一个BMD家族基因短串联重复顺序多态性分析
作者：蔡竖平 沈定国 汪江
单位：解放军总医院肌病研究室，北京 100853
关键词：肌营养障碍；聚合酶链反应；短串联重复顺序
一个BMD家族基因短串联重复顺序多态性分析 摘要 目的：在一个一代发病的Becker型肌营养不良家系中进行等位片段长度多态性分析，识别患者，携带者及正常后代不同的单体型。方法：用多重聚合酶链反应方法扩增Dystrophin基因外显子，检测有无外显子缺失，用聚合酶链反应方法扩增位于Dystrophin基因内含子的短串联重复顺序(STR44， STR45， STR49， STR50)，所得产物进行等位片段长度多态性分析。结果：先证者第 17， 19 及 45 号外显子缺失，STR44， STR45 位点等位片段缺失，先证者之母相应位点为半合子，为缺失携带者，先证者之姐得到来自其父母的两组正常单体型。结论：短串联重复顺序多态性分析方法可以准确而迅速地区分正常及风险单体型，可用于Duchenne型或Becker型肌营养不良家系中检出携带者及产前诊断。
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中国图书资料分类法分类号 R 394
Gene analysis in the family of Becker muscular dystrophy, by short tandem repeat sequence polymorphism
Cai Shuping, Shen Dingguo, Wang Jiang (Division of Neuromuscular disorders Research, General Hospital of PLA, Beijing, 100853)
Abstract Objective:Allelic fragment length polymorphism analysis was performed in the family of males with Becker muscular dystrophy in one generation in order to type haplotypes among the patients, carrier and normal offspring. Methods:Deletion analysis of the patients were performed using multiplex polymerase chain reaction (PCR) of amplification with 9 dystrophin exons described by Chamberlain et al, allelic fragment length polymorphism analysis was made on DNA with PCR amplification using the intragenic short tandem repeat (STR) sequence (STR44, STR45, STR49 and STR50) in the members of the family. Results:The deletions of exons 17, 19 and 45, as well as deletions of allelic fragments at the loci of STR44, STR45 were determined in the patients, hemizygosity at those two loci were detected and carrier status ascertained in the mother of the patients. The normal haplotypes were typed in the sister of the patients. Conclusion:The method of STR sequence polymorphism analysis can determine haplotypes at normal status or at risk status, it would be used in prenatal diagnosis and carrier detection in the families of Duchenne and Becker muscular dystrophy.
, 百拇医药
Key words muscular dystrophy; polymerase chain reaction; short tandem repeat sequence
Duchenne和Becker型肌营养不良症是X染色体隐性遗传的等位基因病，其病理变化为骨骼肌内抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)异常或缺乏，引起骨骼肌变性或坏死。由于DMD/BMD是较常见的遗传病，因此研究其诊断，产前诊断及携带者检测的方法一直得到高度重视，并在近年取得了长足的进展。使用多重PCR和Southern blot方法，可检测大约60%的DMD患者的基因缺失〔1〕，而其余的患者，尤其是产前诊断及携带者检测则仅能依靠限制性片段长度多态性(RFLP)分析。这个方法由于操作繁复，费时，结果判定受多因素影响而很难在临床应用。
本研究中，我们采用多重PCR检测患者Dystrophin缺失“热点”的 9 对外显子〔1〕，确定有无基因缺失，然后用位于Dystrophin基因内含子的 4 个短串联重复顺序(short tandem repeat, STR)行连锁分析〔2〕，得到先证者，携带者及正常后代不同的单体型。
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1 对象和方法
1.1 对象 患者资料BMD家系来自解放军总医院肌病门诊，经临床及肌电图诊断为BMD。病史：此家系一代 3 兄弟均患BMD，就诊时II-5 31 岁，II-7 26 岁，II-2， 45 岁(未就诊)。三兄弟 16 岁以前均无明显异常， 16 岁以后发生走路缓慢，易摔跤，随后发现双大腿肌萎缩及腓肠肌肥大， 26 岁后蹲下起立及上楼困难。除三兄弟外，家族中无类似患者。查体(II-5，II-7)：近端肌萎缩，肌力 2～4 级，双腓肠肌肥大，跟踺反射存在，膝反射未引出。EMG：肌原性受损(II-5，II-7)。LDH： 151 IU/L (II-5)， 164 IU/L (II-7) CPK：1445 IU/L (II-5)， 1554 IU/L (II-7)。
