甘露醇停搏液对未成熟心肌的保护作用
作者：关小明 廖崇先 陈道中
单位：福建医科大学附属协和医院心外科, 福建省胸心外科研究所(福州 350001)
关键词：甘露醇；未成熟心肌；缺血再灌注；兔
福建医科大学学报990307 目的 研究甘露醇停搏液对未成熟心肌的保护效果。 方法 采用21±2天的健康小白兔离体心脏，建立离体心脏左心做功模型，观察20 mmol/L甘露醇停搏液对心脏缺血120 min后心脏功能和超微结构的变化。 结果 甘露醇停博液组和St.Thomas停搏液组相比较，其心功能恢复较好，冠脉流量高，心肌线粒体丙二醛(MDA)含量低，心肌超微结构改变轻。 结论 加入甘露醇能提高St.Thomas 停搏液对未成熟心肌的保护效果。
Improved Recovery of Immature Myocardium with Mannitol Cardioplegia
, http://www.100md.com
Guan Xiaoming, Liao Chongxian, Chen Daozhong
(Department of Cardiovascular Surgery, The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University, Fuzhou, 350001)
Objective To determine the effect of mannitol enrichment to St.Thomas' Hospital cardioplegic solution on immature rabbit myocardium. Methods Isolated working rabbit hearts(21±2 days) were subjected to 120 minutes of hypothermic(4℃) cardioplegic arrest and 60 minutes of normothermic(37℃) reperfusion. The experimental group(group B) received standard St.Thomas Ⅱ cardioplegic solution with the addition of mannitol(20 mmol/L),and in the control group(group A) was induced by standard St. Thomas'Ⅱ cardioplgic solution. Results Recovery of cardiac functional indexes were significantly better in group B. The group A produced more levels of MDA of heart than that did in group B. The coronary flow increased in group B after reperfusion. Electron microscopic examination show relatively minimal myocardial cell injury in the heart of the group B as compare with those in the group A. Conclusion These results suggest that the myocardial protective effect of the ST. Thomas Hospital cardioplegic solution for immature hearts can be improved with the addition of mannitol.
, 百拇医药
Key words mannitol; immature myocardium; ischemic reperfusion; rabbit
同成熟心肌比较，未成熟心肌在结构、代谢和功能等方面有其自身的特点[1]。传统的成熟心肌保护技术应用于未成熟心肌，其效果出现争议，故未成熟心肌的保护技术亟待解决。 为追求更好的心肌保护方法，本实验在St.Thomas Ⅱ号停搏液中加入甘露醇研究其心肌保护效果。
1 资料和方法
1.1 材料和方法 选用21±2天的健康小白兔24只，体重420±30 g，雌雄不拘。实验动物经抗凝、击昏后，迅速开胸取出心脏。参照Neely等方法建立离体兔心左心做功模型,灌流液为K-H液，以95%O2+5%CO2混合气体平衡保持PO2 80～90 kPa,PCO2 4.6～6.0 kPa,pH 7.40±0.05,温度37.0±1.0℃,心脏前负荷1.47 kPa，后负荷5.39 kPa，冠状静脉流出液不回收。先Langendroff 逆行灌注15 min后，转入左心工作状态。左心做功稳定15 min，随机分为2组，每组各12只。A组(对照组):4℃标准St.Thomas Ⅱ心脏停博液；B组(实验组)：4 ℃标准St.Thomas Ⅱ停博液+甘露醇20 mmol/L。关闭左心房及主动脉插管,经主动脉根部以4.9 kPa压力灌注4℃ St.Thomas Ⅱ号停搏液或含甘露醇的St.Thomas Ⅱ号停搏液,首剂15 ml/kg体重,同时心表非氧合冷生理盐水降温，心肌温度维持在15℃直至复灌；停搏其间，每30 min复灌停跳液1次,剂量为10 ml/kg体重。停搏120 min，开放主动脉插管，恢复逆灌15 min，转入工作状态30 min。分别测定缺血前，再灌注15，30，60 min的各项指标。
, 百拇医药
