酵母菌SH2发酵产物增强干扰素抗病毒活性及其有效成分的初步研究
作者：程 志 孙国萍 王淑君 王春生
单位：中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071
关键词：酵母菌SH2；胞外糖蛋白；抗病毒活性；干扰素增效剂
中国病毒学 VIROLOGICA SINICA 1999年 第14卷 第3期 Vol
中国病毒学
VIROLOGICA SINICA
1999年 第14卷 第3期 Vol.14 No.3 1999
, 百拇医药
摘 要 酵母菌SH2发酵产物(简称FSH2)，用Sephadex G-75凝胶层析和HPLC色谱层析分离纯化，收集到一组蛋白。该组蛋白在PAGE和SDS-PAGE电泳上带型一致，无蛋白亚基，分子量范围为52～72 kD。凝胶上糖蛋白的特异性染色——Schiff's染色显示阳性染色带；用Lowry's法测蛋白和硫酸-酚法测糖，显示蛋白与糖的比例约为3∶1。该组蛋白与人α干扰素作用，增强干扰素生物学效价分别为1.6～2.8倍和1.4～4.0倍；经Sephadex G-75凝胶层析的FSH2蛋白洗脱峰增效2.01～5.68倍；发酵液增效1.64～6.86倍。并证实酵母菌SH2增效干扰素的活性成分为52～72 kD分子量范围的胞外糖蛋白(简称YEGPs)。
Preliminary Study on Fermentation Broth of Yeast Strain SH2 Enhancing
, 百拇医药
Biological Activity of Interferon Alpha and Its Active Principle
Cheng Zhi Sun Guopin Wang Shujun Wang Chunsheng
(Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071)
Abstract The fermentation broth of yeast strain SH-2 (FSH-2) which could enhance the biological potency of human interferon alpha (huIFN-α) was detected. Its enhancing ratio was 1.64～6.86 fold. A group of proteins was seperated and purified from the fermentation supernatant by chromatography on Sephadex G-75 and HPLC. Each protein showed the similar band on PAGE and SDS-PAGE. Their molecular weights ranged from 52 to 72 kD. The proteins were stainded with periodic acid Schiff's agent. Lowry's method and sulfuric acid-phenol method were respectively used to determine the contents of proteins and neutral sugars. The results showed the ratio of protein to sugar was 3∶1. These results indicated that the proteins were extracellular glycoproteins (YEGPs) secreted by yeast strain SH-2. YEGPs could significantly enhance the biological potency of huIFN-α. It was veritied by the experiment of cytopathic effect inhibition in Wish cells. The enhancing ratios were 1.6～2.8 fold and 1.4～4.0 fold, respectively. The enhancing ratio of the elution protein of FSH-2 seperated by Sephadex G-75 was 2.01～5.68 fold. YEGPs alone could not enhance the potency of huIFN-α and had no biological activity as IFNs.
, 百拇医药
Key words Yeast strain SH-2, Yeast extracellular glycoproteins (YEGPs), Antiviral activity, Enhancer of Interferon
由Isaacs和Lindenmann于1957年首次发现的干扰素[1]，是机体体细胞产生的重要细胞因子之一。其所具有的广谱抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等多种生物活性已被大量的研究和有效的临床应用所证实。但干扰素同其他药物一样也会产生毒副作用，且毒副作用的发生及程度与用药剂量相关[2]。为提高单位浓度干扰素的抗病毒活性，本实验室分离到一株酵母菌SH2，能产生增强干扰素活性的物质，称为干扰素增效剂(enhancer of ineterferon)。本实验对酵母菌SH2发酵产物单独和联合干扰素的抗病毒作用及其有效成分进行了研究。现报道如下：
