内皮素1对人牙髓细胞胶原合成的影响
作者：严焱 刘正
单位：200011 上海第二医科大学口腔医学院
关键词：内皮缩血管肽类；胶原；酶联免疫吸附测定；免疫组织化学
中华口腔医学杂志/990311 【摘要】 目的 探讨内皮素1 (endothelin-1,ET-1)对人牙髓细胞(human dental pulp cells，HDPC)胶原合成的影响。方法 采用细胞培养、酶联免疫吸附分析及免疫组化染色等方法，就ET-1对HDPC胶原合成的影响进行了研究。结果 ET-1较对照组除24小时时相外，均有不同程度的促HDPC可溶性I型胶原合成作用，但对III型胶原作用不明显；经免疫组化染色证实：ET-1尚可同时促进细胞非溶解性I型胶原合成。结论 ET-1促进HDPC I型胶原合成增加，可能对牙髓组织的自身修复起作用。
Effects of endothelin -1 on the collagen synthesis of cultured human dental pulp cells YAN Yan，LIU Zheng. School of Stomatology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To study the effects of endothelin-1(ET-1) on the collagen synthesis of cultured human dental pulp cells. Methods Cell cultured, enzyme linked immmun sorbent assay (ELISA),and ABC immunhistochemical staining were used in the study. Results ET-1 increased the synthesis of soluble type I collagen in different periods besides the 24h group, and had no effects on the type III collagen; immunohistochemical staining revealed that ET-1 also increased the synthesis of unsoluble type I collagen. Conclusion ET-1 can stimulate type I collagenic synthesis of human dental pulp cells and might have an effect on pulp self-restoration.
, 百拇医药
【Key words】 Endothelins Collagen Enzyme-linked immmunosorbent assay Immunohistochemistry
细胞外间质(extro cellular matrix，ECM)是由胶原等蛋白组成，目前认为ECM除了支持、保护作用外，还与细胞增生、分化、伤口愈合及钙化等机体功能有着密切联系。内皮素1(endothelin-1，ET-1)具有促进人牙髓细胞(human dental pulp cells ，HDPC)增生及促进细胞内Ca2+增加等作用，但ET-1对HDPC胶原合成的作用迄今尚未见报道。为此，我们运用细胞培养、酶联免疫吸附测定及免疫组化染色等方法对ET-1对HDPC胶原的合成作用进行了研究。
材料与方法
1.材料:①I型Collage单抗 (Sigma,U.S.A.)；②III型Collage单抗 (Sigma,U.S.A.)；③ET-1 (Sigma,U.S.A.)；④ABC试剂盒 (Vector,U.S.A.)；⑤羊抗小鼠II抗 (华美)；⑥Vitarmin C (上海)；⑦I、III型胶原标准品 (华美)。
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2.实验分组：①空白对照组：DMEM+10%FBS；②实验ET-1组：含10-6 mol/L ET-1的10% FBS；③实验VitC组：将50 mg/L VitC溶于10% FBS。
3.实验方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[1]：细胞第8代，按2万/孔接种于24孔板内，每孔内含1 cm×1 cm大小的盖玻片，每组6孔。12% FBS置于37℃培养箱常规培养，48小时后待细胞长成单层，培养液换成含实验所需条件10% FBS的DMEM，连续置于37℃、5% CO2中培养，分别于3小时、12小时、24小时及72小时取出，收集培养液，于-70℃下保存待测。