1.2 观察指标 (1)由PTM-6B生理压力测试仪(浙江欧海电子仪器厂)测定左室收缩末压(LVsp)和左室舒张末压(LVedp)。(2)冠脉流量(CF)。(3)心肌组织丙二醛(MDA)含量测定：实验结束时取心室肌组织约1 g，研磨匀浆后，以硫代巴比妥酸法测定[2]。(4)超微结构的观察：实验结束时，取左心室前乳头肌根部周围1 mm×1 mm×1 mm透壁全层心肌组织，常规制备电镜标本，Hu-12A电镜(HITACHI，日本)下观察。
1.3 所有数据以均数±标准差表示，均数间采用t检验。
2 结 果
2.1 心功能及CF的变化 复灌后，B组心功能指标恢复明显优于A组。A组的CF比停搏前明显减少,B组无明显变化,见附表。
附表 停搏前、复灌后心功能的变化(%) 指 标
, 百拇医药
LVsp(kPa)
LVedp(kPa)
CF(ml/min)
停搏前
A组
79.5
±
4.38
9.33
±
2.46
5.50
±
, 百拇医药
0.81
B组
79.2
±
3.56
9.40
±
2.03
5.43
±
0.74
复灌15 min
A组
, 百拇医药
63.2
±
4.27
11.00
±
2.29
4.45
±
0.80
B组
80.5
±
4.72*
, 百拇医药
8.53
±
1.84*
5.52
±
0.78*
复灌30 min
A组
62.8
±
4.02
11.54
±
, 百拇医药
2.15
4.61
±
0.73
B组
81.2
±
4.81**
7.98
±
1.97**
5.67
±
, http://www.100md.com
0.82*
复灌60 min
A组
62.3
±
4.16
12.54
±
2.20
4.50
±
0.64
B组
, 百拇医药
79.3
±
4.51*
8.67
±
1.93*
5.58
±
0.78*
LVsp：左室收缩末压； LVedp：左室舒张末压； CF：冠脉流量. 与A组相比,*:P<0.05,**:P<0.01.
2.2 心肌组织MDA的测定 A组再灌注后心肌组织MDA含量为 1.36±0.33 nmol/Pr mg, B组为0.73±0.13 nmol/Pr mg,A组明显高于B组(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 心肌组织超微结构改变 A组的心肌细胞及间质明显水肿， 核周内质网明显扩张，肌丝断裂、溶解消失；线粒体不同程度肿胀，基质密度降低。B组的心肌细胞及间质未见水肿，心肌细胞内质网轻度扩张，线粒体未见明显肿胀，肌丝未见明显断裂溶解。
3 讨 论
自1955 年Melrose始用高钾停搏液以来，心肌保护的研究已有40余年的历史。当前使用的心脏停搏液是在成年动物实验的基础上研制出来的。许多资料表明，停搏液对发育成熟的心脏可提供极好的心肌保护作用，但对婴幼儿发育中的心脏的保护作用却不明显[3]。这是由于未成熟心肌与成熟心肌在结构功能和代谢等方面的差异所致。由于未成熟心肌的特点，目前国内外对此进行大量研究(如基础实验的研究及新的适合未成熟心肌的停搏液的研究)均未取得突破性进展，故通过添加基质来提高现有停搏液对未成熟心肌的保护作用仍不失为一个较好的手段。
应用离体灌注的工作心脏模型，不仅可以在精确控制前后负荷条件下测定心脏功能，还可排除神经、体液因素产生的影响，使实验结果更为明确，因此该模型广泛应用于心脏保护的研究。本实验用离体兔心工作模型，观察含有甘露醇的St.Thomas Ⅱ号停搏液对未成熟兔心的保护效果。本组的实验结果表明，甘露醇组的心功能指标的恢复明显优于对照组， 超微结构改变轻，显示出良好的心肌保护效果。
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在正常机体代谢过程中,不断产生的氧自由基在抗氧化系统(超氧化物岐化酶和过氧化氢酶)的作用下不断被清除,从而维持动态平衡。在缺血/再灌注病理状态下,氧自由基清除系统受到损伤和氧自由基的产生增加, 机体内氧自由基的浓度增加,引发脂质过氧化反应，导致组织损伤。甘露醇是一种低分子非代谢糖类，含有半醛基，通过其高渗作用减轻细胞水肿早为人们所熟悉，近10年又提出它有自由基清除作用[4]。关于甘露醇清除氧自由基的机理,England[5]等认为甘露醇的半醛基与OH-自由基反应,生成甘露醇自由基(MH2+OH-→MH-+H2O)，由于甘露醇自由基低毒，因而减轻了对细胞的损害。Ferriea[6]等认为低温缺氧状态下细胞膜通透性增加，小分子甘露醇可扩散入细胞胞浆达足量而产生对自由基的清除作用。Morris等认为甘露醇能提供完全的心肌保护通过防止过氧化氢铁对钙离子摄取的抑制作用[7]。笔者用硫代巴比妥酸比色法测定组织中过氧化脂质的代谢产物MDA的含量, 不仅可以反映损伤组织中氧自由基生成与否,还可以反映氧自由基造成组织损伤的严重程度。本实验结果表明，含甘露醇组的MDA含量明显低于对照组，证实了甘露醇是一种有效的氧自由基清除剂，它能减轻未成熟心肌细胞的结构和功能的损害，降低细胞膜对钙离子的通透性而减少钙离子在心肌内的聚集，故用以作为心麻痹液的常规成分具有重要的临床意义。
, 百拇医药
参考文献
1 Friedman WF. The intrinsic physiologic properties of the developing heart. Prog Cardiovasc Dis, 1972;15:87
2 Ohkawa H,Ohishi N,Yagi K,et al. Assay for lipid peroxides in amniotic tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979;95:351
