α-、γ-干扰素诱导基因的差异表达
作者：张权庚 李洁 张友会
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所免疫室， 北京 100021
关键词：mRNA差异显示；干扰素；肿瘤转移
中国医学科学院学报990305 摘要 目的 为分离转移相关基因，对两种干扰素诱导出现的差异表达cDNA片段进行序列测定。方法 以α-和γ-干扰素分别处理MA891细胞，提取其RNA，用Northern blot进一步确定用差异显示法所获得的基因片段的差异性。选择表达差异明显的片段进行DNA测序。结果 Northern blot结果表明，差异显示法得到的10个cDNA片段中，4个确属差异表达片段。测序结果显示，G15γ属尚无同源性报道的新基因；C4α与小鼠一种次要组织相容性复合体基因高度同源；T2γ与小鼠β-actin基因高度同源；T11γ与褐鼠高血压相关基因高度同源。结论 确定了α-、γ-干扰素处理MA891细胞出现4条cDNA差异显示片段的核苷酸序列，为研究其与肿瘤转移的联系打下了基础。
, http://www.100md.com
中图号 R73-352
IFNα-and IFNγ-Induced Differentially Expressed Genes
Zhang Quangeng Li Jie Zhang Youhui
(Department of Immunology，Cancer Institute，CAMS and PUMC，Beijing 100021)
Objectives It was previously found that IFNα could reduce，while IFNγ could enhance metastatic potential of a mouse mammary adenocarcinoma cell line MA891.The aim of this study was to identify the sequence of cDNA fragments that were differentially expressed by the two types of IFN，respectively.Methods Total RNA was extracted from MA891 cells treated with IFNα or IFNγ.Northern blotting was used to confirm the differentially expressed gene fragments.DNA sequencing was then carried out.Results The Northern blots indicated that among the 10 cDNA fragments obtained by mRNA differential display technique，4(G15γ、C4α，T2γ，and T11γ) were shown to be unequivocally differentially expressed.Among them，the nucleotide sequence of G15γ did not show homology with any of the existing genes，while that of C4α，T2γ and T11γ was highly homolgous to mouse minor histocompatility complex gene，mouse β-actin gene and hamster high blood pressure gene，respectively.Conclusions Four differentially expressed cDNA fragments by IFNα- and IFNγ- treated MA891 cells have been ascertained.Regardless of sequence homology，none of them is reportedly related to tumor cell metastasis.The results herein reported provide basis for the elucidation of new metastasis-associated gene(s).
, 百拇医药
Key words mRNA differential display; interferon; metastasis
笔者以前曾报道，干扰素能调变小鼠乳腺癌细胞的转移潜能。γ-干扰素增强其转移潜能，α-干扰素则减弱之[1，2]。利用两种干扰素对MA891转移潜能的不同影响，笔者试图分离克隆与转移相关的基因。采用mRNA差异显示法(differential display)，寻找两种干扰素诱导MA891细胞出现的差异表达基因片段[3]，本文是对这些cDNA片段的进一步研究。
1 材料和方法
Northern杂交筛选 MA891细胞培养、IFN处理及总RNA提取同既往研究[3]。总RNA电泳及转膜，质粒DNA提取与PEG纯化方法参照文献[4]。
