OH
OH-CTAGACTTAAG-OH
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2 结果和讨论
连接介导的聚合酶链反应序列测定结果见图1。
图 1 应用LM-PCR进行序列测定
Fig 1 Sequencing by LM-PCR
在序列测定基础上，分别建立了G-LM-PCR和A+G LM-PCR方法，并将其用于体内足迹研究。结果用G-残基裂解法裂解后再进行LM-PCR反应，无论是体内(Lane1)还是体外(Lane2)甲基化处理都与预期的结果一致(图2)。用A>G化学裂解法裂解DNA后再进行LM-PCR反应，体外(Lane3)，体内(Lane4)甲基化处理结果见图2。本结果表明，采用A+G LM-PCR方法进行体内足迹研究，不但完全包含了(G-LM-PCR方法所能得到的)G-残基所对应的条带，而且还能清晰、准确地展示所有A-残基所代表的条带。
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图 2 A+G LM-PCR的建立
Fig 2 The establishment of A+G LM-PCR
Lane 1:G-cleavage after in vitro DMS treatment;Lane 2: G-cleavage after in vivo DMS treatment;Lane 3:A+G-cleavage after in vitro DMS treatment;Lane 4:A+G-cleavage after in vivo DMS treatment
连接介导的PCR方法已成功地应用于体内足迹研究，体内足迹法又是研究真核基因表达调控机制中唯一能揭示体内真实存在的蛋白质-DNA相互作用的方法。
目前，体内足迹研究中最常用的探针仍是硫酸二甲酯(DMS)。DMS较其他探针在某些方面具有优势：操作容易，可自由进出细胞膜和细胞核膜，从而可甲基化裸露的基因组DNA(A-和G-残基)。以往体内足迹研究最常分析的是G-残基的反应性，DMS甲基化G-残基的能力大于其甲基化A-残基的能力，而且用吡啶进行裂解反应时，G-残基的反应性也强于A-残基。G-残基常位于双链DNA的大沟中，常处于多数蛋白因子的结合基序(motif)中。在实际应用中，以G-残基裂解为基础的G-LM-PCR体内足迹法通常能满足多数实验的需要。但对于某些特殊区域(如G-残基含量较低或不含G-残基的区域)，G-LM-PCR体内足迹法就显得力不从心。应用本文介绍的A+G LM-PCR体内足迹法，便能够研究G-残基含量较低或不含G-残基区域上的DNA-蛋白质间的相互作用。而且，A+G LM-PCR体内足迹法的应用使原来只由G-残基提供的信息改由A-和G-残基提供，显然增大了信息量。本方法建立在MAXAM-GILBERT化学法测序中的A>G裂解方法的基础上，当用稀HCl释放时，A-残基的糖环不稳定，随后用碱(NaOH)裂解时，A-残基的裂解强度则大于或等于G-残基。由于本方法中采用A+G法裂解基因组DNA，故笔者称之为A+G LM-PCR体内足迹法。目前，笔者正在用这一方法研究β-珠蛋白簇上游的位点控制区(locus control region,LCR)中的高敏位点2(hypersensitive site 2,HS2)上两个AT-富含区的调控作用。
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△国家自然科学基金(39470390),杰出青年科学基金(39525006)及自然科学基金重大项目(39893320)资助
刘德培为通讯作者
参考文献
1 纪新军，刘德培，梁植权.连接介导PCR及其在体内足迹研究中的应用.生物化学与生物物理学研究进展，1997，24(3)：224～227
2 Selton JK.Genetic engineering principles and methods.New York:Plenum Press,1988.1～19
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning.A laboratory manual.2nd eds.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989
, 百拇医药
4 Maxam A,Gilbert W.Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages.Methods Enzymol,1980,65:499～560
5 Maxam A,Gilbert W.A new method for sequencing DNA.Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:560～564
6 Garrity DA,Wold BJ.Effects of different DNA polymerases in ligation-mediated PCR:enhanced genomic sequencing and in vivo footprinting.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:1021～1025
(1998-09-21 收稿), http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005
关键词：连接介导PCR；A>G化学裂解法；序列测定；硫酸二甲酯；体内足迹法
中国医学科学院学报990314 摘要 目的 建立一种新的连接介导聚合酶链反应(ligation-mediated polymerase chain reaction,LM-PCR)方法，使之能够对G-残基含量过低或不含G-残基的区域进行体内足迹研究。方法 对原化学测序法中的A>G法进行修改，化学裂解后进行连接介导的PCR反应，通过测序胶分离分析PCR反应结果。结果 建立了A+G LM-PCR方法，本法能够应用于体内足迹研究。结论 应用本实验建立的方法可分析A-残基和G-残基上的蛋白质-DNA相互作用状况，可获得更多信息及扩大使用范围。
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中图号 Q5
Establishment of A+G Ligation Mediated Polymerase Chain Reaction and Its Application in in vivo Footprinting Study
Ji Xinjun Liu Depei Xu Dongdong Li Lei Wang Jing,et al
(National Laboratory of Medical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences,PUMC and CAMS,Beijing 100005)
Objective To establish a new ligation mediated PCR method for the work in in vivo footprinting study of some regions of low G-residue content or some regions of G-residue free.Methods The A>G chemical cleavage method of Maxam-Gilbert sequencing was modified for ligation mediated PCR after A+G chemical cleavage and separate the PCR products by sequencing PAGE.Results A new A+G ligation mediated method was established and could be used in in vivo footprinting study.Conclusions Our results indicated that the newly developed method could analyze the DNA-Protein interaction at both A-residue and G-residue,enabled us to get more information and enlarged the scope of its application.