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料
酵母菌SH2由本实验室分离保存。SH2种子培养基为酵母培养基YMP。人羊膜传代细胞(Wish cell)、水泡性口炎病毒(VSV)和白细胞干扰素标准品(huIFN-α,1.2×104 IU/mL)，均由中国药品生物制品检定所提供。D-MEM培养基为美国GIBCOBRL公司产品。
1.2 方法
1.2.1 酵母菌SH2发酵产物(FSH2)的制备
用新鲜的种子培养基活化SH2菌株12 h，转接发酵培养基，恒温摇床培养40 h，收集发酵液，离心去菌体。
1.2.2 FSH2对干扰素效价的影响
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1.2.2.1 FSH2联合干扰素对细胞病变的抑制作用 参照中国生物制品规程指定的干扰素效价测定方法——微量细胞病变抑制法[3]。
1.2.2.2 单独FSH2对细胞病变的抑制 如上面2.2.1所述方法，加Wish细胞6 h后，不加干扰素，只加不同浓度的FSH2培养24 h后，倾去培养液，加VSV攻击，并设病毒对照和细胞对照，培养24 h，观察FSH2抑制细胞病变的作用。按干扰素效价计算方法计算FSH2的抗病毒活性。
1.2.3 蛋白质分离、纯化
1.2.3.1 Sephadex G-75柱层析分离蛋白质 收集FSH2 50 mL，装入透析袋，埋入PEG6000内浓缩至5 mL，然后上Sephadex G-75层析柱(1.6×60 cm)，用0.05 mol/L pH7.2的PBS缓冲液，以0.75 mL/min流速洗脱，蛋白核酸仪280 mn检测，收集蛋白洗脱峰。按2.2.1方法，测定各峰样对干扰素效价的增效作用。
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1.2.3.2 高效液相色谱(HPLC)纯化 参照彭民的方法[4]，将Sephadex G-75分离的活性峰，通过HPLC纯化(固定相：RPP-PREPC-18 Reversed phase C-18 300A制备型柱，流动相：PB 0.05 mol/L, pH7.2)每次进样500 mL，洗脱流速3 mL/min，紫外检测器280 nm检测蛋白洗脱峰，分段收集样品，测定各峰样对干扰素效价的增效作用。
1.2.4 增效蛋白的分子量测定及蛋白质亚基
参照文献[5，6]方法改进，使用5%浓缩胶和10%分离胶，1份样品加2份样品缓冲液，电泳前沸水浴5 min，室温下100V电压进行SDS-PAGE电泳5 h，相同胶浓度和电泳条件下，将样品进行PAGE电泳，电泳胶用考马斯亮兰R250染色，判断蛋白质亚基和蛋白分子量。
1.2.5 增效蛋白在PAGE电泳凝胶上的糖蛋白染色及糖、蛋白含量测定
, 百拇医药
如上述方法配凝胶电泳，取出凝胶，按文献[7]用Schiff's试剂染色。另将增效蛋白用硫酸酚法[8]测定中性糖含量，Lowry's法测蛋白含量。
2 结果
2.1 FSH2对干扰素效价的影响
将不同浓度的FSH2与同一浓度干扰素一起处理Wish细胞，再以VSV攻击，各组干扰素效价结果如表1。从表中看出，FSH2原液及稀释2～32倍时，对干扰素的效价都有增强作用；继续稀释后则无增效活性。
表1 酵母菌SH2发酵液对干扰素活性的增强作用
Table 1 The enhancing effect of FSH2 on IFN's activity
, 百拇医药
样 品
Sample
干扰素活性
IFN's activity
(IU/mL)
增强倍数
Enhancing fold
(IFNα+FSH2)/IFNα
IFNα
2965
—
IFNα+FSH2
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20340
6.86
IFNα+1/2FSH2
13912
4.69
IFNα+1/4FSH2
9810
3.31
IFNα+1/8FSH2
8434
2.85
IFNα+1/16FSH2
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4871
1.64
IFNα+1/32FSH2
4871
1.64
IFNα+1/64FSH2
2965
—
2.2 FSH2单独对细胞病变的抑制作用
实验结果显示单独的FSH2及其系列稀释液，对Wish细胞无保护作用，细胞受VSV攻击后均被破坏，没有干扰素样的生物活性。
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2.3 FSH2的Sephadex G-75蛋白洗脱图谱及其对干扰素活性的作用
FSH2和培养基经Sephadex G-75层析后洗脱结果如图1。FSH2有两个洗脱峰，培养基只有一个峰，且该峰的出峰时间及峰形与FSH2第二个峰一致，故可判断FSH2的峰1为SH2产生的胞外蛋白(YEGPs)，峰2为培养基的成分；干扰素增效试验发现，峰1对干扰素有增效作用，峰2及培养基的峰均无此作用，结果见表2。
图1 FSH2和培养基的Sephadex G-75蛋白洗脱曲线
, 百拇医药
Fig.1 Elution pattern of SH-2 fermentation and medium on Sephadex G-75
表2 FSH2的Sephadex G-75蛋白
洗脱峰对干扰素的增效作用
Table 2 The enhancing effect of FSH-2 purified
by Sephadex G-75 on IFN's activity