探针制备：(1) 酶切反应：取10 μg质粒DNA，加入10×EcoRⅠ buffer及50U EcoRⅠ，用双蒸水补足反应体积，37℃酶切2 h以上，琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2) 探针回收(WizardTM DNA clean up kit，Promega，USA): 待酶切完全后，用1%琼脂糖电泳分离酶切产物，切下探针凝胶条置于1.5 ml离心管中，加入200 μl 6 mol/L NaⅠ于60℃水浴溶解凝胶，加入1 ml混匀的树脂，室温放置5 min，以使树脂充分吸附DNA。再用套上柱子管的3 ml注射器推滤，去掉液体，加入2 ml 80%异丙醇推滤洗涤小柱子1次，取下小柱子置于1.5 ml离心管，13000 r/min离心20s， 再于室温放置5 min，然后加入适量的预热到65～75℃ TE或无菌水洗脱DNA， 12000 r/min离心3min，收集cDNA溶液，电泳鉴定并定量，-20℃保存。(3) 探针标记：按随机引物标记试剂盒(Promega，USA)说明书操作。
, 百拇医药
预杂交及杂交反应：将转有RNA的尼龙膜放入杂交袋中，加入适量预杂交液(0.5 mol/L Na2 HPO4，7%SDS，1 mol/L EDTA)，去气泡并封口，65℃保温3 h。剪开杂交袋倒出预杂交液。每袋加入适量预杂交液及标记探针，赶尽气泡，封口。置65℃水浴杂交48～72 h。用2×SSC/0.1% SDS于65℃水浴洗膜3遍，每遍30 min。待膜自然干后，用保鲜膜包好并在暗室用Kodak X光胶片于暗盒中压片，-70℃ 48 h自显影。常规洗片。
cDNA片段测序 按Sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒(USB Corporation，USA)说明书进行操作。
质粒DNA变性：每个质粒按每个引物3～5 μg取量，用蒸馏水稀释至50 μl，其中含0.1体积的2 mol/L NaOH及2 mol/L EDTA，37℃孵育30 min，用4倍体积的无水乙醇及0.1体积的3mol/L乙酸钠(pH4.5～5.5)于-20℃沉淀过夜。12000 r/min离心15 min，沉淀DNA用75%无水乙醇沉淀1次，每3～5 μg质粒DNA用7 μl双蒸水溶解。
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测序反应：每个DNA分别用M13(-40)引物及SP6引物进行双向测序。每个引物反应管取7 μl变性DNA(3～5 μg)，加入1 μl引物(0.5 pmol)及2 μl退火缓冲液(200 mmol/L NaCⅠ)。65℃反应2 min，于室温缓冲冷却约30 min。加入1 μl 0.1 mol/L DTT，2 μl稀释的Labeling mix，0.5 μl 35S-dATP及2 μl稀释后的测序酶(含焦磷酸酶)。混匀并短暂离心，室温反应约5min。分别取3.5 μl标记反应产物加入每个经37℃预热的2.5 μl双脱氧核苷酸(ddA，ddG，ddC，ddT)管中，37℃反应，每管加入4 μl终止液混匀，短暂离心后置于冰上。
电泳及放射自显影：测序反应产物用含8 mol/L尿素8%聚丙烯凝胶电泳。加样前，样品80℃变性，每孔加样。20W恒功率电泳至溴酚蓝至凝胶底部时结束电泳，取凝胶置15%甲醇-5%冰乙酸中固定约30 min，用滤纸平贴于凝胶上并揭下凝胶，覆盖保鲜膜，于干胶机80℃干胶2 h。待胶干燥后揭除保鲜膜并用Kodak感光胶片于室温或-70℃曝光2～5 d，显影读片。
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2 结果
IFN处理及未处理的MA891细胞RNA变性琼脂糖凝胶电泳显示3种样本均没有降解。
Northern杂交结果显示，10个克隆的cDNA片段中，T2γ、C4α、T11γ、G15γ cDNA有杂交信号且差异表达。C4α在IFNα处理的MA891细胞中表达强于IFN-γ处理的MA891细胞，而T2γ、T11γ、G15γ 3个片段在IFNγ处理的MA891细胞中表达强于IFNα处理的MA891细胞(图1)，与差异显示结果一致。其他6个片段——T2α、T6α、T16α、T17α、T5α1、T5α2没有杂交信号或没有差异，属于假阳性条带，未作进一步研究。
图1 Northern杂交结果
Fig 1 Northern hybridization
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results
a.C4α; b.T2γ; c.T11γ; d.G15γ;
e.β-actin as control
采用Sequenase Version 2.0测序试剂盒对T2γ、C4α、T11γ、G15γ cDNA片段进行测序(图2，3)。经查询：(1) G15γ是新序列，与已知序列没有同源性。(2) C4α与两个基因有很高的同源性，一个是小鼠线粒体基因组中的一个基因，另一个是小鼠“管家疏水蛋白”(domestics hydrophobic protein) mRNA序列； (3) T2γ与小鼠A-X actin有96%同源性，与小鼠β-actin约有90%同源性。(4) T11γ与褐鼠高血压相关mRNA基因有86%同源性。