3 Magovern JA,Pae WE,Miller CA,et al. The immature and mature myocardium. J Thorac Cardiovasc Surg, 1988;95:618
, 百拇医药
4 Del-maestro RF,Okabe E,Lehmann J,et al. Free radicals as mediators of tissue injury. Acta Physiol Scand, 1980(Suppl Ⅱ):429
5 England MD,Cavarocchi NC,O'Brien JF,et al. Influence of antioxidants(mannitol and allopurinol) on oxygen free radical generation during and after cardiopulmonary bypass. Circulation, 1986;74:Ⅲ-134
6 Ferreira R,Burgos M,Llesuy S,et al. Reduction of reperfusion injury with mannitol cardioplegia. Ann Thorac Surg, 1989;48:77
7 Morris TE,Sulakhe PV. Sacroplasmic reticulum Ca2+ pump dysfunction in rate cardiomyocytes briefly exposed to hydroxyl radicals. Free Radiac Biol Med, 1997;22(1～2):37
(收稿：1998-09-02 修回：1999-06-14), http://www.100md.com
单位：福建医科大学附属协和医院心外科, 福建省胸心外科研究所(福州 350001)
关键词：甘露醇；未成熟心肌；缺血再灌注；兔
福建医科大学学报990307 目的 研究甘露醇停搏液对未成熟心肌的保护效果。 方法 采用21±2天的健康小白兔离体心脏，建立离体心脏左心做功模型，观察20 mmol/L甘露醇停搏液对心脏缺血120 min后心脏功能和超微结构的变化。 结果 甘露醇停博液组和St.Thomas停搏液组相比较，其心功能恢复较好，冠脉流量高，心肌线粒体丙二醛(MDA)含量低，心肌超微结构改变轻。 结论 加入甘露醇能提高St.Thomas 停搏液对未成熟心肌的保护效果。
Improved Recovery of Immature Myocardium with Mannitol Cardioplegia
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Guan Xiaoming, Liao Chongxian, Chen Daozhong
(Department of Cardiovascular Surgery, The Affiliated Union Hospital,Fujian Medical University, Fuzhou, 350001)
Objective To determine the effect of mannitol enrichment to St.Thomas' Hospital cardioplegic solution on immature rabbit myocardium. Methods Isolated working rabbit hearts(21±2 days) were subjected to 120 minutes of hypothermic(4℃) cardioplegic arrest and 60 minutes of normothermic(37℃) reperfusion. The experimental group(group B) received standard St.Thomas Ⅱ cardioplegic solution with the addition of mannitol(20 mmol/L),and in the control group(group A) was induced by standard St. Thomas'Ⅱ cardioplgic solution. Results Recovery of cardiac functional indexes were significantly better in group B. The group A produced more levels of MDA of heart than that did in group B. The coronary flow increased in group B after reperfusion. Electron microscopic examination show relatively minimal myocardial cell injury in the heart of the group B as compare with those in the group A. Conclusion These results suggest that the myocardial protective effect of the ST. Thomas Hospital cardioplegic solution for immature hearts can be improved with the addition of mannitol.
