慢性丙型肝炎患者肝组织中病毒和Fas抗原表达及其与干扰素应答的关系
作者：赵西平 沈汉馨 杨东亮 郑昕 王宝菊 汪由坤 郝连杰
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院临床免疫研究室
关键词：肝炎，丙型；丙型肝炎病毒NS5抗原；Fas抗原；干扰素治疗
中华传染病杂志990305 【摘要】 目的 探讨丙型肝炎患者肝组织中HCV NS5和Fas抗原表达及其与肝组织损伤和干扰素治疗反应的关系。方法 应用α干扰素对一组慢性丙型肝炎患者进行24周治疗，停药后随访6个月，以血清丙氨酸转氨酶(ALT)恢复正常及血清HCV RNA持续阴转为完全应答标准，采用免疫组化方法检测组织中病毒和Fas抗原表达状况。结果 29例慢性丙型肝炎患者肝组织中，HCV NS5和Fas抗原呈阳性者均为19例(65.5%)，两者在肝组织中的表达显著相关；单因素相关分析时，两者均与组织病变程度有关，但多因素分析表明只有HCV NS5抗原表达水平与组织炎症活动度呈正相关。治疗和随访结束时分别有17例(58.6%)和15例(51.7%)患者表现为近期和远期完全应答。治疗前Fas表达水平与干扰素应答有关，但未见HCV NS5水平与干扰素应答有明显关系；5例随访结束时重复肝穿，3例完全应答者病毒表达显著受抑，但Fas抗原无明显改变，2例无应答者病毒表达无明显改变甚或增强，而Fas表达均增强。结论 慢性丙型肝炎肝组织中HCV NS5表达在慢性丙型肝炎发病过程中有重要意义；Fas抗原表达水平与组织中病毒表达相关；治疗前肝组织Fas表达状况与干扰素治疗反应有一定联系。
, 百拇医药
Expression of viral and Fas antigens in the livers of patients with chronic hepatitis C between before and after interferon therapy
ZHAO Xiping,SHEN Hanxin,YANG Dongliang, et al.
Research Unit of Clinical Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the expression of viral and Fas antigens in the livers of patients with chronic hepatitis C(CHC)and their relationship to liver damage and response to interferon (IFN) therapy.Methods HCV NS5 protein and Fas antigen in the liver of patients with CHC were detected immunohistochemically before and after 24-week treatment of interferon. The complete response(CR)was defined as continu ous HCV RNA seroconversion and sustained ALT level normalization.Results Among the 29 subjects with CHC, HCV NS5 protien and Fas antigen were both detected to be positive in 19 (65.5%) cases. There was a positive correlation between the expression of HCV NS5 and Fas antigen in liver.Both the expression of Fas antigen and the expression of HCV NS5 protein were correlated to liver inflammatory activity in the patients with CHC by univariate analysis,while only HCV NS5 protein had a correlation with liver inflammatory activity by multivariate analysis. There were 17 (58.6%) and 15(51.7%) cases with short and long-term CR to IFN therapy in total Fas antigen expression level in liver was correlated to the response of INF treatment, but no correlation was found between the expression of viral antigen and IFN treatment response.Conclusions There results showed that the expression of HCV NS5 protein in the liver of patients with CHC maybe take an important role in the pathogenesis of CHC.The expression of Fas antigen is correlated to HCV antigen expression and maybe an influential factor on the result of IFN therapy.