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Key words ligation mediated PCR;A>G chemical cleavage;sequencing;dimethyl sulfate;in vivo footprinting
研究DNA-蛋白质间相互作用的方法很多，但只有体内足迹法能真实反映体内DNA-蛋白质间相互作用的情况。连接介导聚合酶链反应的引入大大推动了体内足迹研究的进展[1]。体内足迹法通过比较先用探针(烷化剂或核酸酶)处理活细胞后再提取基因组DNA样品和先提取基因组DNA后再用探针处理样品结果间的差异展示体内蛋白质-DNA间的相互作用。硫酸二甲酯(dimethyl sulfate,DMS)是最常用的烷基化试剂探针，因为它可以自由地出入细胞膜和细胞核膜，从而甲基化基因组DNA。DNA与蛋白质结合后常可改变硫酸二甲酯对DNA链上A-残基和G-残基的接触，这种不同可以通过体内足迹研究揭示出来。笔者已建立了用体内足迹法分析G-残基的反应性方法。但在实际应用中，发现只分析G-残基反应性，获得的信息量较小，并且对某些重要区域，如G-残基含量过低或不含G-残基的区域其实用价值受到限制。本实验建立了一种新的A+G LM-PCR方法，分析DNA链A-残基和G-残基上的蛋白质-DNA相互作用，以获得更多的信息并扩大其使用范围。
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1 材料和方法
细胞培养 鼠源性红白血病细胞系MEL置含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5% CO2培养细胞生长至对数生长期。
体内甲基化 采用Becker和Schutz[2]介绍的方法。500 r/min离心2 min，用新鲜无血清DMEM培养基重悬细胞，调整浓度至5×107个细胞/ml。细胞悬液中加入10%硫酸二甲酯(溶于乙醇)至终浓度为0.3%，37℃反应2 min。立即将反应悬液加入到50 ml预冷至0℃的PBS中，混匀，4℃条件下，1600 r/min离心5 min。重复PBS洗涤(3次)。
基因组DNA的提取 体内甲基化细胞和体外对照细胞基因组DNA的提取按常规方法[3]进行。蛋白酶K和RNaseA消化后，苯酚抽提3次，苯酚/氯仿抽提1次，氯仿：异戊醇抽提1次，乙醇沉淀，最后样品溶解于TE(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA)中。
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体外甲基化 对照DNA的体外甲基化处理按Maxam-Gilbert[4]介绍的方法进行。
碱基特异的裂解 体内甲基化和体外甲基化DNA样品的G-残基特异吡啶裂解按照分子克隆所介绍的方法进行。A+G裂解：对Maxam-Gilbert[5]化学测序法中的A>G处理方法进行部分修改，使其能用于体内足迹分析：将30 μg体内或体外甲基化DNA溶于100 μl消毒去离子水中，加入25μl 0.5 mol/L HCl，混匀，置于冰上，偶尔混匀一下。2 h后，乙醇沉淀DNA样品，-70℃放置30 min；4℃，13 000 r/min离心20 min，70%乙醇洗盐后，DNA样品重悬于50 μl的0.1 mol/L NaOH/1 mmol/L EDTA中，90℃裂解30 min；再用乙醇沉淀，-70℃放置30 min。4℃，13000r/min离心20 min。70%乙醇洗盐后，DNA样品溶于TE，调整浓度至0.4 μg/μl。
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连接介导的PCR 连接介导的PCR反应严格按照Garrity和Wold[6]所介绍的方法进行。最后，样品溶于测序加样缓冲液中。
测序电泳 对标记样品进行8 mol/L尿素6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，35 W电泳3 h。干胶后，于-70℃对X光片曝光2 d，放射自显影。
引物和连接子 以鼠β-珠蛋白基因的启动子为例，所用引物和连接子如下：
P1：GGGGTTGTGAGTCAACAC，P2：GTGAGTCAACTCAACTATGTCAGAAGC，P3：GTCAGAAGCAAATGTGAGGAGC。
Linker：OH-GCGGTGACCCGGGAGATCTGAATTC-OH
OH-CTAGACTTAAG-OH
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2 结果和讨论
连接介导的聚合酶链反应序列测定结果见图1。
图 1 应用LM-PCR进行序列测定