样 品
Samples
干扰素活性
IFN's activity
, 百拇医药
(IU/mL)
增强倍数
Enhancing fold
(IFNα+Peak1)/1FNα
IFNα
2040
—
IFNα+Peak1
11585
5.68
IFNα+1/2Peak1
7612
, 百拇医药
3.73
IFNα+1/4Peak1
6549
3.21
IFNα+1/8Peak1
4096
2.01
IFNα+1/16Peak1
2040
—
IFNα+SH2Peak2
2040
, 百拇医药
—
2.4 Sephadex G-75峰1在高效液相色谱(HPLC)上的层析图
将FSH2经Sephadex G-75分离的峰1通过HPLC层析分离，有多个蛋白洗脱峰，见图2。图3是在原始洗脱图的基础上，以最大峰面积为100%所作的处理图，由此图可见有8个洗脱时间间隔较大的峰群，即以此8个峰群所对应的出峰时间，收集8个样品，只有3、7号峰样对干扰素有增效活性，结果见表3，无增效活性的峰样结果未列出。
图2 FSH2在高效液相色谱上的层析图
Fig.2 Elution pattern of FSH-2 on HPLC
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图3 FSH2在高效液相色谱上的层析处理图
Fig.3 Treated pattern of FSH-2 on HPLC
表3 FSH2经HPLC纯化后各峰样对干扰素活性的影响
Table 3 The enhancing effect of FSH-2 purified by HPLC on IFN's activity
样 品
Samples
干扰素活性
IFN's activity
(IU/mL)
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增强倍数
Enhancing fold
(IFNα+Peak 1)/1FNα
IFNα
64
—
IFNα+0.05MPB
64
—
IFNα+HPLC Peak3
181
2.8
, 百拇医药
IFNα+1/2HPLC Peak3
137
2.1
IFNα+1/4HPLC Peak3
103
1.6
IFNα+1/8HPLC Peak3
64
—
IFNα+HPLC Peak7
256
4.0
, 百拇医药
IFNα+1/2HPLC Peak7
91
1.4
IFNα+1/4HPLC Peak7
64
—
IFNα+1/8HPLC Peak7
64
—
2.5 FSH2增效干扰素活性有效成分的分子量和蛋白亚基
将HPLC纯化的3、7号峰样进行SDS-PAGE和PAGE凝胶电泳，结果见图4、5。在两种电泳条件下的电泳带一致，说明有增效干扰素活性的蛋白质无亚基；3号峰为单一蛋白带，7号峰显示3条染色带，说明7号峰为一混合蛋白。由SDS-PAGE凝胶电泳上蛋白标准的分子量与迁移率间的对数曲线计算，3号峰分子量为72 kD，7号峰分子量分别为52、61、66 kD。另外发酵培养基无蛋白带，进一步证明增效成分由SH2产生。
, 百拇医药
图4 YEGPs的SDS-PAGE电泳图谱
Fig.4 SDS-PAGE pattern of YEGPs
1.FSH2 2.Mediume 3. Sephadex G-75 peak-1 of FSH2
4. HPLC peak-3 of FSH2
5. HPLC peak-7 of FSH2
6. Standard proteins (Phospharylase B 97 400,Albumin 66 200, Ovalbumin,42 700,FSH-2 Carbonic
anhydrase 31 000, Lysozyme 14 400)
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图5 YEGPs的PAGE电泳图谱
Fig.5 PAGE pattern of YEGPs
1.Standard proteins (as left)
2.Medium 3. FSH-2
4.Sephadex G-75 peak-1 of FSH2
5. HPLC peak-3 of FSH2
6. HPLC peak-7 of FSH-2
2.6 增效蛋白的糖成分及蛋白与糖的比例
相同条件下进行的PAGE凝胶电泳，用Schiff's试剂染色，在蛋白质染色带的相应位置有糖的染色带(见图6)，说明增效蛋白为糖蛋白，用硫酸酚法测中性糖含量，Lowry's法测蛋白，结果见表4，表明增效蛋白与糖含量比例接近3∶1。
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图6 Schiff's染色的聚丙烯烷胺凝胶电泳图谱
Fig.6 Polyacrylamide gel eletrophoretic pattern of YEGPs stained with Schiff's agent
1.HPLC peak-3 of FSH-2
2.HPLC peak-7 of FSH-2
3.Standard glycoprotein (Ovalbumin)
表4 增效干扰素活性的YEGPs的蛋白和糖含量
Table 4 Concentration of proteins and neutral sugars of YEGP
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样 品
Samples
蛋白含量
Protein (μg/mL)
糖含量
Sugar (μg/mL)
蛋白/糖
Protein/Sugar
HPLC-Peak 3