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图2 T2γ、C4α、T11γ和G15γ cDNA片段序列
Fig 2 Sequences of T2γ，C4α，T11γ，and G15γ cDNA fragments
图3 部分测序结果
Fig 3 Auto-radiographs of partial sequencing of C4α，T2γ，T11γ，and G15γ
3 讨论
本研究对笔者差异显示反应得到的10个差异带(T2α、T2γ、C4α、T6α、T11γ、G15γ、T16α、T17α、T5α1、T5α2)[3]进行Northern筛选，证明T2γ、C4α、T11γ、G15γ为差异表达cDNA片段，其他条带或没有杂交信号，或没有差异，说明从胶上分离的差异带有近70%的假阳性，这与其他一些mRNA差异显示结果一致[5]。
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本研究对T2γ、C4α、T11γ及G15γ进行测序并向GenBank查询基因的同源性。
G15γ与已知的基因没有同源性，为新发现的基因序列。其生物学功能值得深入研究。
C4α与两个基因有96%的同源性，一个是小鼠线粒体基因组中的一个基因，另一个是小鼠“管家疏水蛋白”(domestic hydrophobic protein) mRNA序列，后者也是小鼠线粒体编码的一种蛋白，两者可能为同一基因。小鼠“管家疏水蛋白”是小鼠母系传递的一种次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigen)[6]，尚未见其有影响肿瘤转移的报道。本实验表明C4α经IFN-α处理表达增高，IFN-γ处理则表达降低，它是否为一种肿瘤转移的抑制蛋白，有待进一步研究。
T2γ与小鼠β-actin高度同源。Actin作为一种细胞骨架蛋白，与肿瘤转移的关系已有较多研究，当细胞内Actin增加时，细胞刚性增加，转移性减弱。但在本实验中T2γ被IFN-γ诱导表达，可见其可能不是影响MA891细胞转移性的重要因素。本实验按常规实验方法以β-actin作对照，但β-actin与T2γ的Northern杂交结果基本一致。既然β-actin已被调变，Northern杂交结果就不能以此作为对照，本实验以RNA琼脂糖电泳照片为对照，这在用其他mRNA差异显示方法分离肿瘤转移相关基因的研究中也见到使用[7]。
, 百拇医药
T11γ与褐鼠高血压相关mRNA约90%同源。目前尚未见高血压相关mRNA与肿瘤转移关系的研究，因此该基因是否与MA891转移性相关亦有待进一步研究。
(致谢：本实验技术得到北京市肿瘤研究所柯杨老师及mRNA差异显示技术创立者Peng Liang指导)
张友会为通讯作者
参考文献
1 罗利群，张友会.γ干扰素促进小鼠乳腺癌转移.中华肿瘤杂志，1994，16: 251～254
2 罗利群，张友会，黄兰青，等.干扰素对小鼠乳腺癌细胞侵袭力及对侵袭转移相关基因表达的调变.中华肿瘤杂志， 1997，19:184～187
3 张权庚，张友会.mRNA差异显示法在分离肿瘤转移相关基因中的初步应用.中国医学科学院学报，1997，19:384～388
, 百拇医药
4 侯云德.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社， 1992
5 Jan JMG，Henri PSB，Guido WMS.Identification of melanoma inhibitory activity and other differentially expressed messenger RNAs in human melanoma cell lines with different metastatic capacity by messenger RNA differential display.Cancer Res，1995，55:6237～6243
6 Loveland B，Wang CR，Yonekawa H，et al.Maternally transmitted histocompatibility antigen of mice: A hydrophobic peptide of a mitochondrially encoded protein.Cell，1990，60: 971～980
7 Salesiotis AN，Wang CK，Wang CD，et al.Identification of novel genes from stomach cancer cell lines by differential display.Cancer Letters，1995，91:47～54
(1997-04-20收稿), 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所免疫室， 北京 100021