Fig 1 Sequencing by LM-PCR
在序列测定基础上，分别建立了G-LM-PCR和A+G LM-PCR方法，并将其用于体内足迹研究。结果用G-残基裂解法裂解后再进行LM-PCR反应，无论是体内(Lane1)还是体外(Lane2)甲基化处理都与预期的结果一致(图2)。用A>G化学裂解法裂解DNA后再进行LM-PCR反应，体外(Lane3)，体内(Lane4)甲基化处理结果见图2。本结果表明，采用A+G LM-PCR方法进行体内足迹研究，不但完全包含了(G-LM-PCR方法所能得到的)G-残基所对应的条带，而且还能清晰、准确地展示所有A-残基所代表的条带。
, 百拇医药
图 2 A+G LM-PCR的建立
Fig 2 The establishment of A+G LM-PCR
Lane 1:G-cleavage after in vitro DMS treatment;Lane 2: G-cleavage after in vivo DMS treatment;Lane 3:A+G-cleavage after in vitro DMS treatment;Lane 4:A+G-cleavage after in vivo DMS treatment
连接介导的PCR方法已成功地应用于体内足迹研究，体内足迹法又是研究真核基因表达调控机制中唯一能揭示体内真实存在的蛋白质-DNA相互作用的方法。
目前，体内足迹研究中最常用的探针仍是硫酸二甲酯(DMS)。DMS较其他探针在某些方面具有优势：操作容易，可自由进出细胞膜和细胞核膜，从而可甲基化裸露的基因组DNA(A-和G-残基)。以往体内足迹研究最常分析的是G-残基的反应性，DMS甲基化G-残基的能力大于其甲基化A-残基的能力，而且用吡啶进行裂解反应时，G-残基的反应性也强于A-残基。G-残基常位于双链DNA的大沟中，常处于多数蛋白因子的结合基序(motif)中。在实际应用中，以G-残基裂解为基础的G-LM-PCR体内足迹法通常能满足多数实验的需要。但对于某些特殊区域(如G-残基含量较低或不含G-残基的区域)，G-LM-PCR体内足迹法就显得力不从心。应用本文介绍的A+G LM-PCR体内足迹法，便能够研究G-残基含量较低或不含G-残基区域上的DNA-蛋白质间的相互作用。而且，A+G LM-PCR体内足迹法的应用使原来只由G-残基提供的信息改由A-和G-残基提供，显然增大了信息量。本方法建立在MAXAM-GILBERT化学法测序中的A>G裂解方法的基础上，当用稀HCl释放时，A-残基的糖环不稳定，随后用碱(NaOH)裂解时，A-残基的裂解强度则大于或等于G-残基。由于本方法中采用A+G法裂解基因组DNA，故笔者称之为A+G LM-PCR体内足迹法。目前，笔者正在用这一方法研究β-珠蛋白簇上游的位点控制区(locus control region,LCR)中的高敏位点2(hypersensitive site 2,HS2)上两个AT-富含区的调控作用。
, 百拇医药
△国家自然科学基金(39470390),杰出青年科学基金(39525006)及自然科学基金重大项目(39893320)资助
刘德培为通讯作者
参考文献
1 纪新军，刘德培，梁植权.连接介导PCR及其在体内足迹研究中的应用.生物化学与生物物理学研究进展，1997，24(3)：224～227
2 Selton JK.Genetic engineering principles and methods.New York:Plenum Press,1988.1～19
3 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning.A laboratory manual.2nd eds.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989
, 百拇医药
4 Maxam A,Gilbert W.Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages.Methods Enzymol,1980,65:499～560
5 Maxam A,Gilbert W.A new method for sequencing DNA.Proc Natl Acad Sci USA,1977,74:560～564
6 Garrity DA,Wold BJ.Effects of different DNA polymerases in ligation-mediated PCR:enhanced genomic sequencing and in vivo footprinting.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:1021～1025
(1998-09-21 收稿), http://www.100md.com