4.绘制标准曲线：将胶原(I型、III型)所用包被液(pH 9.6的碳酸缓冲液)稀释为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4及12.8 mg/L，再将此胶原稀释液加入聚苯乙烯微孔板小孔内，每孔100 μl，置4℃下12小时。用PBS-tween 20洗3次，加I、III型胶原抗血清(1∶1 000)100 μl，放37℃湿盒1小时，取出孔板，用PBS-tween 20洗3次，加入羊抗小鼠(过氧化物酶标记)IgG，每孔100 μl，37℃湿盒1小时。取出，用PBS-tween 20漂洗，加入酶底物(邻苯二胺)，室温湿盒中反应30 min，然后加入25 μl 2 mol/L 的H2SO4终止反应，在490 nm波长下比色，以A490为纵座标，绘制标准曲线。
, 百拇医药
5.样本测试：参照绘制标准曲线的方法，将100 μl样本放入聚苯乙烯微孔内(用NaOH调pH至9.6)，用100 μl的10% FBS调零，4℃下12小时，以后各步骤同上。
6.ABC免疫组织化学法[2]：95% 丙酮固定，用0.25% TritonX-100及5% DMSO漂洗10 min，浸入37℃ 0.75%及1.5%的H2O2-PBS中15 min(阻断内源性过氧化物酶)。PBS洗3次，滴加正常马血清，置37℃湿盒内30 min，清除非特异性染色，30 min后弃去马血清。滴加小鼠抗人I型胶原特异性抗体(1∶1 000)，4℃12小时，PBS振洗3 min，共3次，ABC复合试剂37℃ 30 min，PBS振洗2次，THB振洗3 min。DAB显色10～20 min。水洗5 min，逐级乙醇脱水，石碳酸、二甲苯透明、封片，镜下观察。
7.统计学方法：数据以
±s表示，采用方差分析，以P<0.05为显著性标准。
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结果
1. ET-1对人牙髓细胞I型胶原合成的影响：经ELISA方法检测，与对照组相比，ET-1、VitC组I型胶原浓度在12及72小时明显增加，P<(0.05～0.01)；但在3、24及48小时3组间I型胶原浓度差异均无显著性，P> 0.05(图1)。
图1 内皮素1、VitC及I型胶原的浓度比较
2. ET-1对人牙髓细胞III型胶原合成的影响：图2所示，ET-1、VitC与对照组细胞相比，3组间对III型胶原的作用差异无显著性，P>0.05。
图2 内皮素1、VitC及III型胶原的浓度比较
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3.I型胶原ABC免疫组化染色观察：3组培养细胞均可见I型胶原阳性着色。胶原多呈网织、条索状，其间可见散在的牙髓细胞胞核，部分胞核成团，形态较模糊。ET-1(图3)及VitC组(图4)的阳性程度均强于对照组(图5)。
图3 对照组12小时，I型胶原染色弱阳性(↑)，胶原呈稀疏条索状，细胞核散在，部分融合成团(N)，形态较模糊 (ABC×224)
图4 ET-1组12小时，I型胶原染色阳性(↑)，胶原密集呈网状 (ABC×140)
图5 Vit C组12小时，I型胶原染色阳性(↑)，胶原密集呈树枝状分布，细胞核清晰(N) (ABC×224)
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讨论
胶原是牙髓组织中细胞外间质的主要成分。它对局部牙髓组织中牙髓细胞的分化、增殖及牙髓修复、抗损伤等均有重要意义。本组实验发现，ET-1较对照组除实验24小时时相外，均有不同程度的促I型胶原合成作用，以12及72小时最为显著，但对III型胶原的作用不明显。这提示ET-1在促进HDPC的胶原合成中有亚型的区别。本组结果与Rizvi和Myers[3]一致。这可能与牙髓内I型胶原含量最高，HDPC受ET-1刺激后优先表达I型胶原有关。由此我们认为，ET-1对牙髓组织疾病状态时的自身修复起作用。
ET-1促HDPC胶原合成的机制仍不清楚，这可能与抑制细胞内胶原酶活性[4]、ET-1与受体结合后不易分离，延长了其刺激效应[5]及ET-1通过细胞内其它生长因子的表达而调节胶原水平[6]有关。ET-1促HDPC胶原合成机制尚有待进一步研究。
, 百拇医药
本实验发现，在实验初始3～24小时，各组胶原浓度均有下降趋势，这可能与细胞对置换较低浓度血清不适应、表现出的不稳定状态有关。研究还发现，实验中0.4%及1% FBS血清的低浓度不能支持HDPC，使用后细胞出现漂浮。由此证明：牙髓细胞是十分娇嫩的细胞，实验中所能耐受的最低血清浓度为10% FBS。
免疫吸附分析法(ELISA)于1980年被改良，可利用特异性抗体直接测量组织内胶原。Buckley等[6]及Burke等[7]以往的研究均证明,细胞培养时合成分泌的胶原为可溶性胶原，且多分布在培养液内。本研究采用ELISA方法，利用I、III型胶原单抗检测了不同实验组HDPC的可溶性胶原浓度，并结合免疫组化法直接观察了细胞染色情况，结果表明两种实验方法结果基本一致。提示HDPC所分泌的胶原，除部分为可溶性溶解在培养液内，其余部分则为不溶解性分泌沉积在细胞外周，以形成三维结构的胞外基质，利于细胞的多层粘附、生长。由于两组实验结果平行，我们认为ELISA与免疫组化法均可选择，可根据不同实验目的来决定取舍。
, 百拇医药
参考文献
[1] 李玉瑞, 主编.细胞外间质生物化学及研究方法. 第1版.北京: 人民卫生出版社, 1988.232-234.
