肝硬变患者TGF-β1 基因在外周血中表达及与PⅢP血清水平的关系
作者：邬光惠 黄耀煊 范公忍 张桂霞
单位：北京军区总医院解放军肝病研究所，北京 100700
关键词：肝硬变；转化生长因子-β1；Ⅲ型前胶原N端肽
肝硬变患者TGF 摘要 目的：为验证肝纤维化动物模型和慢性肝病患者肝组织中，转化生长因子(TGF-β1)的mRNA表达增强。作者分析肝硬变患者外周血TGF-β1 mRNA和血清中有活性的TGF-β1蛋白及其结果与Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢP)血清水平间的关系。方法：肝硬变患者 50 例，健康自愿者 8 人，取其外周血，分离单核细胞(PBMC)，提取总RNA，用巢式RT-PCR扩增TGF-β1 mRNA 并测定血清中TGF-β1和PⅢP的水平。结果：分析表明患者外周血单核细胞(PBMC)中TGF-β1 mRNA有高阳性率的表达。血清中TGF-β1与PⅢP的水平均明显高于对照。结论：研究结果证实肝硬变患者TGF-β1基因在外周血中表达增强，与PⅢP血清水平相关，表明TGF-β1可能在肝纤维化、胶原合成中起重要作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R 575.2
Transformation growth factor-β1 gene expression in the peripheral blood of patients with cirrhosis and its relation to PⅢP
Wu Guanghui, Huang Yaoxuan, Fan Gongren, Zhang Guixia (Beijing Army General Hospital, Institute of Hepatology of PLA, Beijing 100700)
Abstract Objective:The aims of the present study were to determine the expression of transformation growth factor-β1 (TGF-β1) mRNA and TGF-β1 protein in the peripheral blood and its relation to serum levels of procollagen type Ⅲ N terminal peptide (PⅢP) in the patients with cirrhosis. Methods:Peripheral blood samples were obtained from 50 patients with cirrhosis and 8 normal healthy volunteers. Total RNA was extracted from PBMC and TGF-β1 mRNA was amplified from total RNA by nested RT-PCR. Serum levels of TGF-β1 and PⅢP were determined. Results:TGF-β1 mRNA could be detected in the peripheral blood mononuclear (PBMC) with high positive rate and serum levels of TGF-β1 and PⅢP were significantly higher than controls. Conclusion:These results confirm the increased expression of TGF-β1 and the positive correlation between TGF-β1 and PⅢP in the patients with cirrhosis. And our results support the suggestion that TGF-β1 may be a significant factor in the increased collagen systhesis of human fibrosis.
, 百拇医药
Key words liver cirrhosis; transformation growth factor-β1; procollagen type Ⅲ N terminal peptide.
转化生长因子-β1(TGF-β1)在一些体外和体内的研究中均显示能刺激胶原和细胞外基质(ECM)的合成，同时又可通过抑制ECM降解以加强纤维的发生，在肝纤维化中起重要作用。但是这些结果多来自体外实验、动物模型和患者肝组织TGF-β1 mRNA表达的分析。Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢP)是一能较好反映肝脏纤维发生的血清标记物〔4〕。但不同作者对其在临床上应用所得的结论不尽相同〔5，6〕。本文对肝硬变患者分析外周血中的TGF-β1 mRNA和有生物活性的TGF-β1蛋白以及PⅢP的血清水平，研究它们之间的关系及其临床意义。
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1 对象和方法
1.1 对象 肝硬变患者 50 例为 1994～1996 年期间在本院住院诊断为肝硬变的患者，年龄 36～58 岁，男性 35 例，女性 15 例。对照组为健康自愿者 8 人。
1.2 方法
1.2.1 血清TGF-β1蛋白测定 用美国Promega公司产的TGF-β1免疫分析试剂盒测定患者血清中TGF-β1浓度，操作步骤按说明书进行。
1.2.2 PBMC TGF-β1 mRNA测定 肝硬变患者和健康者分别取外周血，用淋巴细胞分离液作密度梯度离心分离PBMC，用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取总RNA，经电泳鉴定后进行RT-PCR。化学合成一对引物的序列见下：