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Key words mannitol; immature myocardium; ischemic reperfusion; rabbit
同成熟心肌比较，未成熟心肌在结构、代谢和功能等方面有其自身的特点[1]。传统的成熟心肌保护技术应用于未成熟心肌，其效果出现争议，故未成熟心肌的保护技术亟待解决。 为追求更好的心肌保护方法，本实验在St.Thomas Ⅱ号停搏液中加入甘露醇研究其心肌保护效果。
1 资料和方法
1.1 材料和方法 选用21±2天的健康小白兔24只，体重420±30 g，雌雄不拘。实验动物经抗凝、击昏后，迅速开胸取出心脏。参照Neely等方法建立离体兔心左心做功模型,灌流液为K-H液，以95%O2+5%CO2混合气体平衡保持PO2 80～90 kPa,PCO2 4.6～6.0 kPa,pH 7.40±0.05,温度37.0±1.0℃,心脏前负荷1.47 kPa，后负荷5.39 kPa，冠状静脉流出液不回收。先Langendroff 逆行灌注15 min后，转入左心工作状态。左心做功稳定15 min，随机分为2组，每组各12只。A组(对照组):4℃标准St.Thomas Ⅱ心脏停博液；B组(实验组)：4 ℃标准St.Thomas Ⅱ停博液+甘露醇20 mmol/L。关闭左心房及主动脉插管,经主动脉根部以4.9 kPa压力灌注4℃ St.Thomas Ⅱ号停搏液或含甘露醇的St.Thomas Ⅱ号停搏液,首剂15 ml/kg体重,同时心表非氧合冷生理盐水降温，心肌温度维持在15℃直至复灌；停搏其间，每30 min复灌停跳液1次,剂量为10 ml/kg体重。停搏120 min，开放主动脉插管，恢复逆灌15 min，转入工作状态30 min。分别测定缺血前，再灌注15，30，60 min的各项指标。
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1.2 观察指标 (1)由PTM-6B生理压力测试仪(浙江欧海电子仪器厂)测定左室收缩末压(LVsp)和左室舒张末压(LVedp)。(2)冠脉流量(CF)。(3)心肌组织丙二醛(MDA)含量测定：实验结束时取心室肌组织约1 g，研磨匀浆后，以硫代巴比妥酸法测定[2]。(4)超微结构的观察：实验结束时，取左心室前乳头肌根部周围1 mm×1 mm×1 mm透壁全层心肌组织，常规制备电镜标本，Hu-12A电镜(HITACHI，日本)下观察。
1.3 所有数据以均数±标准差表示，均数间采用t检验。
2 结 果
2.1 心功能及CF的变化 复灌后，B组心功能指标恢复明显优于A组。A组的CF比停搏前明显减少,B组无明显变化,见附表。
附表 停搏前、复灌后心功能的变化(%) 指 标
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LVsp(kPa)
LVedp(kPa)
CF(ml/min)
停搏前
A组
79.5
±
4.38
9.33
±
2.46
5.50
±
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0.81
B组
79.2
±
3.56
9.40
±
2.03
5.43
±
0.74
复灌15 min
A组
, 百拇医药
63.2
±
4.27
11.00
±
2.29
4.45
±
0.80
B组
80.5
±
4.72*
, 百拇医药
8.53
±
1.84*
5.52
±
0.78*
复灌30 min
A组
62.8
±
4.02
11.54
±
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2.15
4.61
±
0.73
B组
81.2
±
4.81**
7.98
±
1.97**
5.67
±
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0.82*
复灌60 min
A组
62.3
±
4.16
12.54
±
2.20
4.50
±
0.64
B组
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79.3
±
4.51*
8.67
±
1.93*
5.58
±
0.78*
LVsp：左室收缩末压； LVedp：左室舒张末压； CF：冠脉流量. 与A组相比,*:P<0.05,**:P<0.01.
