小麦黄花叶病毒RNA2 28kDa蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备
作者：苏 宁 韩成贵 李大伟 侯占军 邢怡明 于嘉林 刘 仪
单位：中国农业大学生物技术国家重点实验室，北京100094
关键词：小麦黄花叶病毒；蛋白基因；原核表达；抗血清
中国病毒学/990305 摘 要 根据小麦黄花叶病毒(WYMV)核苷酸序列测定结果，将WYMV RNA 2上的28kDa蛋白基因克隆到pET11a上，构建了原核表达载体pE2839。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，28kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原，免疫家兔，首次制备了小麦黄花叶病毒RNA2 蛋白特异性抗血清。
Overexpression of 28kDa Protein Encoded by
Wheat Yellow Mosaic Virus RNA2 in E. coli
, 百拇医药
Su Ning Han Chenggui Li Dawei Hou Zhanjun
Xing Yiming Yu Jialin Liu Yi
(State Key Laboratory for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094)
Abstract With polymerase chain reaction (PCR) a fragment encoding the 28 kDa protein of wheat yellow mosaic virus (WYMV) RNA2 was amplified and constructed into plasmid of pET11a for prokaryotic expression. BL21 (DE3) of E.coli transformed with the recombinant plasmid of pE2839 was induced to specifically express the 28 kDa protein in high level. The expressed 28 kDa protein was purified from SDS-polyacrylamide gels and the antiserum against the protein was raised in rabbit. In Western-blotting analysis, the antiserum reacted with the 28kDa protein.
, 百拇医药
Key words Wheat yellow mosaic virus, Protein gene, Prokaryotic expression, Antiserum
小麦黄花叶病是亚洲小麦产区广为流行的一种真菌传病毒病害，七十年代末在我国首次报道[1]。该病害是由小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus, WYMV)侵染所引起的，表现为小麦植株矮化，成穗率低，严重影响小麦产量。由于其传播介体禾谷类多粘菌(Polymyxa graminis)为植物根部专性寄生真菌，其休眠孢子抗逆力强，可被释放到土壤中存活多年，所以目前除选择抗病品种外，无其它有效的防治措施。
WYMV为大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)成员，基因组由长、短两条单链正意RNA构成[2，3]。根据WYMV相近的其他大麦黄花叶病毒属病毒的研究结果，此类病毒RNA2编码两种分子量分别为28kDa和70kDa的蛋白，可能与介体的传播有关[2]。本研究在对小麦黄花叶病毒cDNA合成及序列测定的基础上(未发表)，将RNA2编码的28kDa蛋白基因片段克隆到原核表达载体中，获得了高效表达并制备了其相应的特异性抗血清，为今后对28kDa蛋白的检测和功能研究奠定了基础。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)pLysS和原核表达载体pET11a由本室保存。含有WYMV 28kDa蛋白基因片段的cDNA重组质粒pGWH44为本室克隆。
1.2 酶及试剂
Western blotting试剂盒购自Promega公司。蛋白分子量标准购自Pharmacia公司。硝酸纤维素膜购自Schleicher & Schuell公司。IPTG等其他化学试剂及各种限制性内切酶或工具酶购自华美生物工程公司。引物由中国科学院微生物所技术室合成。
1.3 PCR引物合成、基因扩增与表达载体的构建
根据本室对WYMV RNA2 cDNA的序列测定结果(GenBank登录号：AF041041)，结合对大麦黄花叶病毒属其他病毒RNA2序列的结构分析，分别设计了针对28kDa蛋白编码区上、下游两端序列的引物P1和P2。引物具体序列如下：
, http://www.100md.com
引物P1：5′-TTTCCAGTACTATGGCATCCACCAG-3′与WYMV RNA2的148～173核苷酸(nt)相对应，并引入一个ScaⅠ位点。