[2] 司徒镇强, 吴军正,主编. 细胞培养. 第1版.西安：世界图书出版公司，1996.202-203.
[3] Rizvi MA, Myers PR . Nitric oxide modulates basal and endothelin-induced coronary artery vascular smooth muscle cell proliferation and collagen levels. J Mol Cell Cardiol, 1997, 29: 1779-1789.
[4] Guarda E. Myers P. Karwa L. Effects of endothelins on collagen turnover in cardiac fiborblasts. Cardiovasc Res, 1993, 27:2130-2134.
, 百拇医药
[5] Hirata Y, Yoshimi H, Takaichi S, et al. Binding and receptor down-regulation of a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells. FEBS Lett, 1988 ,239: 13-17.
[6] Buckley A, Hill KE, Davidson JM. Collagen metabolism. Methods Enzymol, 1988,163: 674- 694.
[7] Burke J, Balian G, Ross R, et al. Synthesis of type I and III procollagen and collagen by monkey aortic smooth muscle cells in vitro. Biochemistry, 1977, 16:3243-3249.
(收稿：1998-07-07 修回：1999-01-26), 百拇医药
单位：200011 上海第二医科大学口腔医学院
关键词：内皮缩血管肽类；胶原；酶联免疫吸附测定；免疫组织化学
中华口腔医学杂志/990311 【摘要】 目的 探讨内皮素1 (endothelin-1,ET-1)对人牙髓细胞(human dental pulp cells，HDPC)胶原合成的影响。方法 采用细胞培养、酶联免疫吸附分析及免疫组化染色等方法，就ET-1对HDPC胶原合成的影响进行了研究。结果 ET-1较对照组除24小时时相外，均有不同程度的促HDPC可溶性I型胶原合成作用，但对III型胶原作用不明显；经免疫组化染色证实：ET-1尚可同时促进细胞非溶解性I型胶原合成。结论 ET-1促进HDPC I型胶原合成增加，可能对牙髓组织的自身修复起作用。
Effects of endothelin -1 on the collagen synthesis of cultured human dental pulp cells YAN Yan，LIU Zheng. School of Stomatology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200011
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【Abstract】 Objective To study the effects of endothelin-1(ET-1) on the collagen synthesis of cultured human dental pulp cells. Methods Cell cultured, enzyme linked immmun sorbent assay (ELISA),and ABC immunhistochemical staining were used in the study. Results ET-1 increased the synthesis of soluble type I collagen in different periods besides the 24h group, and had no effects on the type III collagen; immunohistochemical staining revealed that ET-1 also increased the synthesis of unsoluble type I collagen. Conclusion ET-1 can stimulate type I collagenic synthesis of human dental pulp cells and might have an effect on pulp self-restoration.
