血管紧张素Ⅱ诱导体外培养新生大鼠心肌细胞凋亡的研究
作者：崔凯军 黄德嘉
单位：华西医科大学附属第一医院心血管内科(成都 610041)
关键词：凋亡；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)；流式细胞术
华西医学990310 摘要：本实验旨在研究AngⅡ作用下，心肌细胞凋亡的情况。取新生SD大鼠的左心室组织，酶解分散成单细胞，20%小牛血清培养基中培养8天。更换培养基，加入AngⅡ。细胞在10-9M的AngⅡ下作用24小时。以低张荧光PI染液染色，用流式细胞术分析G1期前低二倍体的凋亡细胞。结果显示AngⅡ组凋亡率为16.29%±4.31%(n＝8)，对照组凋亡率为5.04%±2.72%(n＝8)，P<0.001，有显著性差异。提示AngⅡ作用24小时后引起体外培养的心肌细胞发生凋亡。
[中图分类号]R361+.3；R972+.5 [文献标识码]A
, 百拇医药
Angiotensin Ⅱ Induces Apoptosis of Neonatal
Rat Ventricular Myocytes in Vitro
CUI Kɑi-jun，HUANG De-jia
First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
Abstract：We studied the magnitude of apoptsis of myocytes exposed to Ang Ⅱ for 24 hours.Left vetricular myocytes were obtained from hearts of newborn SD rats,and were enzymatically dissociated.Cells were incubated in 20% serum medium for 8 days..Medium was changed and Ang Ⅱ was added.Myocytes were exposed to 10-9M of Ang Ⅱ for 24 hour.Cell pellets were suspended in 1ml hypotonic fluorochrome PI solution,and were analyzed by Flow Cytometic Analysis.Hypoploid cells appeared in the cell cycle distribution as cells with DNA content less than G1.Apoptotic index of myocytes exposed to AngⅡ was 16.29%±4.31%(n=8),the control was 5.04±2.72%(n=8)，P<0.001.Therefore Ang Ⅱ induced apoptosis of cardiomyocytes in vitro.
, 百拇医药
Key words：apoptosis；angiotensin Ⅱ；flow cytometric analysis
心力衰竭是一种超负荷心肌病，能量不足而造成基因表达异常是其成因。近年，越来越多的证据支持细胞凋亡在心力衰竭发病机制中起到了重要作用〔1，2〕。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种八肽的血管活性物质，心力衰竭发病过程中循环中和局部组织的AngⅡ水平升高。本实验旨在研究AngⅡ对离体培养的心肌细胞凋亡的影响，探讨AngⅡ在心力衰竭发病机制中的作用。
表1.10-9MAngⅡ组及对照组凋亡率的比较 编 号
1
2
3
4
, http://www.100md.com
5
6
7
8
AngⅡ组(%)
11.0
14.3
11.4
16.7
24.3
15.9
19.2
17.5
, 百拇医药
对照组(%)
1.4
1.5
6.3
7.1
6.5
3.0
5.8
8.7
1 材料与方法
1.1 材料 Sprague-Dawley大鼠(SD)由成都市中科院抗生素研究所动物中心提供。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，美国Sigma公司产品。碘化丙啶(PI)，美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 心室肌细胞原代培养 方法见文献〔3〕，取壹日龄SD大鼠，无菌条件下，取心室肌组织，以胰蛋白酶(0.125%)消化，以台盼蓝鉴定细胞活性后，进行原代培养。第3、4天后，见心肌细胞贴壁生长，伸出突起，呈梭形或星形。以20%小牛血清-EMEM培养基每三天换液一次。
1.2.2 分组，加入AngⅡ 待原代培养的心肌细胞生长至第8天，将培养瓶随机分为两组，每组各8例。均弃去原培养液。一组加入含AngⅡ的20%小牛血清EMEM培养液，另一组加入等量的不含AngⅡ的20%小牛血清EMEM培养液，同时置于37℃孵箱中继续培养24小时后，取出，收集细胞。
1.2.3 流式细胞仪检测凋亡 将上述细胞悬液过滤，用PBS(pH7.4)洗涤2次。加入1ml低张碘化丙啶(PI)荧光染液(含PI 50μg/ml，枸橼酸钠0.1%，TritonX-1000.1%，RNA酶0.01%)，在4℃下染色30分钟后上流细胞仪测定，以Cell Fit软件分析低二倍体的凋亡峰〔4〕。
, http://www.100md.com
2 结果
以三处浓度10-7mol/L，10-9mol/L,10-11mol/L的AngⅡ作用于心肌细胞24小时的预实验发现均能明显增加心肌细胞凋亡，故取中间浓度10-9M进行实验。AngⅡ作用组凋亡率为16.29%±4.31%(n=8)，未加AngⅡ的对照组凋亡率为5.04±2.72%(n=8)，P<0.001，有显著性差异。所以AngⅡ(10-9mol/L浓度)作用于心肌细胞24小时后，明显增加心肌细胞的凋亡率。表1显示AngⅡ组和对照组的凋亡率。
3 讨论
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)有强烈的缩血管和促进血管平滑肌增生的作用，能增加心肌收缩力，并引起心肌肥厚。在心力衰竭的情况下，循环中AngⅡ水平因肾球旁细胞分泌肾素增加而升高。同时心脏的负荷增加，使心肌细胞受到机械牵张，促进了AngⅡ的合成。增加的AngⅡ对细胞生存产生了影响。
, http://www.100md.com
Li〔5〕和Diez〔6〕均在发生心衰的自发性高血压大鼠(SHR)中发现心肌细胞凋亡增加，Diez等的研究更证明心肌凋亡率与局部ACE活性一致，用ACEI治疗后，凋亡率降至正常。这均说明AngⅡ诱导了心肌凋亡。本实验在体外直接证实了AngⅡ可以引起心肌细胞凋亡。凋亡的结果使作为收缩单位的心肌细胞数量减少，泵血功能随之下降。同时凋亡可能与心肌肥厚和纤维网络的改建共同参与了心室的重构(remodeling)。心室发生重构后，心室壁变薄，室腔扩大，舒缩功能发生障碍，使心力衰竭加重。提示AngⅡ在心力衰竭发病机制中起到重要作用。
4 参考文献
1 Narula J,Haider N,Virmani R.Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure.New Engl J Med 1996;335:1182～1189.