, 百拇医药
GCCCTGGACACCAACTATTGCT 1—22
AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG 140—161
第一步合成cDNA：反应溶液中含 1 μg oligodT, dNTP 1 mmol/L, RHasin 20 U 和MLV逆转录酶 200 U，总体重 20 ml， 42 ℃ 保温 60 min。第二步PCR；上述反应物取 5 μL 加到反应混合物中，后者含上述一对PCR引物 20 pmol/L， dNTP 200 μmol/L, Taq DNA 聚合酶 1 U 及相应缓冲液，总体重 50 μL。在PCR仪上 93 ℃ 变性 5 min 后进入PCR循环， 93 ℃ 45 s， 54 ℃ 45 s, 72 ℃ 60 s，循环 35 次，最后在 72 ℃ 继续反应 7 min 后放 4 ℃ 冷却。扩增产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.2.3 血清PⅢP测定 应用东兴生物工程公司产的人Ⅲ型前胶原肽检测试剂盒测定，操作按说明书进行。
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1.2.4 统计学处理 检测结果以
±s表示，组间比较用t检验。
2 结 果
2.1 肝硬变患者PBMC中TGF-β1 mRNA表达 肝硬变患者 25 例，按上述方法分离PBMC，应用RT-PCR 扩增TGF-β1 mRNA。扩增产物用 2% 琼脂糖电泳鉴定，以pBR′322-BstNI为分子量标准，有 18 例 (72%) 患者的标本在电泳图上显示在相当 160 bp 处有一特异的DNA片段区带如附图中第 3 号标本，对照组不出现区带。表明在肝硬变患者PBMC中TGF-β1 mRNA有高阳性率表达(附图)。
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附图 肝硬变患者PBMC中TGF-β1 mRNA RT-PCR产物电泳图 1.阴性对照；2～4.肝硬变患者PBMC标本；5.分子量标准
2.2 循环TGF-β1蛋白的测定 如附表所示肝硬变患者 50 例血清TGF-β1浓度的平均值明显高于对照组(P<0.01)。
附表 肝硬变患者血清中TGF-β1与PⅢP水平(±s)
组别
n
TGF-β1(mg/L)
, 百拇医药
PⅢP(×103U/L)
肝硬变患者
50
23.36±7.68
5.72±5.25
正常对照
25
7.96±3.43
0.71±0.42
2.3 PⅢP的血清水平 肝硬变患者 50 例血清中PⅢP的浓度，如附表所示明显高于对照组(P<0.01)。患者组PⅢP平均值高于对照组 75%。这 50 例肝硬变患者的PⅢP与TGF-β1血清水平之间存在有一定相关性，r=0.872。
, 百拇医药
3 讨 论
TGF-β1除存在于肝脏外还广泛分布于不同的正常细胞和器官中发挥多种生物功能。它被认为在细胞生长负调节中起有核心作用。文献报道TGF-β1具有刺激胶原合成作用，肝硬变患者前胶原α1(1) 的mRNA表达增加，TGF-β1是前胶原α1(1)表达的强诱导物。近有报告在能表达人TGF-β1的转基因小鼠身上证明TGF-β1在体内亦可刺激胶原α1(1) 的表达〔3〕。肝脏由于某些原因造成慢性损伤时，ECM分解与重建的平衡发生改变，出现过多促纤维发生因子，发生纤维化有可能进一步发展为肝硬变。TGF-β1除能刺激一些ECM组分如纤维结合素的合成外，亦可通过抑制组织降解以加强纤维发生，因此TGF-β1可能在纤维发生中起有独特的作用。但是关于这方面的研究过去文献上报告的多是体外细胞试验、动物试验和组织标本观察的结果，而且在组织中分析到高表达的TGF-β1 mRNA和前胶原α1(1) mRNA，不一定均能分别翻译为具有生物功能的TGF-β1和前胶原α1(1)。本研究的结果证明肝硬化患者外周血，TGF-β1 mRNA在PBMC中有较高表达，血清中有生物活性的TGF-β1水平较健康者明显升高，也就是说TGF-β1基因在患者体内不但在转录水平而且在翻译水平上有较高表达。
, 百拇医药
PⅢP是Ⅲ型前胶原前体转化为Ⅲ型胶原时释入血循环的肽，它与肝纤维发生、胶原的合成与降解有关，同时它受肝的炎症和胆汁分泌影响，故是肝纤维发生和炎症的标记物。然而有的研究者有不同报道，如观察到PⅢP与丙氨酸转氨酶测得值呈负相关〔5〕，110 例慢性乙型肝炎患者中只有 44% PⅢP血清水平升高〔6〕。但有更多研究者的报道指出，慢性肝病患者TGF-β1 mRNA在肝组织中表达增强，血清中PⅢP水平上升。本文结果证实肝硬变患者外周血中TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白表达均明显增强并与血清中PⅢP水平呈正相关。这些结果支持这样一种观点即TGF-β1在肝纤维化中起有重要作用。此外，本文不用肝组织，而是用外周血测TGF-β1 mRNA和循环TGF-β1以及PⅢP血清水平，是无损伤的动态观察，故为较好的标记物，对于肝纤维化的基础研究和临床观察有重要实用意义。
, 百拇医药 (本文照片为本院摄影室李行忠同志所摄，特此致谢)
参考文献
1 Annoni G, Weiner FR, Zern MA. Increased transforming growth factor-β1 expression in humam liver disease. J Hepatology, 1992，14:259
2 Castilla A, Prieto J. Human fibrogenesis and transforming growth factor beta-1. J Hepatology, 1993， 18:378