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【Key words】 Endothelins Collagen Enzyme-linked immmunosorbent assay Immunohistochemistry
细胞外间质(extro cellular matrix，ECM)是由胶原等蛋白组成，目前认为ECM除了支持、保护作用外，还与细胞增生、分化、伤口愈合及钙化等机体功能有着密切联系。内皮素1(endothelin-1，ET-1)具有促进人牙髓细胞(human dental pulp cells ，HDPC)增生及促进细胞内Ca2+增加等作用，但ET-1对HDPC胶原合成的作用迄今尚未见报道。为此，我们运用细胞培养、酶联免疫吸附测定及免疫组化染色等方法对ET-1对HDPC胶原的合成作用进行了研究。
材料与方法
1.材料:①I型Collage单抗 (Sigma,U.S.A.)；②III型Collage单抗 (Sigma,U.S.A.)；③ET-1 (Sigma,U.S.A.)；④ABC试剂盒 (Vector,U.S.A.)；⑤羊抗小鼠II抗 (华美)；⑥Vitarmin C (上海)；⑦I、III型胶原标准品 (华美)。
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2.实验分组：①空白对照组：DMEM+10%FBS；②实验ET-1组：含10-6 mol/L ET-1的10% FBS；③实验VitC组：将50 mg/L VitC溶于10% FBS。
3.实验方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[1]：细胞第8代，按2万/孔接种于24孔板内，每孔内含1 cm×1 cm大小的盖玻片，每组6孔。12% FBS置于37℃培养箱常规培养，48小时后待细胞长成单层，培养液换成含实验所需条件10% FBS的DMEM，连续置于37℃、5% CO2中培养，分别于3小时、12小时、24小时及72小时取出，收集培养液，于-70℃下保存待测。
4.绘制标准曲线：将胶原(I型、III型)所用包被液(pH 9.6的碳酸缓冲液)稀释为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4及12.8 mg/L，再将此胶原稀释液加入聚苯乙烯微孔板小孔内，每孔100 μl，置4℃下12小时。用PBS-tween 20洗3次，加I、III型胶原抗血清(1∶1 000)100 μl，放37℃湿盒1小时，取出孔板，用PBS-tween 20洗3次，加入羊抗小鼠(过氧化物酶标记)IgG，每孔100 μl，37℃湿盒1小时。取出，用PBS-tween 20漂洗，加入酶底物(邻苯二胺)，室温湿盒中反应30 min，然后加入25 μl 2 mol/L 的H2SO4终止反应，在490 nm波长下比色，以A490为纵座标，绘制标准曲线。
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5.样本测试：参照绘制标准曲线的方法，将100 μl样本放入聚苯乙烯微孔内(用NaOH调pH至9.6)，用100 μl的10% FBS调零，4℃下12小时，以后各步骤同上。
6.ABC免疫组织化学法[2]：95% 丙酮固定，用0.25% TritonX-100及5% DMSO漂洗10 min，浸入37℃ 0.75%及1.5%的H2O2-PBS中15 min(阻断内源性过氧化物酶)。PBS洗3次，滴加正常马血清，置37℃湿盒内30 min，清除非特异性染色，30 min后弃去马血清。滴加小鼠抗人I型胶原特异性抗体(1∶1 000)，4℃12小时，PBS振洗3 min，共3次，ABC复合试剂37℃ 30 min，PBS振洗2次，THB振洗3 min。DAB显色10～20 min。水洗5 min，逐级乙醇脱水，石碳酸、二甲苯透明、封片，镜下观察。
7.统计学方法：数据以
±s表示，采用方差分析，以P<0.05为显著性标准。, 百拇医药
结果
1. ET-1对人牙髓细胞I型胶原合成的影响：经ELISA方法检测，与对照组相比，ET-1、VitC组I型胶原浓度在12及72小时明显增加，P<(0.05～0.01)；但在3、24及48小时3组间I型胶原浓度差异均无显著性，P> 0.05(图1)。
图1 内皮素1、VitC及I型胶原的浓度比较
2. ET-1对人牙髓细胞III型胶原合成的影响：图2所示，ET-1、VitC与对照组细胞相比，3组间对III型胶原的作用差异无显著性，P>0.05。
图2 内皮素1、VitC及III型胶原的浓度比较
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3.I型胶原ABC免疫组化染色观察：3组培养细胞均可见I型胶原阳性着色。胶原多呈网织、条索状，其间可见散在的牙髓细胞胞核，部分胞核成团，形态较模糊。ET-1(图3)及VitC组(图4)的阳性程度均强于对照组(图5)。
