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编号:10243619
耐长春新碱人舌鳞癌细胞系Tca 8113/V100的研究
http://www.100md.com 《中华口腔医学杂志》 1999年第3期
     作者:张建国 杜平 张杰 孙开华 章魁华

    单位:100081 北京医科大学口腔医学院

    关键词:口腔肿瘤;细胞系,鳞状细胞;耐药性

    中华口腔医学杂志/990302 【摘要】 目的 建立耐长春新碱(Vincristine, VCR)人舌鳞癌细胞系。方法 采用间歇性加药,逐步提高培养基中VCR的浓度,连续体外诱导,培养,建立了一株耐VCR人舌鳞癌细胞系Tca8113/V100。对其药物敏感性、倍增时间、裸鼠成瘤性、超微结构及耐多药基因等生物学特性进行了研究。结果 Tca8113/V100在含VCR 100μmol/L的培养基中稳定生长,其对VCR的耐药性为Tca8113细胞系的19.2倍,对其他几种抗癌药物也有程度不同的耐药性。Tca8113/V100倍增时间37.2小时,具有裸鼠成瘤性,病理诊断为鳞状细胞癌,超微结构观察其微绒毛短粗,mdr-1mRNA表达水平明显增高。结论 Tca8113/V100细胞系已具备多药耐药性的特点,为口腔癌多药耐药性研究提供了细胞模型。
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    Establishment and biological characteristics of Vincristine:resistant cell line from human squamous cell carcinoma ZHANG Jianguo, DU Ping, ZHANG Jie, et al. School of Stomatology, Beijing Medical University, Beijing 100081

    【Abstract】 Objective To establish a VCR-resistant cell line from human squamous cell carcinoma.Methods The cell line Tca8113 was utilized. The VCR concentration was increased gradually in consecutively passage of cultures. Results A VCR-resistant cell line Tca8113/V100 from Tca8113 was established, the cells grew steadily in 100 μmol/L medium and with 19.2 times of resistance to VCR. The cell line was also resistant to ADM, PYM, CDDP, MTX, 5-Fu at different degrees. The doubling time of the cells was 37.2 hours and showed microscopically and ultrastructurally typical squamous cell carcinoma when inoculated in nude mice. Blot hybridization showed the cells had increased espression of MDR-1mRNA.Conclusion These results indicate that the cell line has multidrug resistant ability, and the reason for this may be over expression of MDR-1 gene. This cell line provides an important model for the study on drug-resistant cell both in cellular and molecular level, and on the mechanism of drug resistance.
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    【Key words】 Mouth neoplasms Cell line, squamous cell Drug resistance

    化疗对于提高恶性肿瘤治愈率与患者生存率具有重要作用,但恶性肿瘤细胞对抗癌药产生多药耐药性(multidrug resistance, MDR)是化疗失败的重要原因之一[1]。为研究恶性肿瘤细胞的耐药机理和耐药性逆转,国内外已相继建立数株多药耐药细胞系,但尚未见建立耐长春新碱(Vincristine, VCR)人舌鳞癌细胞系的报道。本项研究采用间歇性加药方法,逐步提高培养基中VCR的浓度,经体外连续培养,建立了一株耐VCR人舌鳞癌细胞系并对其生物学特性进行了研究。

    材料与方法

    1.实验用药物:长春新碱(VCR,北京医科大学制药厂);阿霉素(ADM,意大利Farmitalia);平阳霉素(PYM,天津河北制药厂);顺氯氨铂(CDDP,齐鲁制药厂);氨甲喋呤(MTX,北京医科大学制药厂);5-氟尿嘧啶(5-FU,天津制药厂)。所有药物均用3蒸水溶解,进行药物诱导及敏感性试验时,用培养液稀释至所需浓度。
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    2.细胞培养:人舌鳞癌Tca8113细胞系由上海第二医科大学口腔医学院建立[2]。Tca8113细胞培养于含15%新生牛血清、青霉素及链霉素各1×105 U/L的RPMI 1640培养基中,在37℃、5%CO2、95%空气条件的培养箱中培养。