DNA样品：抽取静脉血 5 ml，常规提取白细胞，用氯仿/酚法抽提白细胞核DNA，溶于TE中备用。
1.2 PCR方法及条件 多重PCR扩增采用Chamberlain发表的 9 对引物〔1〕。反应总体积 50 μl，含 10 × 缓冲液 5 μl，dNTP各 0.2 mmol/L， 2.0 mmol/L MgCl2，每种引物 25 pmol，模板DNA 0.5～1 μg， 4～5 U Taq 多聚酶(新红星公司)。扩增条件： 97 ℃ 预变性 7 min， 94 ℃ 变性 45 s， 55 ℃ 退火 50 s， 70 ℃ 延伸 2 min， 30 个循环，最后延伸7 min。STR序列引物位于Dystrophin基因第 44， 45， 49， 50 号内含子〔2〕，反应总体积 30 μl，含 10 × 缓冲液 3 μl，dNTP 各 0.2 mmol/L， 1.5 mmol/L MgCl2，每种引物 30 pmol，模板DNA 0.2～0.5 μg， 1.5 U Taq 多聚酶。扩增条件： 97 ℃ 预变性 7 min， 94 ℃ 变性 45 s， 53 ℃ 退火 50 s， 65 ℃ 延伸 3 min， 35 个循环，最后延伸 10 min。
, 百拇医药
1.3 电泳 PCR产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察。电压 70 V，时间 1.5 h。STR扩增产物经琼脂糖电泳初步观察后用 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。电压 600 V，时间 1.5 h， 0.2% 硝酸银染色。
2 结 果
BMD家族系谱图及STR-单体型分析结果见图 1。
图1 Becker型肌营养不良症一家族系谱图及单体型分析
所得到的 2 例先证者DNA标本均先用多重PCR方法行外显子扩增，显示II-5 和II-7 的 17，19，45 号外显子缺失(图 1)，STR多态性分析结果示，II-5 和 II-7 位于STR-44， STR-45 位点的多态性片段缺失(图2a,b)，而STR-49，STR-50 位点遗传了母亲的一条X染色体上的相应片段C3，D2(图3a,b)。II-3 得到了一组来自父亲的染色体STR片段及一组来自母亲另一条染色体的与其患病的兄弟不同的STR片段(图 2，图 3)，这表示II-3 没有遗传其母的携带致病基因的染色体，因此她是正常人，她的儿子(III-2)也为正常人。II-2虽未就诊，由于其致病X染色体一定遗传给他的女儿(III-1)，III-1 应为基因携带者。I-2 的X染色体上STR44， STR45 位点只有一条扩增带，表示一条X染色体该部位缺失或者是罕见的纯合，据文献报告这两个位点的杂合频率分别为 87% 和 88.7%〔2〕，纯合的机会少，而这两个部位的纯合同时出现在其后代的基因缺失区更为罕见，因而这位女性STR44， STR45 位点实际应为半合子，她携带一条有缺失的X染色体并遗传给后代。
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图2 STR多态性分析结果
a: 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示BMD家族成员STR-44 位点多态性片段。II-5 STR-44 扩增片段缺失，以DEL表示。两条扩增片段以 A1、A2 表示。b: BMD家族STR-45 位点的多态性片段。II-7 显示STR-45 扩增片段缺失(DEL)，扩增片段均以 B1 表示(扩增片段的长度为参照分子量标准的估计值，下同)
图3 STR-49、STR-50 多态性分析结果
a: BMD家族STR-49 位点的多态性片段，分别以 C1、C2 表示。b: BMD家族STR-50 位点的多态性片段，分别以 D1、 D2、 D3 表示。
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3 讨 论
在实验中，我们在一个一代发病的家系中用多重PCR方法扩增Dystrophin基因外显子，发现两个患者表现了同样的 17， 19， 45 号外显子缺失。使用STR序列引物扩增发现STR-44， STR-45 位点缺失，因此 3′ 端的缺失涵盖了从第 44 号内含子， 45 号外显子到 45 号内含子区域，估计其物理距离大约为 152～153 kb。 44 号内含子跨度较大，已知为缺失断端最密集的区域〔3，4〕。由于不可能使用复盖Dystrophin全长的PCR引物，所以未能详细描绘Dystrophin两端缺失范围。
本实验分析了一个少见的一代多个患者的家系。这类家系的发病机制较为复杂，它可能为隐蔽的家族性DMD，致病基因由女性携带，在以前的几代中未能表现。它也可能是发生在先证者母亲的胚胎发育早期的新生突变，由于突变发生在外胚层，中胚层及内胚层分化以前，它可能导致生殖细胞全部为突变细胞，而体细胞是嵌合型。第三种可能性是发生在其外祖父母的新生突变，其母亲为DMD基因携带者。本实验STR-单体型分析表明I-2 应为缺失杂合子，那么突变发生在先证者的外祖父母，母亲是致病基因携带者的可能性大。在这种一代家系中，致病基因可多次遗传最终导致家族性DMD〔4，5〕。
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本实验使用 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在每个STR位点分别测出 1～3 个等位片段，然而片段大小与文献报告不尽一致〔2，4〕，如STR-50 位点最小片段约为 212 bp，而文献报告最小片段为 233，这可能是中国汉族与其它人种之间种族差异的结果。有关我国各民族STR位点等位片段测定结果尚未见报告。
本文所研究的STR位点具有高度的多态性(杂合性频率为 72% ～ 93%，等位片段数目为 6 ～ 19)，这些位点高度的多态性减少了在一个正常女性 4 个位点均为纯合体的可能性，从而可以为遗传咨询提供更多信息，提高了DNA连锁分析的效率和精确性。结合 4 个基因内重复位点及末端(CA)n标记，可以识别基因内重组并能在几乎所有DMD/BMD家系提供所需的诊断信息〔2，4〕。
笔者在国内首次报告了在一代发病的BMD家系中STR多态性分析结果。以PCR扩增为基础的STR序列多态性分析在携带者检测、产前诊断及遗传咨询方面有良好的应用前景。
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国家自然科学基金资助项目，批准号 39370258
参考文献