关键词：mRNA差异显示；干扰素；肿瘤转移
中国医学科学院学报990305 摘要 目的 为分离转移相关基因，对两种干扰素诱导出现的差异表达cDNA片段进行序列测定。方法 以α-和γ-干扰素分别处理MA891细胞，提取其RNA，用Northern blot进一步确定用差异显示法所获得的基因片段的差异性。选择表达差异明显的片段进行DNA测序。结果 Northern blot结果表明，差异显示法得到的10个cDNA片段中，4个确属差异表达片段。测序结果显示，G15γ属尚无同源性报道的新基因；C4α与小鼠一种次要组织相容性复合体基因高度同源；T2γ与小鼠β-actin基因高度同源；T11γ与褐鼠高血压相关基因高度同源。结论 确定了α-、γ-干扰素处理MA891细胞出现4条cDNA差异显示片段的核苷酸序列，为研究其与肿瘤转移的联系打下了基础。
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中图号 R73-352
IFNα-and IFNγ-Induced Differentially Expressed Genes
Zhang Quangeng Li Jie Zhang Youhui
(Department of Immunology，Cancer Institute，CAMS and PUMC，Beijing 100021)
Objectives It was previously found that IFNα could reduce，while IFNγ could enhance metastatic potential of a mouse mammary adenocarcinoma cell line MA891.The aim of this study was to identify the sequence of cDNA fragments that were differentially expressed by the two types of IFN，respectively.Methods Total RNA was extracted from MA891 cells treated with IFNα or IFNγ.Northern blotting was used to confirm the differentially expressed gene fragments.DNA sequencing was then carried out.Results The Northern blots indicated that among the 10 cDNA fragments obtained by mRNA differential display technique，4(G15γ、C4α，T2γ，and T11γ) were shown to be unequivocally differentially expressed.Among them，the nucleotide sequence of G15γ did not show homology with any of the existing genes，while that of C4α，T2γ and T11γ was highly homolgous to mouse minor histocompatility complex gene，mouse β-actin gene and hamster high blood pressure gene，respectively.Conclusions Four differentially expressed cDNA fragments by IFNα- and IFNγ- treated MA891 cells have been ascertained.Regardless of sequence homology，none of them is reportedly related to tumor cell metastasis.The results herein reported provide basis for the elucidation of new metastasis-associated gene(s).
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Key words mRNA differential display; interferon; metastasis
笔者以前曾报道，干扰素能调变小鼠乳腺癌细胞的转移潜能。γ-干扰素增强其转移潜能，α-干扰素则减弱之[1，2]。利用两种干扰素对MA891转移潜能的不同影响，笔者试图分离克隆与转移相关的基因。采用mRNA差异显示法(differential display)，寻找两种干扰素诱导MA891细胞出现的差异表达基因片段[3]，本文是对这些cDNA片段的进一步研究。
1 材料和方法
Northern杂交筛选 MA891细胞培养、IFN处理及总RNA提取同既往研究[3]。总RNA电泳及转膜，质粒DNA提取与PEG纯化方法参照文献[4]。