引物P2：5′-GGCCTGGATCCTCAGCTCAGCCGAC-3′与WYMV RNA2的940～915nt互补，并引入一个BamHI位点和一个翻译终止密码子。
利用引物P1与P2，以含有WYMV RNA2 28kDa蛋白基因的cDNA重组质粒pGWH44为模板进行PCR扩增，电泳回收扩增产物后，以ScaⅠ和BamHI双酶切处理。载体质粒pET11a用NdeⅠ酶切，经DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段补平后再用BamHI酶切。经处理的PCR产物及载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α后筛选重组子，PCR鉴定含有28kDa蛋白基因的非融合蛋白原核表达载体。
1.4 28kDa蛋白基因的诱导表达及SDS-PAGE电泳分析
, 百拇医药
将筛选获得的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，于37℃活化过夜后，按1∶100稀释加入到6mL LB液体培养基中(含氨苄青霉素100μg/mL)，振荡培养至OD600值为0.7～0.9，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，继续于37℃摇床培养3～4h。离心集菌后加入500μL样品缓冲液(40mmol/L Tris-HCl, pH6.8,10%甘油， 2%SDS，5%巯基乙醇，0.1%溴酚兰)，煮沸10min，置4℃备用。
将诱导产物经12.5%的SDS-PAGE电泳分析，用考马斯亮蓝R-250染色，脱色(脱色液∶10%甲醇，10%冰乙酸)至背景清晰为止。
1.3及1.4两项内容所涉及的常规分子生物学技术均参照Sambrook的方法[4]。
, 百拇医药 1.5 抗血清制备及Western-blotting检测
参照Hager等[5]的方法染色，从凝胶中切下特异性表达蛋白条带，按1∶1比例(W/V)加入PBS缓冲液(0.14mol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl,1.5mmol/L KH2PO4, 8.1mmol/L Na2HPO4)，于冰浴中研磨。用PBS缓冲液适当稀释回收的蛋白混合物后，加入等体积的福氏不完全佐剂(1.5g羊毛脂+8mL石蜡油)进行乳化。参照Hames的方法[6]制备WYMV 28kDa蛋白抗血清，每次免疫剂量为2.5mL乳化抗原溶液(抗原约为3mg)。采血后收集的抗血清加入0.1%迭氮钠，分装后-20℃贮存。
参照Towbin等人的方法[7]进行Western-boltting检测。
2 结果
, 百拇医药
2.1 原核表达载体的构建
根据本室对WYMV RNA2的序列分析结果(GenBank登录号：AF041041)，28kDa蛋白编码区起始于160nt，位于一个约98kDa的多肽前体编码区的5′末端。与相近的大麦黄花叶病毒(BaYMV)和大麦和性花叶病毒(BMMV)的研究结果比较，WYMV 28kDa蛋白可能是在921nt上、下游编码的氨基酸G/S位点，通过翻译后切割所生成的。因此，本文在引物P2中将922～924nt处的核苷酸TCA变为TGA，从而引入一个终止子。并在起始密码子ATG上游和引入的终止子TGA下游分别引入相应的酶切位点，以便于重组DNA操作。
经PCR扩增后，获得一个长度约为800个核苷酸的DNA片段，与设计期望长度相符。按1.3所述，该片段及表达载体pET11a经酶切、抽提处理后，进行连接并转化大肠杆菌DH5α。挑取单菌落进行培养并提取重组质粒，经PCR鉴定，得到重组质粒pE2839(见图1)。
, 百拇医药
图1 表达载体pE2839的PCR鉴定
Fig.1 Identification of pE2839 by PCR
A:Products from pGWH44;
B:Products from pE2839;
C:λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ markers.
2.2 表达产物的SDS-PAGE分析
将重组质粒pE2839转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，进行诱导表达。取20μL上样，SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色结果表明：经IPTG诱导后，含有重组质粒pE2839的菌株可特异地产生一条与WYMV RNA2 28kDa分子量相当的蛋白条带(见图2)。光密度扫描估测结果显示，28kDa蛋白的相对表达量占菌体总蛋白的10%以上(结果未表示)。
, 百拇医药
图2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression products
1.BL21(DE3)/pET11a;
2.BL21(DE3)/pE2839.
A.Non-induced; B.Induced;
M.Protein markers (94,67,43,30,20,14kDa).