1 Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE et al. Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ et al eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press： New York London, 1990. 272-281
2 Clemens PR, Fenwick RG, Chamberlain JS et al. Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families, using dinucleotide repeat polymorphisms. Am J Hum Genet, 1991, 49:951
, 百拇医药
3 Tihy F, Vogt N, Recan D et al. Skewed inactivation of an X chromosome deleted at the dystrophin gene in an asymptomatic mother and her affected daughter. Hum Genet, 1994, 93:563
4 Chakraborty R, Zhong Y, de Andrade M et al. Linkage disequilibria among (CA) n polymorphisms in the human dystrophin gene and their implications in carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics, 1994, 21:567
5 Bunyan DJ, Robinson DO, Collins AL et al. Germline and somatic mosaicism in a female carrier of Duchenne muscular dystrophy. Hum Genet, 1994,93:541
(1999—02—05收稿，1999—03—15修回), http://www.100md.com
单位：解放军总医院肌病研究室，北京 100853
关键词：肌营养障碍；聚合酶链反应；短串联重复顺序
一个BMD家族基因短串联重复顺序多态性分析 摘要 目的：在一个一代发病的Becker型肌营养不良家系中进行等位片段长度多态性分析，识别患者，携带者及正常后代不同的单体型。方法：用多重聚合酶链反应方法扩增Dystrophin基因外显子，检测有无外显子缺失，用聚合酶链反应方法扩增位于Dystrophin基因内含子的短串联重复顺序(STR44， STR45， STR49， STR50)，所得产物进行等位片段长度多态性分析。结果：先证者第 17， 19 及 45 号外显子缺失，STR44， STR45 位点等位片段缺失，先证者之母相应位点为半合子，为缺失携带者，先证者之姐得到来自其父母的两组正常单体型。结论：短串联重复顺序多态性分析方法可以准确而迅速地区分正常及风险单体型，可用于Duchenne型或Becker型肌营养不良家系中检出携带者及产前诊断。
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中国图书资料分类法分类号 R 394
Gene analysis in the family of Becker muscular dystrophy, by short tandem repeat sequence polymorphism
Cai Shuping, Shen Dingguo, Wang Jiang (Division of Neuromuscular disorders Research, General Hospital of PLA, Beijing, 100853)
Abstract Objective:Allelic fragment length polymorphism analysis was performed in the family of males with Becker muscular dystrophy in one generation in order to type haplotypes among the patients, carrier and normal offspring. Methods:Deletion analysis of the patients were performed using multiplex polymerase chain reaction (PCR) of amplification with 9 dystrophin exons described by Chamberlain et al, allelic fragment length polymorphism analysis was made on DNA with PCR amplification using the intragenic short tandem repeat (STR) sequence (STR44, STR45, STR49 and STR50) in the members of the family. Results:The deletions of exons 17, 19 and 45, as well as deletions of allelic fragments at the loci of STR44, STR45 were determined in the patients, hemizygosity at those two loci were detected and carrier status ascertained in the mother of the patients. The normal haplotypes were typed in the sister of the patients. Conclusion:The method of STR sequence polymorphism analysis can determine haplotypes at normal status or at risk status, it would be used in prenatal diagnosis and carrier detection in the families of Duchenne and Becker muscular dystrophy.