    3.建立Tca8113/V100细胞系:Tca8113细胞系经VCR诱导,于Tca8113细胞培养基中间歇性加药,逐步增加其中VCR的浓度。初次药物诱导浓度为10μmol/L,每2~3周增加一次药物浓度,直至达到培养基中含VCR 100μmol/L的浓度下,肿瘤细胞稳定生长并连续传代培养。将其命名为Tca8113/V100细胞系。另设不含VCR的培养基,分别培养Tca8113/V100细胞10周、20周,检测其耐药性变化。

    4.Tca8113/V100细胞生物学特性的观察:

, 百拇医药     (1)一般形态学:在倒置显微镜下观察。

    (2)细胞生长曲线测定[3]:分别接种Tca8113与Tca8113/V100细胞,于第2~7天各取2瓶细胞计数,取均值绘制细胞生长曲线,计算倍增时间。

    (3)超微结构观察:在Opton 109型电镜下观察Tca8113和Tca8113/V100细胞的超微结构。

    (4)成瘤实验:将Tca8113和Tca8113/V100细胞分别接种于裸鼠(BALA/C,6周龄,雌雄兼有,中国医学科学院药物研究所实验动物中心提供)肩胛区皮下。接种细胞数为1×107个/0.2ml每只,各接种2只。定期测量肿瘤体积。8周后切取瘤体,行病理组织检查。

    (5)斑点杂交法检测Tca8113/V100和Tca8113细胞mdr-lmRNA[4]。以异硫氰酸胍一步法分别提取Tca8113和Tca8113/V100的细胞总RNA。经3.7%甲醛变性后,用枸橼酸盐水稀释为10μg、3μg、1μg、0.3μg点于硝酸纤维素膜上,80℃烤2小时。加预杂交液,42℃保温2小时。加辣根过氧化物酶直接标记的mdr-1c DNA探针杂交,42℃保温10小时。洗膜,加发光液反应1~5分钟,放入曝光夹中,置X线胶片,曝光1~5分钟,自动洗片机洗片。
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    5.药物敏感性测定(四唑盐显色法,MTT法[5,6]):将Tca8113、Tca8113/V100对数生长期细胞分别经0.25%胰蛋白酶和0.02%依地酸(EDTA)消化,用培养液制成2×104细胞/ml单细胞悬液。以每孔100μl接种于96孔培养板中。培养24小时后,分别加入100μl以培养液稀释的试验药物。设5个浓度组,每组3孔;对照组加等量培养基,作空白对照。加抗癌药培养48小时后,吸除孔内培养液,换RPMI 1640培养基,200μl每孔,继续培养至接种后第六天,每孔加入20μl 0.5%MTT试剂培养6小时。去除孔内液体,加二甲基亚砜150μl后,用酶标仪(BIO-RAD 45O, USA)测波长490nm的A值。求出半抑制浓度(IC50)并按下式计算耐药倍数。IC50为所测样本吸收值减少至对照组50%时的药物浓度。实验重复3次,取其平均值。
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    结果

    一、Tca8113/V100耐药细胞系建立过程

    Tca8113细胞初次接触VCR10μmol/L后,其透明度下降,细胞轮廓增强,部分细胞体积膨大,胞膜不完整,失去原有形态,可见坏死脱落。去药培养,遗留下的形态较佳的细胞增殖生长,传代培养。提高培养液中VCR的浓度后,再次出现上述改变。逐渐间歇性加药,提高VCR的浓度,直至经64周诱导培养,细胞在含VCR 100μmol/L培养基中稳定生长。

    二、Tca8113/V100细胞的生物学特性(表1)

    表1 Tca8113/V100、Tca8113细胞系生物学特性比较 生物学特性

    Tca8113/V100

    Tca8113
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    细胞形态

    较一致,其间有较大细胞

    均匀一致

    倍增时间(h)