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis C HCV NS5 protein Fas antigen Interferon therapy
迄今为止，对HCV致病及慢性化机制尚不清楚，对HCV感染的抗病毒治疗效果也不能令人满意。本研究选择一组干扰素治疗慢性丙型肝炎患者，对治疗前肝组织中丙型肝炎病毒NS5和Fas抗原的表达状况进行研究，以探讨其临床意义及其与干扰素治疗的关系。
材料与方法
一、临床资料
29例为本院1995年11月～1996年11月住院治疗患者，均有输血史且血清抗-HCV和HCV RNA阳性，ALT升高，病史6个月以上，排除乙型肝炎及其它已知原因的慢性肝病、失代偿性肝病或肝硬化。男15例，女14例，年龄23～60岁，平均36.5岁。给予罗扰素(Roferon,罗氏公司产品)300万单位或重组复合干扰素(CIFN，AMGEN公司生产)900万或1 500万单位肌内注射，每周3次，共治疗6个月。治疗及随访中定期检测血清HCV RNA和ALT。按以下标准评价治疗结束时的近期疗效及治疗结束后随访6个月的远期疗效，完全应答：血清ALT正常，HCV RNA持续阴转；非完全应答：ALT正常，但 HCV RNA间断或持续阳性；无应答：ALT未复常，HCV RNA可间断阴性。
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二、肝组织评价及检测
治疗前肝组织经穿刺取材，5例患者随访结束时重复肝穿，均经患者同意。肝穿组织石蜡包埋后制片，常规HE染色进行病理学诊断，按Kno-dell方案[1]计算组织炎症活动指数，按Scheuer方法计算纤维化指数。
肝组织中HCV NS5和Fas抗原检测采用PAP法，鼠抗-HCV NS5和兔抗-Fas分别为北京医科大学肝病研究所和Santa Cruz公司产品。按以下标准计算其表达强度，0：阴性；1：<10%肝细胞阳性；2：10%～30%肝细胞阳性；3：30%～50%细胞阳性；4：>50%细胞阳性。
结 果
一、肝脏损伤情况
29例患者血清ALT水平71～841(188.69±187.72) U/L，肝组织炎症活动度指数3～13(6.82±2.85)，纤维化指数1～4(2.21±1.49)，总HAI为5～15(9.07±2.85)。
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二、肝组织中病毒和Fas抗原表达状况
29例患者肝组织中，检出HCV NS5和Fas抗原阳性者各19例(65.5%)。两者均位于肝细胞浆，且在肝细胞坏死灶尤其是碎屑坏死周围表达较强。Fas抗原表达强度与病毒表达强度显著相关(r=0.543，P<0.01)。单因素相关分析时，肝组织炎症活动度随HCV NS5和Fas表达增加而增大；去除两者间相互影响后分析，则肝组织炎症活动度只与病毒表达正相关，而与Fas抗原的相关性消失，见表1；两者与纤维化指数(rFas=0.165,rHCV NS5=0.213)及血清ALT水平(rFas=0.051, rHCV NS5=0.161)均无明显关系(P>0.05)。
表1 肝组织中HCV NS5及Fas抗原表达
与炎症活动度的关系 抗 原
简单相关系数
, 百拇医药
偏相关系数
HCV NS5
0.487*
0.311Δ
Fas
0.474*
0.286
注：* P<0.005; Δ P=0.05
三、干扰素治疗反应及其与病毒和Fas抗原表达的关系
29例患者中，对干扰素的近期和远期完全应答率分别为58.6%和51.7%。Fas表达指数≥2者近期完全应答率较Fas表达指数≤1者高，但远期应答率无明显差别。HCV NS5抗原水平高低者间完全应答率则差异无显著性，见表2。5例重复肝穿者治疗前后肝组织中病毒和Fas抗原表达，见表3。3例完全应答者肝组织中病毒表达水平明显下降或消失，但Fas改变不明显；无应答的2例病毒表达无减少甚或增强，Fas抗原表达却均增强。
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表2 肝组织中Fas及HCV NS5抗原表达水平
与完全应答的关系 完全应答
Fas抗原
HCV NS5抗原
≥2
<2
≥2
<2
治疗结束时
10/11*
7/18*
8/13
, 百拇医药
9/16