147.9
52.5
2.8
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HPLC-Peak 7
130.5
45
2.9
3 讨论
对细胞因子的研究是目前分子生物学、免疫学的研究热点。干扰素是发现最早也是研究得最为深入的细胞因子。因为干扰素对许多疾病的确切疗效，也因为机体内源性干扰素生成量极低，外源性干扰素价格昂贵及其副作用，所以长期以来，各国学者、生产商在围绕提高干扰素产量和纯度上进行了大量研究。基因工程技术在干扰素产业上的应用，已使干扰素的工业化成为现实，但它在体内的抗体形成率及药物耐受性的发生率都较高[9]。有人试图将其他药物与干扰素联合使用，以提高干扰素的疗效。S.L..Gupta等[10]报道RNA合成抑制物放线菌素D对IFN的抗病毒活性有双重作用，与IFN一起加入处理细胞时，可阻碍IFN抗病毒活性的发挥；在IFN处理几小时后再加入，则可增强IFN的作用。由于放线菌素D强烈的免疫抑制作用，此工作未能展开研究。Fleishmann[11]首先发现不同干扰素之间存在协同作用，陈昭烈等[12]也用微量细胞病变抑制法研究三种天然人干扰素的联合抗病毒作用。由于细胞因子的网络特性，将TNF+IFNα或IFNγ[13]，IL-2+IFNα[14]等的联合应用已有报道，但这些细胞因子同样存在着来源限制或耐受性问题。
, 百拇医药
诱导机体产生干扰素，无疑是利用干扰素治疗疾病的有效方法。干扰素诱生剂的研究报道极多，如中药多糖类[15]、微生物菌体成分[16]、植物提取或人工合成的dsRNA等[17]。
从增强单位浓度干扰素生物活性展开研究，此类报道仅见Fish EN[18]利用人工合成的干扰素受体识别肽增强IFNα的抗病毒活性，以及R.K.Maheshwari[19]报道的通过加入不同浓度的氨离子，改变培养细胞内的pH值，可以增强干扰素抗囊膜病毒的活性。而从微生物提取干扰素增效物质尚未见报道。
酵母菌SH2发酵物具有增强干扰素抗病毒活性作用，其增效成分为一组糖蛋白，无蛋白亚基，分子量范围为52 kD～72 kD。在确定增效成分为蛋白质之前，我们尝试用RNase和DNase消化处理发酵液，并不能消除它对干扰素的增效作用，从而排除有效成分为RNA或DNA的可能。另外进行了49株细菌及60株酵母菌发酵产物的增效试验，未发现增效菌株。
, 百拇医药
本试验主要确定增效干扰素活性物质的性质，发酵液由Sephadex G-75及HPLC纯化过程中，没有计算每步的蛋白质得率及其比活性。所以各步之间增效活性尚不能进行可比性分析。HPLC纯化后的样品在进一步稀释(如1∶4稀释)后，并未显示增效活性，这可能与纯化过程中活性损失、蛋白质得率降低有关。单独的干扰素增效剂不具有抗病毒作用，只有在与干扰素联合应用时，才使干扰素的抗病毒活性提高。说明增效剂对干扰素抗病毒作用的发挥起着调节作用。它究竟是提高细胞表面干扰素受体的表达；或作为干扰素受体的识别肽类物质，使干扰素与受体更易结合或结合更紧密；或作用于干扰素在细胞内信号传递的某一环节，使干扰素诱生的抗病毒蛋白量提高、活性增强。目前只能作出这些推测，其确切机理尚需进一步探讨。
微生物来源方便，从微生物里筛选新的药物，仍是整个医药工业领域开发研究的热点。糖蛋白具有增加溶解度、延长生物学半衰期、增强生物学活性、增强稳定性、降低抗原性等特点，比普通蛋白更具优越性[20]。新型糖蛋白类药物的研制与开发被认为是现代医药生物技术前途无量的领域。干扰素增效剂为酵母菌产生的糖蛋白展现了良好的应用前景。
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由于本研究所用菌株及其产生的活性物质均是首次发现和报道，许多工作有待深入研究。如它所具有的免疫调节功能(另文报道)、抗肿瘤及其与干扰素联合应用于体内的效果观察；将纯化后的蛋白进行序列分析，再进行DNA合成，构建工程菌，提高SH2产胞外糖蛋白的准确性和专一性，等等。如从分子水平研究该物质的作用机理，极有可能获得有意义的理论突破，并为干扰素的临床应用开辟新的途径。 参考文献
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单位：中国科学院武汉病毒研究所，武汉 430071
关键词：酵母菌SH2；胞外糖蛋白；抗病毒活性；干扰素增效剂
中国病毒学 VIROLOGICA SINICA 1999年 第14卷 第3期 Vol
中国病毒学
VIROLOGICA SINICA
1999年 第14卷 第3期 Vol.14 No.3 1999
, 百拇医药
摘 要 酵母菌SH2发酵产物(简称FSH2)，用Sephadex G-75凝胶层析和HPLC色谱层析分离纯化，收集到一组蛋白。该组蛋白在PAGE和SDS-PAGE电泳上带型一致，无蛋白亚基，分子量范围为52～72 kD。凝胶上糖蛋白的特异性染色——Schiff's染色显示阳性染色带；用Lowry's法测蛋白和硫酸-酚法测糖，显示蛋白与糖的比例约为3∶1。该组蛋白与人α干扰素作用，增强干扰素生物学效价分别为1.6～2.8倍和1.4～4.0倍；经Sephadex G-75凝胶层析的FSH2蛋白洗脱峰增效2.01～5.68倍；发酵液增效1.64～6.86倍。并证实酵母菌SH2增效干扰素的活性成分为52～72 kD分子量范围的胞外糖蛋白(简称YEGPs)。
Preliminary Study on Fermentation Broth of Yeast Strain SH2 Enhancing
, 百拇医药
Biological Activity of Interferon Alpha and Its Active Principle