2.3 抗血清制备和Western-blotting检测
经SDS-PAGE电泳后，染色回收特异性表达的28kDa蛋白条带。免疫家兔，获得了WYMV RNA2 28kDa抗血清。
, 百拇医药
利用获得的28kDa蛋白抗血清进行Western-blotting分析。结果表明，所获得的抗血清仅与含有重组质粒pE2839的大肠杆菌诱导表达产物反应，产生一条清晰的着色带，而与其他对照不发生反应(图3)。由此可见，所产生的抗血清可以与原核表达的WYMV RNA2 28kDa蛋白特异结合，为特异性抗血清。
图3 利用28kDa蛋白抗血清进行Western-blotting分析
Fig.3 Western-blotting analysis using antiserum against 28kDa protein
1.BL21(DE3); 2.BL21(DE3)/pET11a; 3.BL21(DE3)/pE2839.
, http://www.100md.com A.Non-induced; B.Induced.
3 讨论
利用表达载体pET11a构建的WYMV RNA2 28kDa蛋白原核表达载体pE2839为非融合蛋白，由于表达产物中不含有任何植物蛋白，经SDS-PAGE进一步纯化后可以作为良好的抗原来制备相应的特异性抗血清。
小麦黄色花叶病毒为大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的成员之一，与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)同属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)[8]，WYMV除含有二分体基因组并被真菌传播以外，其他方面与马铃薯Y病毒属存在许多相似之处。除日本关于WYMV基因组序列的报道外(GenBank登录号：D86634，释放时间：1998年6月11日)[9]，本室独立完成了小麦黄花叶病毒RNA1和RNA2的序列测定。经过分析表明：WYMV RNA2编码产生多聚蛋白，其可能的切割点及由此产生的成熟蛋白与Potyvirus属病毒的HC-Pro下游区域具有很高的结构相似性和序列保守性[10]，WYMV RNA2编码的多聚蛋白也是在G/S处被切割成两种蛋白(28kDa和70kDa)[11]。关于28kDa蛋白的功能仍不清楚，根据28kDa蛋白与HC-Pro的序列相似性，推测28kDa蛋白可能与HC-Pro功能相似，即与介体传播及多聚蛋白的切割有关。另外，Davidson于1991年通过构建缺失切割位点来进行的体外翻译实验，也从另一个方面证实，大麦黄花叶病毒RNA2 28kDa具有蛋白酶功能[12]。28kDa蛋白通常伴随病毒粒子出现，但并不是共价结合在病毒粒子上，或许28kDa蛋白在病毒的复制和移动中是必需的。28kDa蛋白的功能还有待进一步研究来证实。本研究所制备的28kDa蛋白抗血清为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
, http://www.100md.com
参考文献
1 于善谦，陈仲宜，徐来升等.发生在我国的小麦黄花叶病，植物保护学报，1986，13(4)：217～219
2 Kashiwazaki S, Minobe Y, Omura T et al. Nucleotide sequence of barley yellow mosaic virus RNA1. J Gen Virol, 1990,71:2781～2790
3 Kashiwazaki S, Minobe Y, Hibino H. Nucleotide sequence of barley yellow mosaic virus RNA2. J Gen Virol, 1991, 72:995～999
4 Sambrook J, Fritsh E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
, 百拇医药
5 Hager, D A, Burgess R R. Elution of proteins from sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel, removal of sodium dodecyl sulfate and renaturation of enzymatic activity. Analytical Biocheminstry, 1980, 109:76～86
6 Hames, B D, Rickwood, D. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach. 2nd edtion. Oxford University Press, 1990.
7 Towbin, H. Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application. PNAS USA, 1979,76:4350～4354
, 百拇医药
8 Murphy, F A, Rychlik, W. Virus taxonomy: Classification and Nomenclature of viruses. Sixth Report of the International Committe on Taxonomy of Viruses. Springer-Verlag Wien, 1995.