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Key words muscular dystrophy; polymerase chain reaction; short tandem repeat sequence
Duchenne和Becker型肌营养不良症是X染色体隐性遗传的等位基因病，其病理变化为骨骼肌内抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)异常或缺乏，引起骨骼肌变性或坏死。由于DMD/BMD是较常见的遗传病，因此研究其诊断，产前诊断及携带者检测的方法一直得到高度重视，并在近年取得了长足的进展。使用多重PCR和Southern blot方法，可检测大约60%的DMD患者的基因缺失〔1〕，而其余的患者，尤其是产前诊断及携带者检测则仅能依靠限制性片段长度多态性(RFLP)分析。这个方法由于操作繁复，费时，结果判定受多因素影响而很难在临床应用。
本研究中，我们采用多重PCR检测患者Dystrophin缺失“热点”的 9 对外显子〔1〕，确定有无基因缺失，然后用位于Dystrophin基因内含子的 4 个短串联重复顺序(short tandem repeat, STR)行连锁分析〔2〕，得到先证者，携带者及正常后代不同的单体型。
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1 对象和方法
1.1 对象 患者资料BMD家系来自解放军总医院肌病门诊，经临床及肌电图诊断为BMD。病史：此家系一代 3 兄弟均患BMD，就诊时II-5 31 岁，II-7 26 岁，II-2， 45 岁(未就诊)。三兄弟 16 岁以前均无明显异常， 16 岁以后发生走路缓慢，易摔跤，随后发现双大腿肌萎缩及腓肠肌肥大， 26 岁后蹲下起立及上楼困难。除三兄弟外，家族中无类似患者。查体(II-5，II-7)：近端肌萎缩，肌力 2～4 级，双腓肠肌肥大，跟踺反射存在，膝反射未引出。EMG：肌原性受损(II-5，II-7)。LDH： 151 IU/L (II-5)， 164 IU/L (II-7) CPK：1445 IU/L (II-5)， 1554 IU/L (II-7)。
DNA样品：抽取静脉血 5 ml，常规提取白细胞，用氯仿/酚法抽提白细胞核DNA，溶于TE中备用。
1.2 PCR方法及条件 多重PCR扩增采用Chamberlain发表的 9 对引物〔1〕。反应总体积 50 μl，含 10 × 缓冲液 5 μl，dNTP各 0.2 mmol/L， 2.0 mmol/L MgCl2，每种引物 25 pmol，模板DNA 0.5～1 μg， 4～5 U Taq 多聚酶(新红星公司)。扩增条件： 97 ℃ 预变性 7 min， 94 ℃ 变性 45 s， 55 ℃ 退火 50 s， 70 ℃ 延伸 2 min， 30 个循环，最后延伸7 min。STR序列引物位于Dystrophin基因第 44， 45， 49， 50 号内含子〔2〕，反应总体积 30 μl，含 10 × 缓冲液 3 μl，dNTP 各 0.2 mmol/L， 1.5 mmol/L MgCl2，每种引物 30 pmol，模板DNA 0.2～0.5 μg， 1.5 U Taq 多聚酶。扩增条件： 97 ℃ 预变性 7 min， 94 ℃ 变性 45 s， 53 ℃ 退火 50 s， 65 ℃ 延伸 3 min， 35 个循环，最后延伸 10 min。
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1.3 电泳 PCR产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察。电压 70 V，时间 1.5 h。STR扩增产物经琼脂糖电泳初步观察后用 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。电压 600 V，时间 1.5 h， 0.2% 硝酸银染色。
2 结 果
BMD家族系谱图及STR-单体型分析结果见图 1。
图1 Becker型肌营养不良症一家族系谱图及单体型分析
所得到的 2 例先证者DNA标本均先用多重PCR方法行外显子扩增，显示II-5 和II-7 的 17，19，45 号外显子缺失(图 1)，STR多态性分析结果示，II-5 和 II-7 位于STR-44， STR-45 位点的多态性片段缺失(图2a,b)，而STR-49，STR-50 位点遗传了母亲的一条X染色体上的相应片段C3，D2(图3a,b)。II-3 得到了一组来自父亲的染色体STR片段及一组来自母亲另一条染色体的与其患病的兄弟不同的STR片段(图 2，图 3)，这表示II-3 没有遗传其母的携带致病基因的染色体，因此她是正常人，她的儿子(III-2)也为正常人。II-2虽未就诊，由于其致病X染色体一定遗传给他的女儿(III-1)，III-1 应为基因携带者。I-2 的X染色体上STR44， STR45 位点只有一条扩增带，表示一条X染色体该部位缺失或者是罕见的纯合，据文献报告这两个位点的杂合频率分别为 87% 和 88.7%〔2〕，纯合的机会少，而这两个部位的纯合同时出现在其后代的基因缺失区更为罕见，因而这位女性STR44， STR45 位点实际应为半合子，她携带一条有缺失的X染色体并遗传给后代。
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图2 STR多态性分析结果