Cheng Zhi Sun Guopin Wang Shujun Wang Chunsheng
(Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071)
Abstract The fermentation broth of yeast strain SH-2 (FSH-2) which could enhance the biological potency of human interferon alpha (huIFN-α) was detected. Its enhancing ratio was 1.64～6.86 fold. A group of proteins was seperated and purified from the fermentation supernatant by chromatography on Sephadex G-75 and HPLC. Each protein showed the similar band on PAGE and SDS-PAGE. Their molecular weights ranged from 52 to 72 kD. The proteins were stainded with periodic acid Schiff's agent. Lowry's method and sulfuric acid-phenol method were respectively used to determine the contents of proteins and neutral sugars. The results showed the ratio of protein to sugar was 3∶1. These results indicated that the proteins were extracellular glycoproteins (YEGPs) secreted by yeast strain SH-2. YEGPs could significantly enhance the biological potency of huIFN-α. It was veritied by the experiment of cytopathic effect inhibition in Wish cells. The enhancing ratios were 1.6～2.8 fold and 1.4～4.0 fold, respectively. The enhancing ratio of the elution protein of FSH-2 seperated by Sephadex G-75 was 2.01～5.68 fold. YEGPs alone could not enhance the potency of huIFN-α and had no biological activity as IFNs.
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Key words Yeast strain SH-2, Yeast extracellular glycoproteins (YEGPs), Antiviral activity, Enhancer of Interferon
由Isaacs和Lindenmann于1957年首次发现的干扰素[1]，是机体体细胞产生的重要细胞因子之一。其所具有的广谱抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等多种生物活性已被大量的研究和有效的临床应用所证实。但干扰素同其他药物一样也会产生毒副作用，且毒副作用的发生及程度与用药剂量相关[2]。为提高单位浓度干扰素的抗病毒活性，本实验室分离到一株酵母菌SH2，能产生增强干扰素活性的物质，称为干扰素增效剂(enhancer of ineterferon)。本实验对酵母菌SH2发酵产物单独和联合干扰素的抗病毒作用及其有效成分进行了研究。现报道如下：
1 材料和方法
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1.1 材料
酵母菌SH2由本实验室分离保存。SH2种子培养基为酵母培养基YMP。人羊膜传代细胞(Wish cell)、水泡性口炎病毒(VSV)和白细胞干扰素标准品(huIFN-α,1.2×104 IU/mL)，均由中国药品生物制品检定所提供。D-MEM培养基为美国GIBCOBRL公司产品。
1.2 方法
1.2.1 酵母菌SH2发酵产物(FSH2)的制备
用新鲜的种子培养基活化SH2菌株12 h，转接发酵培养基，恒温摇床培养40 h，收集发酵液，离心去菌体。
1.2.2 FSH2对干扰素效价的影响
, http://www.100md.com
1.2.2.1 FSH2联合干扰素对细胞病变的抑制作用 参照中国生物制品规程指定的干扰素效价测定方法——微量细胞病变抑制法[3]。
1.2.2.2 单独FSH2对细胞病变的抑制 如上面2.2.1所述方法，加Wish细胞6 h后，不加干扰素，只加不同浓度的FSH2培养24 h后，倾去培养液，加VSV攻击，并设病毒对照和细胞对照，培养24 h，观察FSH2抑制细胞病变的作用。按干扰素效价计算方法计算FSH2的抗病毒活性。
1.2.3 蛋白质分离、纯化
1.2.3.1 Sephadex G-75柱层析分离蛋白质 收集FSH2 50 mL，装入透析袋，埋入PEG6000内浓缩至5 mL，然后上Sephadex G-75层析柱(1.6×60 cm)，用0.05 mol/L pH7.2的PBS缓冲液，以0.75 mL/min流速洗脱，蛋白核酸仪280 mn检测，收集蛋白洗脱峰。按2.2.1方法，测定各峰样对干扰素效价的增效作用。