9 Namba S, Kashiwazaki S, Lu X et al. Complete nucleotide sequence of wheat yellow mosaic bymovirus genomic RNAs. Arch Virol, 1998,143:631～643
10 Carrington J C, Cary S M, Parks T D. A second proteinase encoded by a plant Potyvirus genome. EMBO Journal, 1989,8:365-370
11 Krausslich, H G. Viral proteinase. Annual Review of Biochemistry, 1988,57:701～754
12 Davidson A D, Prols M. The nucleotide sequence of RNA2 of barley yellow mosaic virus. J G Virol, 1991, 72:989～993, 百拇医药
单位：中国农业大学生物技术国家重点实验室，北京100094
关键词：小麦黄花叶病毒；蛋白基因；原核表达；抗血清
中国病毒学/990305 摘 要 根据小麦黄花叶病毒(WYMV)核苷酸序列测定结果，将WYMV RNA 2上的28kDa蛋白基因克隆到pET11a上，构建了原核表达载体pE2839。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，28kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原，免疫家兔，首次制备了小麦黄花叶病毒RNA2 蛋白特异性抗血清。
Overexpression of 28kDa Protein Encoded by
Wheat Yellow Mosaic Virus RNA2 in E. coli
, 百拇医药
Su Ning Han Chenggui Li Dawei Hou Zhanjun
Xing Yiming Yu Jialin Liu Yi
(State Key Laboratory for Agrobiotechnology, China Agricultural University, Beijing 100094)
Abstract With polymerase chain reaction (PCR) a fragment encoding the 28 kDa protein of wheat yellow mosaic virus (WYMV) RNA2 was amplified and constructed into plasmid of pET11a for prokaryotic expression. BL21 (DE3) of E.coli transformed with the recombinant plasmid of pE2839 was induced to specifically express the 28 kDa protein in high level. The expressed 28 kDa protein was purified from SDS-polyacrylamide gels and the antiserum against the protein was raised in rabbit. In Western-blotting analysis, the antiserum reacted with the 28kDa protein.
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Key words Wheat yellow mosaic virus, Protein gene, Prokaryotic expression, Antiserum
小麦黄花叶病是亚洲小麦产区广为流行的一种真菌传病毒病害，七十年代末在我国首次报道[1]。该病害是由小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus, WYMV)侵染所引起的，表现为小麦植株矮化，成穗率低，严重影响小麦产量。由于其传播介体禾谷类多粘菌(Polymyxa graminis)为植物根部专性寄生真菌，其休眠孢子抗逆力强，可被释放到土壤中存活多年，所以目前除选择抗病品种外，无其它有效的防治措施。
WYMV为大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)成员，基因组由长、短两条单链正意RNA构成[2，3]。根据WYMV相近的其他大麦黄花叶病毒属病毒的研究结果，此类病毒RNA2编码两种分子量分别为28kDa和70kDa的蛋白，可能与介体的传播有关[2]。本研究在对小麦黄花叶病毒cDNA合成及序列测定的基础上(未发表)，将RNA2编码的28kDa蛋白基因片段克隆到原核表达载体中，获得了高效表达并制备了其相应的特异性抗血清，为今后对28kDa蛋白的检测和功能研究奠定了基础。
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1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)pLysS和原核表达载体pET11a由本室保存。含有WYMV 28kDa蛋白基因片段的cDNA重组质粒pGWH44为本室克隆。
1.2 酶及试剂
Western blotting试剂盒购自Promega公司。蛋白分子量标准购自Pharmacia公司。硝酸纤维素膜购自Schleicher & Schuell公司。IPTG等其他化学试剂及各种限制性内切酶或工具酶购自华美生物工程公司。引物由中国科学院微生物所技术室合成。
1.3 PCR引物合成、基因扩增与表达载体的构建