随访结束时
7/11
8/18
7/13
8/16
* 两者比较，P=0.007
表3 干扰素治疗前后肝组织中病毒和Fas表达状况 编号
HCV NS5抗原
Fas抗原
疗效评价
治疗前
, 百拇医药
治疗后
治疗前
治疗后
治疗结束时
随访结束时
102
3
0
1
0
完全应答
完全应答
109
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2
2
1
4
无应答
无应答
110
4
1
3
3
完全应答
完全应答
117
, 百拇医药
3
0
1
1
完全应答
完全应答
121
0
1
0
4
无应答
无应答
讨 论 HCV致病及慢性化机制不明。病毒基因型别和类似株与病程演变可能有一定关系，但大量研究表明体内病毒负荷与病情轻重并无明显关系[2]。Tsutsumi等[3]报道肝组织中HCV NS5抗原的表达与肝脏损伤有关，我们也发现HCV NS5表达与肝细胞炎性坏死有密切关系[4]。本研究中，我们进一步证明慢性丙型肝炎肝组织HCV NS5表达水平与组织炎症活动度成正相关。综合分析这些现象，提示除病毒因素外，机体的免疫应答可能在HCV致病过程中具有重要作用。有证据表明针对HCV的特异性细胞免疫应答是导致肝组织损伤的重要原因[5，6]。
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Fas抗原是细胞信号传导的重要途径。我们曾报道Fas抗原在病毒性肝炎表达增强，且其检出率随组织病变程度加重而增加[7]。本研究中，我们发现Fas抗原表达水平与组织中病毒表达显著相关，提示病毒可诱导Fas表达。单因素相关分析时，肝组织中Fas表达与肝组织炎症活动度正相关，但去除病毒因素的影响后，这种相关性消失，表明肝组织Fas抗原表达与组织损伤并无直接联系。
影响慢性丙型肝炎干扰素疗效的因素较多。本组病例中，治疗结束时的完全应答率为58.6%，停药6个月时完全应答率为51.7%，较文献报道结果略高，可能与本组病例患者年龄较小、组织病变较轻有关。本研究中还发现治疗前肝组织中Fas表达程度与干扰素治疗的近期反应有一定关系，表达较强者近期效果较好，但其与远期应答率无明显关系。Kotoh等[8]也有类似发现。5例治疗后重复肝穿患者，完全应答的3例治疗前后Fas表达无明显改变，而无应答的2例治疗后表达明显增强。由于例数较少，据此尚难看出干扰素治疗后Fas抗原的变化情况及其与治疗反应的关系。干扰素治疗后Fas表达增强提示其表达也可能与体内干扰素水平有关。
, 百拇医药
本研究中，治疗前肝组织中HCV NS5抗原表达水平与干扰素疗效无明显关系，但治疗前后肝组织病毒表达的变化与患者对干扰素的应答反应相一致，即有效者病毒表达受抑制甚或消失，而无效者无明显变化甚或增强。有待进一步观察的是治疗后组织中病毒表达并未完全消失者病情是否会复发。
参考文献
1 Knodell RG, Ishak KG, Black WC, et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asympatomatic chronic active hepatitis. Hepatology, 1981, 1:431-435.
2 郝连杰.丙型肝炎病毒感染的致病机理.国外医学流行病学传染病学分册，1996，23：112-116.
, http://www.100md.com
3 Tsutsumi M, Urashima S, Takada A, et al. Detection of antigens related to hepatitis C virus RNA encoding the NS5 region in the liver of patients with chronic type C hepatitis. Hepatology, 1994, 19:265-272.
4 赵西平，杨东亮，郝连杰，等.丙型肝炎病毒非结构蛋白5在肝组织中的表达与意义.中华内科杂志，1997，36：122.
5 Liaw YF, Lee CS, Tsai SL, et al. T-cell-mediated autologous hepatocytotoxicity in patients with chronic hepatitis C virus infection. Hepatology, 1995,22:1368-1373.
, 百拇医药
6 Mosnier JF, Scoazec JY, Marcellin P, et al. Expression of cytokine-dependent immune adhesion molecules by hepatocytes and bile duct cells in chronic hepatitis C. Gastroenterology, 1994, 107:1457-1468.
7 赵西平，杨东亮，郝连杰.肝病患者肝组织中Fas抗原表达及其与病毒和凋亡关系的研究.中华肝脏病杂志，1997，5：19-21.