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1.2.3.2 高效液相色谱(HPLC)纯化 参照彭民的方法[4]，将Sephadex G-75分离的活性峰，通过HPLC纯化(固定相：RPP-PREPC-18 Reversed phase C-18 300A制备型柱，流动相：PB 0.05 mol/L, pH7.2)每次进样500 mL，洗脱流速3 mL/min，紫外检测器280 nm检测蛋白洗脱峰，分段收集样品，测定各峰样对干扰素效价的增效作用。
1.2.4 增效蛋白的分子量测定及蛋白质亚基
参照文献[5，6]方法改进，使用5%浓缩胶和10%分离胶，1份样品加2份样品缓冲液，电泳前沸水浴5 min，室温下100V电压进行SDS-PAGE电泳5 h，相同胶浓度和电泳条件下，将样品进行PAGE电泳，电泳胶用考马斯亮兰R250染色，判断蛋白质亚基和蛋白分子量。
1.2.5 增效蛋白在PAGE电泳凝胶上的糖蛋白染色及糖、蛋白含量测定
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如上述方法配凝胶电泳，取出凝胶，按文献[7]用Schiff's试剂染色。另将增效蛋白用硫酸酚法[8]测定中性糖含量，Lowry's法测蛋白含量。
2 结果
2.1 FSH2对干扰素效价的影响
将不同浓度的FSH2与同一浓度干扰素一起处理Wish细胞，再以VSV攻击，各组干扰素效价结果如表1。从表中看出，FSH2原液及稀释2～32倍时，对干扰素的效价都有增强作用；继续稀释后则无增效活性。
表1 酵母菌SH2发酵液对干扰素活性的增强作用
Table 1 The enhancing effect of FSH2 on IFN's activity
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样 品
Sample
干扰素活性
IFN's activity
(IU/mL)
增强倍数
Enhancing fold
(IFNα+FSH2)/IFNα
IFNα
2965
—
IFNα+FSH2
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20340
6.86
IFNα+1/2FSH2
13912
4.69
IFNα+1/4FSH2
9810
3.31
IFNα+1/8FSH2
8434
2.85
IFNα+1/16FSH2
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4871
1.64
IFNα+1/32FSH2
4871
1.64
IFNα+1/64FSH2
2965
—
2.2 FSH2单独对细胞病变的抑制作用
实验结果显示单独的FSH2及其系列稀释液，对Wish细胞无保护作用，细胞受VSV攻击后均被破坏，没有干扰素样的生物活性。
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2.3 FSH2的Sephadex G-75蛋白洗脱图谱及其对干扰素活性的作用
FSH2和培养基经Sephadex G-75层析后洗脱结果如图1。FSH2有两个洗脱峰，培养基只有一个峰，且该峰的出峰时间及峰形与FSH2第二个峰一致，故可判断FSH2的峰1为SH2产生的胞外蛋白(YEGPs)，峰2为培养基的成分；干扰素增效试验发现，峰1对干扰素有增效作用，峰2及培养基的峰均无此作用，结果见表2。
图1 FSH2和培养基的Sephadex G-75蛋白洗脱曲线
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Fig.1 Elution pattern of SH-2 fermentation and medium on Sephadex G-75
表2 FSH2的Sephadex G-75蛋白
洗脱峰对干扰素的增效作用
Table 2 The enhancing effect of FSH-2 purified
by Sephadex G-75 on IFN's activity
样 品
Samples
干扰素活性
IFN's activity
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(IU/mL)
增强倍数
Enhancing fold
(IFNα+Peak1)/1FNα
IFNα
2040
—
IFNα+Peak1
11585
5.68
IFNα+1/2Peak1
7612
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3.73
IFNα+1/4Peak1
6549
3.21
IFNα+1/8Peak1
4096
2.01
IFNα+1/16Peak1
2040
—
IFNα+SH2Peak2
2040
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—
2.4 Sephadex G-75峰1在高效液相色谱(HPLC)上的层析图
将FSH2经Sephadex G-75分离的峰1通过HPLC层析分离，有多个蛋白洗脱峰，见图2。图3是在原始洗脱图的基础上，以最大峰面积为100%所作的处理图，由此图可见有8个洗脱时间间隔较大的峰群，即以此8个峰群所对应的出峰时间，收集8个样品，只有3、7号峰样对干扰素有增效活性，结果见表3，无增效活性的峰样结果未列出。