根据本室对WYMV RNA2 cDNA的序列测定结果(GenBank登录号：AF041041)，结合对大麦黄花叶病毒属其他病毒RNA2序列的结构分析，分别设计了针对28kDa蛋白编码区上、下游两端序列的引物P1和P2。引物具体序列如下：
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引物P1：5′-TTTCCAGTACTATGGCATCCACCAG-3′与WYMV RNA2的148～173核苷酸(nt)相对应，并引入一个ScaⅠ位点。
引物P2：5′-GGCCTGGATCCTCAGCTCAGCCGAC-3′与WYMV RNA2的940～915nt互补，并引入一个BamHI位点和一个翻译终止密码子。
利用引物P1与P2，以含有WYMV RNA2 28kDa蛋白基因的cDNA重组质粒pGWH44为模板进行PCR扩增，电泳回收扩增产物后，以ScaⅠ和BamHI双酶切处理。载体质粒pET11a用NdeⅠ酶切，经DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段补平后再用BamHI酶切。经处理的PCR产物及载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α后筛选重组子，PCR鉴定含有28kDa蛋白基因的非融合蛋白原核表达载体。
1.4 28kDa蛋白基因的诱导表达及SDS-PAGE电泳分析
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将筛选获得的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，挑取单菌落接种于3mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)，于37℃活化过夜后，按1∶100稀释加入到6mL LB液体培养基中(含氨苄青霉素100μg/mL)，振荡培养至OD600值为0.7～0.9，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，继续于37℃摇床培养3～4h。离心集菌后加入500μL样品缓冲液(40mmol/L Tris-HCl, pH6.8,10%甘油， 2%SDS，5%巯基乙醇，0.1%溴酚兰)，煮沸10min，置4℃备用。
将诱导产物经12.5%的SDS-PAGE电泳分析，用考马斯亮蓝R-250染色，脱色(脱色液∶10%甲醇，10%冰乙酸)至背景清晰为止。
1.3及1.4两项内容所涉及的常规分子生物学技术均参照Sambrook的方法[4]。
, 百拇医药 1.5 抗血清制备及Western-blotting检测
参照Hager等[5]的方法染色，从凝胶中切下特异性表达蛋白条带，按1∶1比例(W/V)加入PBS缓冲液(0.14mol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl,1.5mmol/L KH2PO4, 8.1mmol/L Na2HPO4)，于冰浴中研磨。用PBS缓冲液适当稀释回收的蛋白混合物后，加入等体积的福氏不完全佐剂(1.5g羊毛脂+8mL石蜡油)进行乳化。参照Hames的方法[6]制备WYMV 28kDa蛋白抗血清，每次免疫剂量为2.5mL乳化抗原溶液(抗原约为3mg)。采血后收集的抗血清加入0.1%迭氮钠，分装后-20℃贮存。
参照Towbin等人的方法[7]进行Western-boltting检测。
2 结果
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2.1 原核表达载体的构建
根据本室对WYMV RNA2的序列分析结果(GenBank登录号：AF041041)，28kDa蛋白编码区起始于160nt，位于一个约98kDa的多肽前体编码区的5′末端。与相近的大麦黄花叶病毒(BaYMV)和大麦和性花叶病毒(BMMV)的研究结果比较，WYMV 28kDa蛋白可能是在921nt上、下游编码的氨基酸G/S位点，通过翻译后切割所生成的。因此，本文在引物P2中将922～924nt处的核苷酸TCA变为TGA，从而引入一个终止子。并在起始密码子ATG上游和引入的终止子TGA下游分别引入相应的酶切位点，以便于重组DNA操作。
经PCR扩增后，获得一个长度约为800个核苷酸的DNA片段，与设计期望长度相符。按1.3所述，该片段及表达载体pET11a经酶切、抽提处理后，进行连接并转化大肠杆菌DH5α。挑取单菌落进行培养并提取重组质粒，经PCR鉴定，得到重组质粒pE2839(见图1)。
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图1 表达载体pE2839的PCR鉴定
Fig.1 Identification of pE2839 by PCR
A:Products from pGWH44;
B:Products from pE2839;
C:λ DNA/Hind Ⅲ+EcoRⅠ markers.
2.2 表达产物的SDS-PAGE分析
将重组质粒pE2839转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，进行诱导表达。取20μL上样，SDS-PAGE电泳后，考马斯亮蓝染色结果表明：经IPTG诱导后，含有重组质粒pE2839的菌株可特异地产生一条与WYMV RNA2 28kDa分子量相当的蛋白条带(见图2)。光密度扫描估测结果显示，28kDa蛋白的相对表达量占菌体总蛋白的10%以上(结果未表示)。
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图2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression products
1.BL21(DE3)/pET11a;
2.BL21(DE3)/pE2839.
A.Non-induced; B.Induced;
M.Protein markers (94,67,43,30,20,14kDa).