, http://www.100md.com
2 Giorgio olivetti,Rakesh abbi,Michael Lesch,et al.Apoptosis in the failing human heart.New Engl J Med 1997;336:1131～1141.
3 王瑞绵，戎诚兴，桂志祥：体外培养心肌细胞搏动及停搏时的细胞化学研究。解剖学报1989；20：48～51。
4 Yu-Quan Wei,Xia zhao,Yoshitaka.Induction of apoptosis by Quercetin Involvement of heat shock protein.Cancer Research 1994;54:4952～4957.
5 Zhi he Li,Oscar H.L.Bing,Xilin Long,et al.Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat.Am Journal of physio 1997;272(Heart circulation physiology,41):H2313～H2319.
6 Javier Diez,Angel Panizo,Marta Hernandez,et al.Cardiomyocyte apoptosis and cardiac Angiotensin-Converting enzyme in spontaneously hypertensive Rats.Hypertension 1997;30:1029～1034.
(收稿日期：1999-05-16)
(Received date：1999-05-16), http://www.100md.com
单位：华西医科大学附属第一医院心血管内科(成都 610041)
关键词：凋亡；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)；流式细胞术
华西医学990310 摘要：本实验旨在研究AngⅡ作用下，心肌细胞凋亡的情况。取新生SD大鼠的左心室组织，酶解分散成单细胞，20%小牛血清培养基中培养8天。更换培养基，加入AngⅡ。细胞在10-9M的AngⅡ下作用24小时。以低张荧光PI染液染色，用流式细胞术分析G1期前低二倍体的凋亡细胞。结果显示AngⅡ组凋亡率为16.29%±4.31%(n＝8)，对照组凋亡率为5.04%±2.72%(n＝8)，P<0.001，有显著性差异。提示AngⅡ作用24小时后引起体外培养的心肌细胞发生凋亡。
[中图分类号]R361+.3；R972+.5 [文献标识码]A
, 百拇医药
Angiotensin Ⅱ Induces Apoptosis of Neonatal
Rat Ventricular Myocytes in Vitro
CUI Kɑi-jun，HUANG De-jia
First University Hospital,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
Abstract：We studied the magnitude of apoptsis of myocytes exposed to Ang Ⅱ for 24 hours.Left vetricular myocytes were obtained from hearts of newborn SD rats,and were enzymatically dissociated.Cells were incubated in 20% serum medium for 8 days..Medium was changed and Ang Ⅱ was added.Myocytes were exposed to 10-9M of Ang Ⅱ for 24 hour.Cell pellets were suspended in 1ml hypotonic fluorochrome PI solution,and were analyzed by Flow Cytometic Analysis.Hypoploid cells appeared in the cell cycle distribution as cells with DNA content less than G1.Apoptotic index of myocytes exposed to AngⅡ was 16.29%±4.31%(n=8),the control was 5.04±2.72%(n=8)，P<0.001.Therefore Ang Ⅱ induced apoptosis of cardiomyocytes in vitro.