3 Hellerbrand C, Stefarovie B, Glordano F et al. TGF-β1 stimulates hepatic collagen α1 (1) expression in vivo. Gastroenterology, 1997，112(4 Suppl): A1281
, 百拇医药
4 Gerling B, Becker M, Waldschmidt J et al. Elevated serum aminoterminal procollagen type-Ⅲ peptide parallels collagen accumulation in rats with secondary biliary fibrosis. J Hepatology, 1996，25:27
5 Diaz F, Collazos J. Genolla J. Study of serum procollagen type Ⅲ peptide in patients with hepatic cirrhotic cirrhosis from a clinical point of view. Clin Investig, 1993，71(5):416
6 Glustina G, Fattovich G, De Paoli M et al. Serum procollagen type Ⅲ peptide activity and ressponse to interferon-alpha therapy. Int J Clin Lab Res, 1996， 26(1):33
(1999—01—14收稿，1999—02—12修回), 百拇医药
单位：北京军区总医院解放军肝病研究所，北京 100700
关键词：肝硬变；转化生长因子-β1；Ⅲ型前胶原N端肽
肝硬变患者TGF 摘要 目的：为验证肝纤维化动物模型和慢性肝病患者肝组织中，转化生长因子(TGF-β1)的mRNA表达增强。作者分析肝硬变患者外周血TGF-β1 mRNA和血清中有活性的TGF-β1蛋白及其结果与Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢP)血清水平间的关系。方法：肝硬变患者 50 例，健康自愿者 8 人，取其外周血，分离单核细胞(PBMC)，提取总RNA，用巢式RT-PCR扩增TGF-β1 mRNA 并测定血清中TGF-β1和PⅢP的水平。结果：分析表明患者外周血单核细胞(PBMC)中TGF-β1 mRNA有高阳性率的表达。血清中TGF-β1与PⅢP的水平均明显高于对照。结论：研究结果证实肝硬变患者TGF-β1基因在外周血中表达增强，与PⅢP血清水平相关，表明TGF-β1可能在肝纤维化、胶原合成中起重要作用。
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中国图书资料分类法分类号 R 575.2
Transformation growth factor-β1 gene expression in the peripheral blood of patients with cirrhosis and its relation to PⅢP
Wu Guanghui, Huang Yaoxuan, Fan Gongren, Zhang Guixia (Beijing Army General Hospital, Institute of Hepatology of PLA, Beijing 100700)
Abstract Objective:The aims of the present study were to determine the expression of transformation growth factor-β1 (TGF-β1) mRNA and TGF-β1 protein in the peripheral blood and its relation to serum levels of procollagen type Ⅲ N terminal peptide (PⅢP) in the patients with cirrhosis. Methods:Peripheral blood samples were obtained from 50 patients with cirrhosis and 8 normal healthy volunteers. Total RNA was extracted from PBMC and TGF-β1 mRNA was amplified from total RNA by nested RT-PCR. Serum levels of TGF-β1 and PⅢP were determined. Results:TGF-β1 mRNA could be detected in the peripheral blood mononuclear (PBMC) with high positive rate and serum levels of TGF-β1 and PⅢP were significantly higher than controls. Conclusion:These results confirm the increased expression of TGF-β1 and the positive correlation between TGF-β1 and PⅢP in the patients with cirrhosis. And our results support the suggestion that TGF-β1 may be a significant factor in the increased collagen systhesis of human fibrosis.