8 Kotoh K, Masumoto A, Unoki H, et al. Role of Fas antigen expression on hepatocytes in chronic hepatitis C: relation to the efficacy of interferon therapy. Hepatology, 1996, 24: 356A.
(收稿：1998-11-02 修回：1999-04-07), http://www.100md.com
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院临床免疫研究室
关键词：肝炎，丙型；丙型肝炎病毒NS5抗原；Fas抗原；干扰素治疗
中华传染病杂志990305 【摘要】 目的 探讨丙型肝炎患者肝组织中HCV NS5和Fas抗原表达及其与肝组织损伤和干扰素治疗反应的关系。方法 应用α干扰素对一组慢性丙型肝炎患者进行24周治疗，停药后随访6个月，以血清丙氨酸转氨酶(ALT)恢复正常及血清HCV RNA持续阴转为完全应答标准，采用免疫组化方法检测组织中病毒和Fas抗原表达状况。结果 29例慢性丙型肝炎患者肝组织中，HCV NS5和Fas抗原呈阳性者均为19例(65.5%)，两者在肝组织中的表达显著相关；单因素相关分析时，两者均与组织病变程度有关，但多因素分析表明只有HCV NS5抗原表达水平与组织炎症活动度呈正相关。治疗和随访结束时分别有17例(58.6%)和15例(51.7%)患者表现为近期和远期完全应答。治疗前Fas表达水平与干扰素应答有关，但未见HCV NS5水平与干扰素应答有明显关系；5例随访结束时重复肝穿，3例完全应答者病毒表达显著受抑，但Fas抗原无明显改变，2例无应答者病毒表达无明显改变甚或增强，而Fas表达均增强。结论 慢性丙型肝炎肝组织中HCV NS5表达在慢性丙型肝炎发病过程中有重要意义；Fas抗原表达水平与组织中病毒表达相关；治疗前肝组织Fas表达状况与干扰素治疗反应有一定联系。
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Expression of viral and Fas antigens in the livers of patients with chronic hepatitis C between before and after interferon therapy
ZHAO Xiping,SHEN Hanxin,YANG Dongliang, et al.
Research Unit of Clinical Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To study the expression of viral and Fas antigens in the livers of patients with chronic hepatitis C(CHC)and their relationship to liver damage and response to interferon (IFN) therapy.Methods HCV NS5 protein and Fas antigen in the liver of patients with CHC were detected immunohistochemically before and after 24-week treatment of interferon. The complete response(CR)was defined as continu ous HCV RNA seroconversion and sustained ALT level normalization.Results Among the 29 subjects with CHC, HCV NS5 protien and Fas antigen were both detected to be positive in 19 (65.5%) cases. There was a positive correlation between the expression of HCV NS5 and Fas antigen in liver.Both the expression of Fas antigen and the expression of HCV NS5 protein were correlated to liver inflammatory activity in the patients with CHC by univariate analysis,while only HCV NS5 protein had a correlation with liver inflammatory activity by multivariate analysis. There were 17 (58.6%) and 15(51.7%) cases with short and long-term CR to IFN therapy in total Fas antigen expression level in liver was correlated to the response of INF treatment, but no correlation was found between the expression of viral antigen and IFN treatment response.Conclusions There results showed that the expression of HCV NS5 protein in the liver of patients with CHC maybe take an important role in the pathogenesis of CHC.The expression of Fas antigen is correlated to HCV antigen expression and maybe an influential factor on the result of IFN therapy.