, 百拇医药
Key words：apoptosis；angiotensin Ⅱ；flow cytometric analysis
心力衰竭是一种超负荷心肌病，能量不足而造成基因表达异常是其成因。近年，越来越多的证据支持细胞凋亡在心力衰竭发病机制中起到了重要作用〔1，2〕。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一种八肽的血管活性物质，心力衰竭发病过程中循环中和局部组织的AngⅡ水平升高。本实验旨在研究AngⅡ对离体培养的心肌细胞凋亡的影响，探讨AngⅡ在心力衰竭发病机制中的作用。
表1.10-9MAngⅡ组及对照组凋亡率的比较 编 号
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, http://www.100md.com
5
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AngⅡ组(%)
11.0
14.3
11.4
16.7
24.3
15.9
19.2
17.5
, 百拇医药
对照组(%)
1.4
1.5
6.3
7.1
6.5
3.0
5.8
8.7
1 材料与方法
1.1 材料 Sprague-Dawley大鼠(SD)由成都市中科院抗生素研究所动物中心提供。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，美国Sigma公司产品。碘化丙啶(PI)，美国Sigma公司产品。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 心室肌细胞原代培养 方法见文献〔3〕，取壹日龄SD大鼠，无菌条件下，取心室肌组织，以胰蛋白酶(0.125%)消化，以台盼蓝鉴定细胞活性后，进行原代培养。第3、4天后，见心肌细胞贴壁生长，伸出突起，呈梭形或星形。以20%小牛血清-EMEM培养基每三天换液一次。
1.2.2 分组，加入AngⅡ 待原代培养的心肌细胞生长至第8天，将培养瓶随机分为两组，每组各8例。均弃去原培养液。一组加入含AngⅡ的20%小牛血清EMEM培养液，另一组加入等量的不含AngⅡ的20%小牛血清EMEM培养液，同时置于37℃孵箱中继续培养24小时后，取出，收集细胞。
1.2.3 流式细胞仪检测凋亡 将上述细胞悬液过滤，用PBS(pH7.4)洗涤2次。加入1ml低张碘化丙啶(PI)荧光染液(含PI 50μg/ml，枸橼酸钠0.1%，TritonX-1000.1%，RNA酶0.01%)，在4℃下染色30分钟后上流细胞仪测定，以Cell Fit软件分析低二倍体的凋亡峰〔4〕。
, http://www.100md.com
2 结果
以三处浓度10-7mol/L，10-9mol/L,10-11mol/L的AngⅡ作用于心肌细胞24小时的预实验发现均能明显增加心肌细胞凋亡，故取中间浓度10-9M进行实验。AngⅡ作用组凋亡率为16.29%±4.31%(n=8)，未加AngⅡ的对照组凋亡率为5.04±2.72%(n=8)，P<0.001，有显著性差异。所以AngⅡ(10-9mol/L浓度)作用于心肌细胞24小时后，明显增加心肌细胞的凋亡率。表1显示AngⅡ组和对照组的凋亡率。
3 讨论
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)有强烈的缩血管和促进血管平滑肌增生的作用，能增加心肌收缩力，并引起心肌肥厚。在心力衰竭的情况下，循环中AngⅡ水平因肾球旁细胞分泌肾素增加而升高。同时心脏的负荷增加，使心肌细胞受到机械牵张，促进了AngⅡ的合成。增加的AngⅡ对细胞生存产生了影响。
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Li〔5〕和Diez〔6〕均在发生心衰的自发性高血压大鼠(SHR)中发现心肌细胞凋亡增加，Diez等的研究更证明心肌凋亡率与局部ACE活性一致，用ACEI治疗后，凋亡率降至正常。这均说明AngⅡ诱导了心肌凋亡。本实验在体外直接证实了AngⅡ可以引起心肌细胞凋亡。凋亡的结果使作为收缩单位的心肌细胞数量减少，泵血功能随之下降。同时凋亡可能与心肌肥厚和纤维网络的改建共同参与了心室的重构(remodeling)。心室发生重构后，心室壁变薄，室腔扩大，舒缩功能发生障碍，使心力衰竭加重。提示AngⅡ在心力衰竭发病机制中起到重要作用。
4 参考文献
1 Narula J,Haider N,Virmani R.Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure.New Engl J Med 1996;335:1182～1189.
, http://www.100md.com
2 Giorgio olivetti,Rakesh abbi,Michael Lesch,et al.Apoptosis in the failing human heart.New Engl J Med 1997;336:1131～1141.
3 王瑞绵，戎诚兴，桂志祥：体外培养心肌细胞搏动及停搏时的细胞化学研究。解剖学报1989；20：48～51。
4 Yu-Quan Wei,Xia zhao,Yoshitaka.Induction of apoptosis by Quercetin Involvement of heat shock protein.Cancer Research 1994;54:4952～4957.
5 Zhi he Li,Oscar H.L.Bing,Xilin Long,et al.Increased cardiomyocyte apoptosis during the transition to heart failure in the spontaneously hypertensive rat.Am Journal of physio 1997;272(Heart circulation physiology,41):H2313～H2319.
6 Javier Diez,Angel Panizo,Marta Hernandez,et al.Cardiomyocyte apoptosis and cardiac Angiotensin-Converting enzyme in spontaneously hypertensive Rats.Hypertension 1997;30:1029～1034.
(收稿日期：1999-05-16)
(Received date：1999-05-16), http://www.100md.com