2.2 心肌组织MDA的测定 A组再灌注后心肌组织MDA含量为 1.36±0.33 nmol/Pr mg, B组为0.73±0.13 nmol/Pr mg,A组明显高于B组(P<0.01)。
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2.3 心肌组织超微结构改变 A组的心肌细胞及间质明显水肿， 核周内质网明显扩张，肌丝断裂、溶解消失；线粒体不同程度肿胀，基质密度降低。B组的心肌细胞及间质未见水肿，心肌细胞内质网轻度扩张，线粒体未见明显肿胀，肌丝未见明显断裂溶解。
3 讨 论
自1955 年Melrose始用高钾停搏液以来，心肌保护的研究已有40余年的历史。当前使用的心脏停搏液是在成年动物实验的基础上研制出来的。许多资料表明，停搏液对发育成熟的心脏可提供极好的心肌保护作用，但对婴幼儿发育中的心脏的保护作用却不明显[3]。这是由于未成熟心肌与成熟心肌在结构功能和代谢等方面的差异所致。由于未成熟心肌的特点，目前国内外对此进行大量研究(如基础实验的研究及新的适合未成熟心肌的停搏液的研究)均未取得突破性进展，故通过添加基质来提高现有停搏液对未成熟心肌的保护作用仍不失为一个较好的手段。
应用离体灌注的工作心脏模型，不仅可以在精确控制前后负荷条件下测定心脏功能，还可排除神经、体液因素产生的影响，使实验结果更为明确，因此该模型广泛应用于心脏保护的研究。本实验用离体兔心工作模型，观察含有甘露醇的St.Thomas Ⅱ号停搏液对未成熟兔心的保护效果。本组的实验结果表明，甘露醇组的心功能指标的恢复明显优于对照组， 超微结构改变轻，显示出良好的心肌保护效果。
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在正常机体代谢过程中,不断产生的氧自由基在抗氧化系统(超氧化物岐化酶和过氧化氢酶)的作用下不断被清除,从而维持动态平衡。在缺血/再灌注病理状态下,氧自由基清除系统受到损伤和氧自由基的产生增加, 机体内氧自由基的浓度增加,引发脂质过氧化反应，导致组织损伤。甘露醇是一种低分子非代谢糖类，含有半醛基，通过其高渗作用减轻细胞水肿早为人们所熟悉，近10年又提出它有自由基清除作用[4]。关于甘露醇清除氧自由基的机理,England[5]等认为甘露醇的半醛基与OH-自由基反应,生成甘露醇自由基(MH2+OH-→MH-+H2O)，由于甘露醇自由基低毒，因而减轻了对细胞的损害。Ferriea[6]等认为低温缺氧状态下细胞膜通透性增加，小分子甘露醇可扩散入细胞胞浆达足量而产生对自由基的清除作用。Morris等认为甘露醇能提供完全的心肌保护通过防止过氧化氢铁对钙离子摄取的抑制作用[7]。笔者用硫代巴比妥酸比色法测定组织中过氧化脂质的代谢产物MDA的含量, 不仅可以反映损伤组织中氧自由基生成与否,还可以反映氧自由基造成组织损伤的严重程度。本实验结果表明，含甘露醇组的MDA含量明显低于对照组，证实了甘露醇是一种有效的氧自由基清除剂，它能减轻未成熟心肌细胞的结构和功能的损害，降低细胞膜对钙离子的通透性而减少钙离子在心肌内的聚集，故用以作为心麻痹液的常规成分具有重要的临床意义。
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参考文献
1 Friedman WF. The intrinsic physiologic properties of the developing heart. Prog Cardiovasc Dis, 1972;15:87
2 Ohkawa H,Ohishi N,Yagi K,et al. Assay for lipid peroxides in amniotic tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem, 1979;95:351
3 Magovern JA,Pae WE,Miller CA,et al. The immature and mature myocardium. J Thorac Cardiovasc Surg, 1988;95:618
, 百拇医药
4 Del-maestro RF,Okabe E,Lehmann J,et al. Free radicals as mediators of tissue injury. Acta Physiol Scand, 1980(Suppl Ⅱ):429
5 England MD,Cavarocchi NC,O'Brien JF,et al. Influence of antioxidants(mannitol and allopurinol) on oxygen free radical generation during and after cardiopulmonary bypass. Circulation, 1986;74:Ⅲ-134
6 Ferreira R,Burgos M,Llesuy S,et al. Reduction of reperfusion injury with mannitol cardioplegia. Ann Thorac Surg, 1989;48:77
7 Morris TE,Sulakhe PV. Sacroplasmic reticulum Ca2+ pump dysfunction in rate cardiomyocytes briefly exposed to hydroxyl radicals. Free Radiac Biol Med, 1997;22(1～2):37
(收稿：1998-09-02 修回：1999-06-14), http://www.100md.com