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【Key words】 Hepatitis C HCV NS5 protein Fas antigen Interferon therapy
迄今为止，对HCV致病及慢性化机制尚不清楚，对HCV感染的抗病毒治疗效果也不能令人满意。本研究选择一组干扰素治疗慢性丙型肝炎患者，对治疗前肝组织中丙型肝炎病毒NS5和Fas抗原的表达状况进行研究，以探讨其临床意义及其与干扰素治疗的关系。
材料与方法
一、临床资料
29例为本院1995年11月～1996年11月住院治疗患者，均有输血史且血清抗-HCV和HCV RNA阳性，ALT升高，病史6个月以上，排除乙型肝炎及其它已知原因的慢性肝病、失代偿性肝病或肝硬化。男15例，女14例，年龄23～60岁，平均36.5岁。给予罗扰素(Roferon,罗氏公司产品)300万单位或重组复合干扰素(CIFN，AMGEN公司生产)900万或1 500万单位肌内注射，每周3次，共治疗6个月。治疗及随访中定期检测血清HCV RNA和ALT。按以下标准评价治疗结束时的近期疗效及治疗结束后随访6个月的远期疗效，完全应答：血清ALT正常，HCV RNA持续阴转；非完全应答：ALT正常，但 HCV RNA间断或持续阳性；无应答：ALT未复常，HCV RNA可间断阴性。
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二、肝组织评价及检测
治疗前肝组织经穿刺取材，5例患者随访结束时重复肝穿，均经患者同意。肝穿组织石蜡包埋后制片，常规HE染色进行病理学诊断，按Kno-dell方案[1]计算组织炎症活动指数，按Scheuer方法计算纤维化指数。
肝组织中HCV NS5和Fas抗原检测采用PAP法，鼠抗-HCV NS5和兔抗-Fas分别为北京医科大学肝病研究所和Santa Cruz公司产品。按以下标准计算其表达强度，0：阴性；1：<10%肝细胞阳性；2：10%～30%肝细胞阳性；3：30%～50%细胞阳性；4：>50%细胞阳性。
结 果
一、肝脏损伤情况
29例患者血清ALT水平71～841(188.69±187.72) U/L，肝组织炎症活动度指数3～13(6.82±2.85)，纤维化指数1～4(2.21±1.49)，总HAI为5～15(9.07±2.85)。
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二、肝组织中病毒和Fas抗原表达状况
29例患者肝组织中，检出HCV NS5和Fas抗原阳性者各19例(65.5%)。两者均位于肝细胞浆，且在肝细胞坏死灶尤其是碎屑坏死周围表达较强。Fas抗原表达强度与病毒表达强度显著相关(r=0.543，P<0.01)。单因素相关分析时，肝组织炎症活动度随HCV NS5和Fas表达增加而增大；去除两者间相互影响后分析，则肝组织炎症活动度只与病毒表达正相关，而与Fas抗原的相关性消失，见表1；两者与纤维化指数(rFas=0.165,rHCV NS5=0.213)及血清ALT水平(rFas=0.051, rHCV NS5=0.161)均无明显关系(P>0.05)。
表1 肝组织中HCV NS5及Fas抗原表达
与炎症活动度的关系 抗 原
简单相关系数
, 百拇医药
偏相关系数
HCV NS5
0.487*
0.311Δ
Fas
0.474*
0.286
注：* P<0.005; Δ P=0.05
三、干扰素治疗反应及其与病毒和Fas抗原表达的关系
29例患者中，对干扰素的近期和远期完全应答率分别为58.6%和51.7%。Fas表达指数≥2者近期完全应答率较Fas表达指数≤1者高，但远期应答率无明显差别。HCV NS5抗原水平高低者间完全应答率则差异无显著性，见表2。5例重复肝穿者治疗前后肝组织中病毒和Fas抗原表达，见表3。3例完全应答者肝组织中病毒表达水平明显下降或消失，但Fas改变不明显；无应答的2例病毒表达无减少甚或增强，Fas抗原表达却均增强。
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表2 肝组织中Fas及HCV NS5抗原表达水平
与完全应答的关系 完全应答
Fas抗原
HCV NS5抗原
≥2
<2
≥2
<2
治疗结束时
10/11*
7/18*
8/13
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9/16
随访结束时
7/11
8/18
7/13
8/16
* 两者比较，P=0.007
表3 干扰素治疗前后肝组织中病毒和Fas表达状况 编号
HCV NS5抗原
Fas抗原
疗效评价
治疗前
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治疗后
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治疗后
治疗结束时
随访结束时
102
3
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完全应答
完全应答
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无应答
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完全应答
完全应答
117
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完全应答