探针制备：(1) 酶切反应：取10 μg质粒DNA，加入10×EcoRⅠ buffer及50U EcoRⅠ，用双蒸水补足反应体积，37℃酶切2 h以上，琼脂糖凝胶电泳鉴定。(2) 探针回收(WizardTM DNA clean up kit，Promega，USA): 待酶切完全后，用1%琼脂糖电泳分离酶切产物，切下探针凝胶条置于1.5 ml离心管中，加入200 μl 6 mol/L NaⅠ于60℃水浴溶解凝胶，加入1 ml混匀的树脂，室温放置5 min，以使树脂充分吸附DNA。再用套上柱子管的3 ml注射器推滤，去掉液体，加入2 ml 80%异丙醇推滤洗涤小柱子1次，取下小柱子置于1.5 ml离心管，13000 r/min离心20s， 再于室温放置5 min，然后加入适量的预热到65～75℃ TE或无菌水洗脱DNA， 12000 r/min离心3min，收集cDNA溶液，电泳鉴定并定量，-20℃保存。(3) 探针标记：按随机引物标记试剂盒(Promega，USA)说明书操作。
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预杂交及杂交反应：将转有RNA的尼龙膜放入杂交袋中，加入适量预杂交液(0.5 mol/L Na2 HPO4，7%SDS，1 mol/L EDTA)，去气泡并封口，65℃保温3 h。剪开杂交袋倒出预杂交液。每袋加入适量预杂交液及标记探针，赶尽气泡，封口。置65℃水浴杂交48～72 h。用2×SSC/0.1% SDS于65℃水浴洗膜3遍，每遍30 min。待膜自然干后，用保鲜膜包好并在暗室用Kodak X光胶片于暗盒中压片，-70℃ 48 h自显影。常规洗片。
cDNA片段测序 按Sequenase version 2.0 DNA测序试剂盒(USB Corporation，USA)说明书进行操作。
质粒DNA变性：每个质粒按每个引物3～5 μg取量，用蒸馏水稀释至50 μl，其中含0.1体积的2 mol/L NaOH及2 mol/L EDTA，37℃孵育30 min，用4倍体积的无水乙醇及0.1体积的3mol/L乙酸钠(pH4.5～5.5)于-20℃沉淀过夜。12000 r/min离心15 min，沉淀DNA用75%无水乙醇沉淀1次，每3～5 μg质粒DNA用7 μl双蒸水溶解。
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测序反应：每个DNA分别用M13(-40)引物及SP6引物进行双向测序。每个引物反应管取7 μl变性DNA(3～5 μg)，加入1 μl引物(0.5 pmol)及2 μl退火缓冲液(200 mmol/L NaCⅠ)。65℃反应2 min，于室温缓冲冷却约30 min。加入1 μl 0.1 mol/L DTT，2 μl稀释的Labeling mix，0.5 μl 35S-dATP及2 μl稀释后的测序酶(含焦磷酸酶)。混匀并短暂离心，室温反应约5min。分别取3.5 μl标记反应产物加入每个经37℃预热的2.5 μl双脱氧核苷酸(ddA，ddG，ddC，ddT)管中，37℃反应，每管加入4 μl终止液混匀，短暂离心后置于冰上。
电泳及放射自显影：测序反应产物用含8 mol/L尿素8%聚丙烯凝胶电泳。加样前，样品80℃变性，每孔加样。20W恒功率电泳至溴酚蓝至凝胶底部时结束电泳，取凝胶置15%甲醇-5%冰乙酸中固定约30 min，用滤纸平贴于凝胶上并揭下凝胶，覆盖保鲜膜，于干胶机80℃干胶2 h。待胶干燥后揭除保鲜膜并用Kodak感光胶片于室温或-70℃曝光2～5 d，显影读片。
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2 结果
IFN处理及未处理的MA891细胞RNA变性琼脂糖凝胶电泳显示3种样本均没有降解。
Northern杂交结果显示，10个克隆的cDNA片段中，T2γ、C4α、T11γ、G15γ cDNA有杂交信号且差异表达。C4α在IFNα处理的MA891细胞中表达强于IFN-γ处理的MA891细胞，而T2γ、T11γ、G15γ 3个片段在IFNγ处理的MA891细胞中表达强于IFNα处理的MA891细胞(图1)，与差异显示结果一致。其他6个片段——T2α、T6α、T16α、T17α、T5α1、T5α2没有杂交信号或没有差异，属于假阳性条带，未作进一步研究。
图1 Northern杂交结果
Fig 1 Northern hybridization
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a.C4α; b.T2γ; c.T11γ; d.G15γ;
e.β-actin as control
采用Sequenase Version 2.0测序试剂盒对T2γ、C4α、T11γ、G15γ cDNA片段进行测序(图2，3)。经查询：(1) G15γ是新序列，与已知序列没有同源性。(2) C4α与两个基因有很高的同源性，一个是小鼠线粒体基因组中的一个基因，另一个是小鼠“管家疏水蛋白”(domestics hydrophobic protein) mRNA序列； (3) T2γ与小鼠A-X actin有96%同源性，与小鼠β-actin约有90%同源性。(4) T11γ与褐鼠高血压相关mRNA基因有86%同源性。