图3 对照组12小时，I型胶原染色弱阳性(↑)，胶原呈稀疏条索状，细胞核散在，部分融合成团(N)，形态较模糊 (ABC×224)
图4 ET-1组12小时，I型胶原染色阳性(↑)，胶原密集呈网状 (ABC×140)
图5 Vit C组12小时，I型胶原染色阳性(↑)，胶原密集呈树枝状分布，细胞核清晰(N) (ABC×224)
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讨论
胶原是牙髓组织中细胞外间质的主要成分。它对局部牙髓组织中牙髓细胞的分化、增殖及牙髓修复、抗损伤等均有重要意义。本组实验发现，ET-1较对照组除实验24小时时相外，均有不同程度的促I型胶原合成作用，以12及72小时最为显著，但对III型胶原的作用不明显。这提示ET-1在促进HDPC的胶原合成中有亚型的区别。本组结果与Rizvi和Myers[3]一致。这可能与牙髓内I型胶原含量最高，HDPC受ET-1刺激后优先表达I型胶原有关。由此我们认为，ET-1对牙髓组织疾病状态时的自身修复起作用。
ET-1促HDPC胶原合成的机制仍不清楚，这可能与抑制细胞内胶原酶活性[4]、ET-1与受体结合后不易分离，延长了其刺激效应[5]及ET-1通过细胞内其它生长因子的表达而调节胶原水平[6]有关。ET-1促HDPC胶原合成机制尚有待进一步研究。
, 百拇医药
本实验发现，在实验初始3～24小时，各组胶原浓度均有下降趋势，这可能与细胞对置换较低浓度血清不适应、表现出的不稳定状态有关。研究还发现，实验中0.4%及1% FBS血清的低浓度不能支持HDPC，使用后细胞出现漂浮。由此证明：牙髓细胞是十分娇嫩的细胞，实验中所能耐受的最低血清浓度为10% FBS。
免疫吸附分析法(ELISA)于1980年被改良，可利用特异性抗体直接测量组织内胶原。Buckley等[6]及Burke等[7]以往的研究均证明,细胞培养时合成分泌的胶原为可溶性胶原，且多分布在培养液内。本研究采用ELISA方法，利用I、III型胶原单抗检测了不同实验组HDPC的可溶性胶原浓度，并结合免疫组化法直接观察了细胞染色情况，结果表明两种实验方法结果基本一致。提示HDPC所分泌的胶原，除部分为可溶性溶解在培养液内，其余部分则为不溶解性分泌沉积在细胞外周，以形成三维结构的胞外基质，利于细胞的多层粘附、生长。由于两组实验结果平行，我们认为ELISA与免疫组化法均可选择，可根据不同实验目的来决定取舍。
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参考文献
[1] 李玉瑞, 主编.细胞外间质生物化学及研究方法. 第1版.北京: 人民卫生出版社, 1988.232-234.
[2] 司徒镇强, 吴军正,主编. 细胞培养. 第1版.西安：世界图书出版公司，1996.202-203.
[3] Rizvi MA, Myers PR . Nitric oxide modulates basal and endothelin-induced coronary artery vascular smooth muscle cell proliferation and collagen levels. J Mol Cell Cardiol, 1997, 29: 1779-1789.
[4] Guarda E. Myers P. Karwa L. Effects of endothelins on collagen turnover in cardiac fiborblasts. Cardiovasc Res, 1993, 27:2130-2134.
, 百拇医药
[5] Hirata Y, Yoshimi H, Takaichi S, et al. Binding and receptor down-regulation of a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells. FEBS Lett, 1988 ,239: 13-17.
[6] Buckley A, Hill KE, Davidson JM. Collagen metabolism. Methods Enzymol, 1988,163: 674- 694.
[7] Burke J, Balian G, Ross R, et al. Synthesis of type I and III procollagen and collagen by monkey aortic smooth muscle cells in vitro. Biochemistry, 1977, 16:3243-3249.
(收稿：1998-07-07 修回：1999-01-26), 百拇医药