, 百拇医药
Key words liver cirrhosis; transformation growth factor-β1; procollagen type Ⅲ N terminal peptide.
转化生长因子-β1(TGF-β1)在一些体外和体内的研究中均显示能刺激胶原和细胞外基质(ECM)的合成，同时又可通过抑制ECM降解以加强纤维的发生，在肝纤维化中起重要作用。但是这些结果多来自体外实验、动物模型和患者肝组织TGF-β1 mRNA表达的分析。Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢP)是一能较好反映肝脏纤维发生的血清标记物〔4〕。但不同作者对其在临床上应用所得的结论不尽相同〔5，6〕。本文对肝硬变患者分析外周血中的TGF-β1 mRNA和有生物活性的TGF-β1蛋白以及PⅢP的血清水平，研究它们之间的关系及其临床意义。
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1 对象和方法
1.1 对象 肝硬变患者 50 例为 1994～1996 年期间在本院住院诊断为肝硬变的患者，年龄 36～58 岁，男性 35 例，女性 15 例。对照组为健康自愿者 8 人。
1.2 方法
1.2.1 血清TGF-β1蛋白测定 用美国Promega公司产的TGF-β1免疫分析试剂盒测定患者血清中TGF-β1浓度，操作步骤按说明书进行。
1.2.2 PBMC TGF-β1 mRNA测定 肝硬变患者和健康者分别取外周血，用淋巴细胞分离液作密度梯度离心分离PBMC，用异硫氰酸胍-酚-氯仿法提取总RNA，经电泳鉴定后进行RT-PCR。化学合成一对引物的序列见下：
, 百拇医药
GCCCTGGACACCAACTATTGCT 1—22
AGGCTCCAAATGTAGGGGCAGG 140—161
第一步合成cDNA：反应溶液中含 1 μg oligodT, dNTP 1 mmol/L, RHasin 20 U 和MLV逆转录酶 200 U，总体重 20 ml， 42 ℃ 保温 60 min。第二步PCR；上述反应物取 5 μL 加到反应混合物中，后者含上述一对PCR引物 20 pmol/L， dNTP 200 μmol/L, Taq DNA 聚合酶 1 U 及相应缓冲液，总体重 50 μL。在PCR仪上 93 ℃ 变性 5 min 后进入PCR循环， 93 ℃ 45 s， 54 ℃ 45 s, 72 ℃ 60 s，循环 35 次，最后在 72 ℃ 继续反应 7 min 后放 4 ℃ 冷却。扩增产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
1.2.3 血清PⅢP测定 应用东兴生物工程公司产的人Ⅲ型前胶原肽检测试剂盒测定，操作按说明书进行。
, http://www.100md.com
1.2.4 统计学处理 检测结果以
±s表示，组间比较用t检验。2 结 果
2.1 肝硬变患者PBMC中TGF-β1 mRNA表达 肝硬变患者 25 例，按上述方法分离PBMC，应用RT-PCR 扩增TGF-β1 mRNA。扩增产物用 2% 琼脂糖电泳鉴定，以pBR′322-BstNI为分子量标准，有 18 例 (72%) 患者的标本在电泳图上显示在相当 160 bp 处有一特异的DNA片段区带如附图中第 3 号标本，对照组不出现区带。表明在肝硬变患者PBMC中TGF-β1 mRNA有高阳性率表达(附图)。
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附图 肝硬变患者PBMC中TGF-β1 mRNA RT-PCR产物电泳图 1.阴性对照；2～4.肝硬变患者PBMC标本；5.分子量标准
2.2 循环TGF-β1蛋白的测定 如附表所示肝硬变患者 50 例血清TGF-β1浓度的平均值明显高于对照组(P<0.01)。
附表 肝硬变患者血清中TGF-β1与PⅢP水平(
±s)组别
n
TGF-β1(mg/L)
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PⅢP(×103U/L)
肝硬变患者
50
23.36±7.68
5.72±5.25
正常对照
25
7.96±3.43
0.71±0.42
2.3 PⅢP的血清水平 肝硬变患者 50 例血清中PⅢP的浓度，如附表所示明显高于对照组(P<0.01)。患者组PⅢP平均值高于对照组 75%。这 50 例肝硬变患者的PⅢP与TGF-β1血清水平之间存在有一定相关性，r=0.872。
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3 讨 论