a: 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示BMD家族成员STR-44 位点多态性片段。II-5 STR-44 扩增片段缺失，以DEL表示。两条扩增片段以 A1、A2 表示。b: BMD家族STR-45 位点的多态性片段。II-7 显示STR-45 扩增片段缺失(DEL)，扩增片段均以 B1 表示(扩增片段的长度为参照分子量标准的估计值，下同)
图3 STR-49、STR-50 多态性分析结果
a: BMD家族STR-49 位点的多态性片段，分别以 C1、C2 表示。b: BMD家族STR-50 位点的多态性片段，分别以 D1、 D2、 D3 表示。
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在实验中，我们在一个一代发病的家系中用多重PCR方法扩增Dystrophin基因外显子，发现两个患者表现了同样的 17， 19， 45 号外显子缺失。使用STR序列引物扩增发现STR-44， STR-45 位点缺失，因此 3′ 端的缺失涵盖了从第 44 号内含子， 45 号外显子到 45 号内含子区域，估计其物理距离大约为 152～153 kb。 44 号内含子跨度较大，已知为缺失断端最密集的区域〔3，4〕。由于不可能使用复盖Dystrophin全长的PCR引物，所以未能详细描绘Dystrophin两端缺失范围。
本实验分析了一个少见的一代多个患者的家系。这类家系的发病机制较为复杂，它可能为隐蔽的家族性DMD，致病基因由女性携带，在以前的几代中未能表现。它也可能是发生在先证者母亲的胚胎发育早期的新生突变，由于突变发生在外胚层，中胚层及内胚层分化以前，它可能导致生殖细胞全部为突变细胞，而体细胞是嵌合型。第三种可能性是发生在其外祖父母的新生突变，其母亲为DMD基因携带者。本实验STR-单体型分析表明I-2 应为缺失杂合子，那么突变发生在先证者的外祖父母，母亲是致病基因携带者的可能性大。在这种一代家系中，致病基因可多次遗传最终导致家族性DMD〔4，5〕。
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本实验使用 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在每个STR位点分别测出 1～3 个等位片段，然而片段大小与文献报告不尽一致〔2，4〕，如STR-50 位点最小片段约为 212 bp，而文献报告最小片段为 233，这可能是中国汉族与其它人种之间种族差异的结果。有关我国各民族STR位点等位片段测定结果尚未见报告。
本文所研究的STR位点具有高度的多态性(杂合性频率为 72% ～ 93%，等位片段数目为 6 ～ 19)，这些位点高度的多态性减少了在一个正常女性 4 个位点均为纯合体的可能性，从而可以为遗传咨询提供更多信息，提高了DNA连锁分析的效率和精确性。结合 4 个基因内重复位点及末端(CA)n标记，可以识别基因内重组并能在几乎所有DMD/BMD家系提供所需的诊断信息〔2，4〕。
笔者在国内首次报告了在一代发病的BMD家系中STR多态性分析结果。以PCR扩增为基础的STR序列多态性分析在携带者检测、产前诊断及遗传咨询方面有良好的应用前景。
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参考文献
1 Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE et al. Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. In: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ et al eds. PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press： New York London, 1990. 272-281
2 Clemens PR, Fenwick RG, Chamberlain JS et al. Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophy families, using dinucleotide repeat polymorphisms. Am J Hum Genet, 1991, 49:951
, 百拇医药
3 Tihy F, Vogt N, Recan D et al. Skewed inactivation of an X chromosome deleted at the dystrophin gene in an asymptomatic mother and her affected daughter. Hum Genet, 1994, 93:563
4 Chakraborty R, Zhong Y, de Andrade M et al. Linkage disequilibria among (CA) n polymorphisms in the human dystrophin gene and their implications in carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics, 1994, 21:567
5 Bunyan DJ, Robinson DO, Collins AL et al. Germline and somatic mosaicism in a female carrier of Duchenne muscular dystrophy. Hum Genet, 1994,93:541
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