2.3 抗血清制备和Western-blotting检测
经SDS-PAGE电泳后，染色回收特异性表达的28kDa蛋白条带。免疫家兔，获得了WYMV RNA2 28kDa抗血清。
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利用获得的28kDa蛋白抗血清进行Western-blotting分析。结果表明，所获得的抗血清仅与含有重组质粒pE2839的大肠杆菌诱导表达产物反应，产生一条清晰的着色带，而与其他对照不发生反应(图3)。由此可见，所产生的抗血清可以与原核表达的WYMV RNA2 28kDa蛋白特异结合，为特异性抗血清。
图3 利用28kDa蛋白抗血清进行Western-blotting分析
Fig.3 Western-blotting analysis using antiserum against 28kDa protein
1.BL21(DE3); 2.BL21(DE3)/pET11a; 3.BL21(DE3)/pE2839.
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3 讨论
利用表达载体pET11a构建的WYMV RNA2 28kDa蛋白原核表达载体pE2839为非融合蛋白，由于表达产物中不含有任何植物蛋白，经SDS-PAGE进一步纯化后可以作为良好的抗原来制备相应的特异性抗血清。
小麦黄色花叶病毒为大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)的成员之一，与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)同属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)[8]，WYMV除含有二分体基因组并被真菌传播以外，其他方面与马铃薯Y病毒属存在许多相似之处。除日本关于WYMV基因组序列的报道外(GenBank登录号：D86634，释放时间：1998年6月11日)[9]，本室独立完成了小麦黄花叶病毒RNA1和RNA2的序列测定。经过分析表明：WYMV RNA2编码产生多聚蛋白，其可能的切割点及由此产生的成熟蛋白与Potyvirus属病毒的HC-Pro下游区域具有很高的结构相似性和序列保守性[10]，WYMV RNA2编码的多聚蛋白也是在G/S处被切割成两种蛋白(28kDa和70kDa)[11]。关于28kDa蛋白的功能仍不清楚，根据28kDa蛋白与HC-Pro的序列相似性，推测28kDa蛋白可能与HC-Pro功能相似，即与介体传播及多聚蛋白的切割有关。另外，Davidson于1991年通过构建缺失切割位点来进行的体外翻译实验，也从另一个方面证实，大麦黄花叶病毒RNA2 28kDa具有蛋白酶功能[12]。28kDa蛋白通常伴随病毒粒子出现，但并不是共价结合在病毒粒子上，或许28kDa蛋白在病毒的复制和移动中是必需的。28kDa蛋白的功能还有待进一步研究来证实。本研究所制备的28kDa蛋白抗血清为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
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参考文献
1 于善谦，陈仲宜，徐来升等.发生在我国的小麦黄花叶病，植物保护学报，1986，13(4)：217～219
2 Kashiwazaki S, Minobe Y, Omura T et al. Nucleotide sequence of barley yellow mosaic virus RNA1. J Gen Virol, 1990,71:2781～2790
3 Kashiwazaki S, Minobe Y, Hibino H. Nucleotide sequence of barley yellow mosaic virus RNA2. J Gen Virol, 1991, 72:995～999
4 Sambrook J, Fritsh E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
, 百拇医药
5 Hager, D A, Burgess R R. Elution of proteins from sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel, removal of sodium dodecyl sulfate and renaturation of enzymatic activity. Analytical Biocheminstry, 1980, 109:76～86
6 Hames, B D, Rickwood, D. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach. 2nd edtion. Oxford University Press, 1990.
7 Towbin, H. Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application. PNAS USA, 1979,76:4350～4354
, 百拇医药
8 Murphy, F A, Rychlik, W. Virus taxonomy: Classification and Nomenclature of viruses. Sixth Report of the International Committe on Taxonomy of Viruses. Springer-Verlag Wien, 1995.
9 Namba S, Kashiwazaki S, Lu X et al. Complete nucleotide sequence of wheat yellow mosaic bymovirus genomic RNAs. Arch Virol, 1998,143:631～643
10 Carrington J C, Cary S M, Parks T D. A second proteinase encoded by a plant Potyvirus genome. EMBO Journal, 1989,8:365-370
11 Krausslich, H G. Viral proteinase. Annual Review of Biochemistry, 1988,57:701～754
12 Davidson A D, Prols M. The nucleotide sequence of RNA2 of barley yellow mosaic virus. J G Virol, 1991, 72:989～993, 百拇医药