TGF-β1除存在于肝脏外还广泛分布于不同的正常细胞和器官中发挥多种生物功能。它被认为在细胞生长负调节中起有核心作用。文献报道TGF-β1具有刺激胶原合成作用，肝硬变患者前胶原α1(1) 的mRNA表达增加，TGF-β1是前胶原α1(1)表达的强诱导物。近有报告在能表达人TGF-β1的转基因小鼠身上证明TGF-β1在体内亦可刺激胶原α1(1) 的表达〔3〕。肝脏由于某些原因造成慢性损伤时，ECM分解与重建的平衡发生改变，出现过多促纤维发生因子，发生纤维化有可能进一步发展为肝硬变。TGF-β1除能刺激一些ECM组分如纤维结合素的合成外，亦可通过抑制组织降解以加强纤维发生，因此TGF-β1可能在纤维发生中起有独特的作用。但是关于这方面的研究过去文献上报告的多是体外细胞试验、动物试验和组织标本观察的结果，而且在组织中分析到高表达的TGF-β1 mRNA和前胶原α1(1) mRNA，不一定均能分别翻译为具有生物功能的TGF-β1和前胶原α1(1)。本研究的结果证明肝硬化患者外周血，TGF-β1 mRNA在PBMC中有较高表达，血清中有生物活性的TGF-β1水平较健康者明显升高，也就是说TGF-β1基因在患者体内不但在转录水平而且在翻译水平上有较高表达。
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PⅢP是Ⅲ型前胶原前体转化为Ⅲ型胶原时释入血循环的肽，它与肝纤维发生、胶原的合成与降解有关，同时它受肝的炎症和胆汁分泌影响，故是肝纤维发生和炎症的标记物。然而有的研究者有不同报道，如观察到PⅢP与丙氨酸转氨酶测得值呈负相关〔5〕，110 例慢性乙型肝炎患者中只有 44% PⅢP血清水平升高〔6〕。但有更多研究者的报道指出，慢性肝病患者TGF-β1 mRNA在肝组织中表达增强，血清中PⅢP水平上升。本文结果证实肝硬变患者外周血中TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白表达均明显增强并与血清中PⅢP水平呈正相关。这些结果支持这样一种观点即TGF-β1在肝纤维化中起有重要作用。此外，本文不用肝组织，而是用外周血测TGF-β1 mRNA和循环TGF-β1以及PⅢP血清水平，是无损伤的动态观察，故为较好的标记物，对于肝纤维化的基础研究和临床观察有重要实用意义。
, 百拇医药 (本文照片为本院摄影室李行忠同志所摄，特此致谢)
参考文献
1 Annoni G, Weiner FR, Zern MA. Increased transforming growth factor-β1 expression in humam liver disease. J Hepatology, 1992，14:259
2 Castilla A, Prieto J. Human fibrogenesis and transforming growth factor beta-1. J Hepatology, 1993， 18:378
3 Hellerbrand C, Stefarovie B, Glordano F et al. TGF-β1 stimulates hepatic collagen α1 (1) expression in vivo. Gastroenterology, 1997，112(4 Suppl): A1281
, 百拇医药
4 Gerling B, Becker M, Waldschmidt J et al. Elevated serum aminoterminal procollagen type-Ⅲ peptide parallels collagen accumulation in rats with secondary biliary fibrosis. J Hepatology, 1996，25:27
5 Diaz F, Collazos J. Genolla J. Study of serum procollagen type Ⅲ peptide in patients with hepatic cirrhotic cirrhosis from a clinical point of view. Clin Investig, 1993，71(5):416
6 Glustina G, Fattovich G, De Paoli M et al. Serum procollagen type Ⅲ peptide activity and ressponse to interferon-alpha therapy. Int J Clin Lab Res, 1996， 26(1):33
(1999—01—14收稿，1999—02—12修回), 百拇医药