图2 FSH2在高效液相色谱上的层析图
Fig.2 Elution pattern of FSH-2 on HPLC
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图3 FSH2在高效液相色谱上的层析处理图
Fig.3 Treated pattern of FSH-2 on HPLC
表3 FSH2经HPLC纯化后各峰样对干扰素活性的影响
Table 3 The enhancing effect of FSH-2 purified by HPLC on IFN's activity
样 品
Samples
干扰素活性
IFN's activity
(IU/mL)
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增强倍数
Enhancing fold
(IFNα+Peak 1)/1FNα
IFNα
64
—
IFNα+0.05MPB
64
—
IFNα+HPLC Peak3
181
2.8
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IFNα+1/2HPLC Peak3
137
2.1
IFNα+1/4HPLC Peak3
103
1.6
IFNα+1/8HPLC Peak3
64
—
IFNα+HPLC Peak7
256
4.0
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IFNα+1/2HPLC Peak7
91
1.4
IFNα+1/4HPLC Peak7
64
—
IFNα+1/8HPLC Peak7
64
—
2.5 FSH2增效干扰素活性有效成分的分子量和蛋白亚基
将HPLC纯化的3、7号峰样进行SDS-PAGE和PAGE凝胶电泳，结果见图4、5。在两种电泳条件下的电泳带一致，说明有增效干扰素活性的蛋白质无亚基；3号峰为单一蛋白带，7号峰显示3条染色带，说明7号峰为一混合蛋白。由SDS-PAGE凝胶电泳上蛋白标准的分子量与迁移率间的对数曲线计算，3号峰分子量为72 kD，7号峰分子量分别为52、61、66 kD。另外发酵培养基无蛋白带，进一步证明增效成分由SH2产生。
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图4 YEGPs的SDS-PAGE电泳图谱
Fig.4 SDS-PAGE pattern of YEGPs
1.FSH2 2.Mediume 3. Sephadex G-75 peak-1 of FSH2
4. HPLC peak-3 of FSH2
5. HPLC peak-7 of FSH2
6. Standard proteins (Phospharylase B 97 400,Albumin 66 200, Ovalbumin,42 700,FSH-2 Carbonic
anhydrase 31 000, Lysozyme 14 400)
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图5 YEGPs的PAGE电泳图谱
Fig.5 PAGE pattern of YEGPs
1.Standard proteins (as left)
2.Medium 3. FSH-2
4.Sephadex G-75 peak-1 of FSH2
5. HPLC peak-3 of FSH2
6. HPLC peak-7 of FSH-2
2.6 增效蛋白的糖成分及蛋白与糖的比例
相同条件下进行的PAGE凝胶电泳，用Schiff's试剂染色，在蛋白质染色带的相应位置有糖的染色带(见图6)，说明增效蛋白为糖蛋白，用硫酸酚法测中性糖含量，Lowry's法测蛋白，结果见表4，表明增效蛋白与糖含量比例接近3∶1。
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图6 Schiff's染色的聚丙烯烷胺凝胶电泳图谱
Fig.6 Polyacrylamide gel eletrophoretic pattern of YEGPs stained with Schiff's agent
1.HPLC peak-3 of FSH-2
2.HPLC peak-7 of FSH-2
3.Standard glycoprotein (Ovalbumin)
表4 增效干扰素活性的YEGPs的蛋白和糖含量
Table 4 Concentration of proteins and neutral sugars of YEGP
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样 品
Samples
蛋白含量
Protein (μg/mL)
糖含量
Sugar (μg/mL)
蛋白/糖
Protein/Sugar
HPLC-Peak 3
147.9
52.5
2.8
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HPLC-Peak 7
130.5
45
2.9
3 讨论