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图2 T2γ、C4α、T11γ和G15γ cDNA片段序列
Fig 2 Sequences of T2γ，C4α，T11γ，and G15γ cDNA fragments
图3 部分测序结果
Fig 3 Auto-radiographs of partial sequencing of C4α，T2γ，T11γ，and G15γ
3 讨论
本研究对笔者差异显示反应得到的10个差异带(T2α、T2γ、C4α、T6α、T11γ、G15γ、T16α、T17α、T5α1、T5α2)[3]进行Northern筛选，证明T2γ、C4α、T11γ、G15γ为差异表达cDNA片段，其他条带或没有杂交信号，或没有差异，说明从胶上分离的差异带有近70%的假阳性，这与其他一些mRNA差异显示结果一致[5]。
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本研究对T2γ、C4α、T11γ及G15γ进行测序并向GenBank查询基因的同源性。
G15γ与已知的基因没有同源性，为新发现的基因序列。其生物学功能值得深入研究。
C4α与两个基因有96%的同源性，一个是小鼠线粒体基因组中的一个基因，另一个是小鼠“管家疏水蛋白”(domestic hydrophobic protein) mRNA序列，后者也是小鼠线粒体编码的一种蛋白，两者可能为同一基因。小鼠“管家疏水蛋白”是小鼠母系传递的一种次要组织相容性抗原(minor histocompatibility antigen)[6]，尚未见其有影响肿瘤转移的报道。本实验表明C4α经IFN-α处理表达增高，IFN-γ处理则表达降低，它是否为一种肿瘤转移的抑制蛋白，有待进一步研究。
T2γ与小鼠β-actin高度同源。Actin作为一种细胞骨架蛋白，与肿瘤转移的关系已有较多研究，当细胞内Actin增加时，细胞刚性增加，转移性减弱。但在本实验中T2γ被IFN-γ诱导表达，可见其可能不是影响MA891细胞转移性的重要因素。本实验按常规实验方法以β-actin作对照，但β-actin与T2γ的Northern杂交结果基本一致。既然β-actin已被调变，Northern杂交结果就不能以此作为对照，本实验以RNA琼脂糖电泳照片为对照，这在用其他mRNA差异显示方法分离肿瘤转移相关基因的研究中也见到使用[7]。
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T11γ与褐鼠高血压相关mRNA约90%同源。目前尚未见高血压相关mRNA与肿瘤转移关系的研究，因此该基因是否与MA891转移性相关亦有待进一步研究。
(致谢：本实验技术得到北京市肿瘤研究所柯杨老师及mRNA差异显示技术创立者Peng Liang指导)
张友会为通讯作者
参考文献
1 罗利群，张友会.γ干扰素促进小鼠乳腺癌转移.中华肿瘤杂志，1994，16: 251～254
2 罗利群，张友会，黄兰青，等.干扰素对小鼠乳腺癌细胞侵袭力及对侵袭转移相关基因表达的调变.中华肿瘤杂志， 1997，19:184～187
3 张权庚，张友会.mRNA差异显示法在分离肿瘤转移相关基因中的初步应用.中国医学科学院学报，1997，19:384～388
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4 侯云德.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社， 1992
5 Jan JMG，Henri PSB，Guido WMS.Identification of melanoma inhibitory activity and other differentially expressed messenger RNAs in human melanoma cell lines with different metastatic capacity by messenger RNA differential display.Cancer Res，1995，55:6237～6243
6 Loveland B，Wang CR，Yonekawa H，et al.Maternally transmitted histocompatibility antigen of mice: A hydrophobic peptide of a mitochondrially encoded protein.Cell，1990，60: 971～980
7 Salesiotis AN，Wang CK，Wang CD，et al.Identification of novel genes from stomach cancer cell lines by differential display.Cancer Letters，1995，91:47～54
(1997-04-20收稿), 百拇医药