完全应答
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无应答
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讨 论 HCV致病及慢性化机制不明。病毒基因型别和类似株与病程演变可能有一定关系，但大量研究表明体内病毒负荷与病情轻重并无明显关系[2]。Tsutsumi等[3]报道肝组织中HCV NS5抗原的表达与肝脏损伤有关，我们也发现HCV NS5表达与肝细胞炎性坏死有密切关系[4]。本研究中，我们进一步证明慢性丙型肝炎肝组织HCV NS5表达水平与组织炎症活动度成正相关。综合分析这些现象，提示除病毒因素外，机体的免疫应答可能在HCV致病过程中具有重要作用。有证据表明针对HCV的特异性细胞免疫应答是导致肝组织损伤的重要原因[5，6]。
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Fas抗原是细胞信号传导的重要途径。我们曾报道Fas抗原在病毒性肝炎表达增强，且其检出率随组织病变程度加重而增加[7]。本研究中，我们发现Fas抗原表达水平与组织中病毒表达显著相关，提示病毒可诱导Fas表达。单因素相关分析时，肝组织中Fas表达与肝组织炎症活动度正相关，但去除病毒因素的影响后，这种相关性消失，表明肝组织Fas抗原表达与组织损伤并无直接联系。
影响慢性丙型肝炎干扰素疗效的因素较多。本组病例中，治疗结束时的完全应答率为58.6%，停药6个月时完全应答率为51.7%，较文献报道结果略高，可能与本组病例患者年龄较小、组织病变较轻有关。本研究中还发现治疗前肝组织中Fas表达程度与干扰素治疗的近期反应有一定关系，表达较强者近期效果较好，但其与远期应答率无明显关系。Kotoh等[8]也有类似发现。5例治疗后重复肝穿患者，完全应答的3例治疗前后Fas表达无明显改变，而无应答的2例治疗后表达明显增强。由于例数较少，据此尚难看出干扰素治疗后Fas抗原的变化情况及其与治疗反应的关系。干扰素治疗后Fas表达增强提示其表达也可能与体内干扰素水平有关。
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本研究中，治疗前肝组织中HCV NS5抗原表达水平与干扰素疗效无明显关系，但治疗前后肝组织病毒表达的变化与患者对干扰素的应答反应相一致，即有效者病毒表达受抑制甚或消失，而无效者无明显变化甚或增强。有待进一步观察的是治疗后组织中病毒表达并未完全消失者病情是否会复发。
参考文献
1 Knodell RG, Ishak KG, Black WC, et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asympatomatic chronic active hepatitis. Hepatology, 1981, 1:431-435.
2 郝连杰.丙型肝炎病毒感染的致病机理.国外医学流行病学传染病学分册，1996，23：112-116.
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3 Tsutsumi M, Urashima S, Takada A, et al. Detection of antigens related to hepatitis C virus RNA encoding the NS5 region in the liver of patients with chronic type C hepatitis. Hepatology, 1994, 19:265-272.
4 赵西平，杨东亮，郝连杰，等.丙型肝炎病毒非结构蛋白5在肝组织中的表达与意义.中华内科杂志，1997，36：122.
5 Liaw YF, Lee CS, Tsai SL, et al. T-cell-mediated autologous hepatocytotoxicity in patients with chronic hepatitis C virus infection. Hepatology, 1995,22:1368-1373.
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6 Mosnier JF, Scoazec JY, Marcellin P, et al. Expression of cytokine-dependent immune adhesion molecules by hepatocytes and bile duct cells in chronic hepatitis C. Gastroenterology, 1994, 107:1457-1468.
7 赵西平，杨东亮，郝连杰.肝病患者肝组织中Fas抗原表达及其与病毒和凋亡关系的研究.中华肝脏病杂志，1997，5：19-21.
8 Kotoh K, Masumoto A, Unoki H, et al. Role of Fas antigen expression on hepatocytes in chronic hepatitis C: relation to the efficacy of interferon therapy. Hepatology, 1996, 24: 356A.
(收稿：1998-11-02 修回：1999-04-07), http://www.100md.com