对细胞因子的研究是目前分子生物学、免疫学的研究热点。干扰素是发现最早也是研究得最为深入的细胞因子。因为干扰素对许多疾病的确切疗效，也因为机体内源性干扰素生成量极低，外源性干扰素价格昂贵及其副作用，所以长期以来，各国学者、生产商在围绕提高干扰素产量和纯度上进行了大量研究。基因工程技术在干扰素产业上的应用，已使干扰素的工业化成为现实，但它在体内的抗体形成率及药物耐受性的发生率都较高[9]。有人试图将其他药物与干扰素联合使用，以提高干扰素的疗效。S.L..Gupta等[10]报道RNA合成抑制物放线菌素D对IFN的抗病毒活性有双重作用，与IFN一起加入处理细胞时，可阻碍IFN抗病毒活性的发挥；在IFN处理几小时后再加入，则可增强IFN的作用。由于放线菌素D强烈的免疫抑制作用，此工作未能展开研究。Fleishmann[11]首先发现不同干扰素之间存在协同作用，陈昭烈等[12]也用微量细胞病变抑制法研究三种天然人干扰素的联合抗病毒作用。由于细胞因子的网络特性，将TNF+IFNα或IFNγ[13]，IL-2+IFNα[14]等的联合应用已有报道，但这些细胞因子同样存在着来源限制或耐受性问题。
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诱导机体产生干扰素，无疑是利用干扰素治疗疾病的有效方法。干扰素诱生剂的研究报道极多，如中药多糖类[15]、微生物菌体成分[16]、植物提取或人工合成的dsRNA等[17]。
从增强单位浓度干扰素生物活性展开研究，此类报道仅见Fish EN[18]利用人工合成的干扰素受体识别肽增强IFNα的抗病毒活性，以及R.K.Maheshwari[19]报道的通过加入不同浓度的氨离子，改变培养细胞内的pH值，可以增强干扰素抗囊膜病毒的活性。而从微生物提取干扰素增效物质尚未见报道。
酵母菌SH2发酵物具有增强干扰素抗病毒活性作用，其增效成分为一组糖蛋白，无蛋白亚基，分子量范围为52 kD～72 kD。在确定增效成分为蛋白质之前，我们尝试用RNase和DNase消化处理发酵液，并不能消除它对干扰素的增效作用，从而排除有效成分为RNA或DNA的可能。另外进行了49株细菌及60株酵母菌发酵产物的增效试验，未发现增效菌株。
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本试验主要确定增效干扰素活性物质的性质，发酵液由Sephadex G-75及HPLC纯化过程中，没有计算每步的蛋白质得率及其比活性。所以各步之间增效活性尚不能进行可比性分析。HPLC纯化后的样品在进一步稀释(如1∶4稀释)后，并未显示增效活性，这可能与纯化过程中活性损失、蛋白质得率降低有关。单独的干扰素增效剂不具有抗病毒作用，只有在与干扰素联合应用时，才使干扰素的抗病毒活性提高。说明增效剂对干扰素抗病毒作用的发挥起着调节作用。它究竟是提高细胞表面干扰素受体的表达；或作为干扰素受体的识别肽类物质，使干扰素与受体更易结合或结合更紧密；或作用于干扰素在细胞内信号传递的某一环节，使干扰素诱生的抗病毒蛋白量提高、活性增强。目前只能作出这些推测，其确切机理尚需进一步探讨。
微生物来源方便，从微生物里筛选新的药物，仍是整个医药工业领域开发研究的热点。糖蛋白具有增加溶解度、延长生物学半衰期、增强生物学活性、增强稳定性、降低抗原性等特点，比普通蛋白更具优越性[20]。新型糖蛋白类药物的研制与开发被认为是现代医药生物技术前途无量的领域。干扰素增效剂为酵母菌产生的糖蛋白展现了良好的应用前景。
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由于本研究所用菌株及其产生的活性物质均是首次发现和报道，许多工作有待深入研究。如它所具有的免疫调节功能(另文报道)、抗肿瘤及其与干扰素联合应用于体内的效果观察；将纯化后的蛋白进行序列分析，再进行DNA合成，构建工程菌，提高SH2产胞外糖蛋白的准确性和专一性，等等。如从分子水平研究该物质的作用机理，极有可能获得有意义的理论突破，并为干扰素的临床应用开辟新的途径。 参考文献
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5 J 萨姆布鲁克，E F 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯著.金冬雁等译.分子克隆实验指南.北京：科学出版社，1996.888～894
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9 杜平.现代临床病毒学.北京：人民军医出版社，1991.1.216
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10 Sohan L Gupta, Berish Y Rubin, Sandra L Holmes. Regulation of interferon action in human fibroblasts: transient induction of specific proteins and amplification of the antiviral response by actinomycin D. Virology, 1981,111:331～340
11 Fleischmann W R, Georgiades J A, Osborne L C. Potentiation of interferon activity by mixed preperations of fibroblast and immune interferon. Inf Imm, 1979,26:248
12 陈昭烈.用微量细胞病变抑制法研究三种天然人干扰素的协同抗病毒作用. 第九次全国干扰素及细胞因子论文集，1993.260～261
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20 张旭，黄秉仁.蛋白质糖基化工程.生物工程进展.1995,15(2)：30～35,28, http://www.100md.com