    37.2

    34.6

    裸鼠成瘤

    2/2

    2/2

    病理诊断

    鳞状上皮细胞癌

    鳞状上皮细胞癌

    超微结构
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    微绒毛粗短,融合

    微绒毛细长,单个突起

    mdr-1表达

    明显增强

    微量表达

    镜下观察培养皿中的Tca8113/V100细胞,其形态较一致,可见个别稍大者,细胞倍增时间长于亲代Tca8113细胞。Tca8113/V100与Tca8113细胞裸鼠接种后均呈肿块性生长,局部无浸润,无远处转移,病理诊断为鳞状细胞癌。超微结构观察表明,Tca8113/V100细胞的内质网、核仁较Tca8113增加,微绒毛呈短粗融合状,而后者微绒毛为单个细胞长突起;Tca8113/V100与Tca8113的mdr-1mRNA分别表达为1.5×105 copy/μgRNA和0.3×105 copy/μg 总mRNA(图1)。
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    1 Tca8113 2 Tca8113/V100

    图1 Tca 8113细胞系与Tca 8113/V100细胞系的mdr-1mRNA表达

    三、Tca8113/V100细胞的耐药水平

    Tca8113/V100细胞在含VCR 100μmol/L浓度的培养基中稳定生长60周,对VCR的耐受性为Tca8113细胞的19.2倍;经无VCR培养10周,耐药性稳定,15周后开始下降,20周后其耐受性为亲代的15.4倍。

    四、Tca8113/V100细胞系的交叉耐药性(表2)

    表2 Tca8113/V100的药物敏感性与耐药倍数 药物

    IC50 (μmol/L)
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    耐药倍数

    Tca8113/V100

    Tca8113

    VCR

    0.2492

    0.0130

    19.17

    ADM

    0.2586

    0.0172

    15.03

    PYM

    23.7714
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    2.8643

    8.30

    CDDP

    87.8333

    7.0

    12.53

    MTX

    0.2047

    0.0330

    6.20

    5-Fu

    24.3659

    7.6095
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    3.20

    Tca8113/V100不仅对诱导药物VCR具有耐药性,对其他5种测试药物也具有不同程度的耐受性。

    讨论

    Tca8113/V100细胞的某些生物学特性较亲代细胞发生了改变。但裸鼠体内成瘤及病理检查结果,证实其虽具备了耐多药的特点,但仍保留癌细胞的基本生物学特征。与耐药恶性肿瘤的临床表现相符。

    恶性肿瘤细胞对一种抗癌药物产生耐药性后,对其他结构与作用机理各异的多种抗癌药物亦可产生耐药性,这一特点被称为多药耐受性(multidrug resistance, MDR)[1,7]。Tca8113/V100细胞系经VCR长期诱导后,在VCR 100μmol/L浓度的培养基中稳定生长,其不仅对VCR具有较强的耐受性,而且对ADM、CDOP、PYM、MTX、5-FU等抗癌药物亦有程度不同的耐受性。Tca8113/V100细胞系具备了多药耐药性的特点,可以认为是具有MDR特征的细胞系。Tca8113/V100细胞的mdr-1mRNA水平较亲代细胞明显增高,分析其耐药机理可能为mdr-1基因表达活跃所致。Tca8113/V100细胞超微结构的改变与其耐药性的关系尚待进一步研究。
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    近年来的研究表明,肿瘤细胞多药耐药性的特点系多因素所致,包括mdr-1基因、P-糖蛋白的表达、DNA修复、谷胱甘肽/谷胱甘肽转移酶(GSH/GST)解毒系统及其他酶系统改变等[7~10]。Tca8113/V100交叉耐药性程度不同的特点,提示对一些药物结构进行修饰改变,寻找更敏感的抗癌药及应用逆转耐药性药物等,是解决恶性肿瘤细胞耐药性的重要措施。

    目前,早期口腔癌的疗效尚较满意。但对中、晚期口腔癌的治疗,尤其是提高治愈率与生存率,仍是研究者们努力探索的课题。恶性肿瘤细胞的MDR特点直接影响化疗效果,合理有效地应用化疗有着不可忽视的重要性。因此,应用多药耐药细胞系结合临床深入研究口腔颌面部恶性肿瘤细胞的耐药机理,减少化疗的盲目性,有重要的理论意义和临床指导价值。

    国家自然科学基金资助课题(3920724)

    参考文献
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    [1] Nooter K, Herweijer H. Multidrug resistance (mdr) genes in human cancer. Br J Cancer, 1991, 63:663-669.

    [2] 何荣根,徐秀祺,周晓健,等.人鳞状细胞癌Tca8113细胞系的建立及其生物学特性.肿瘤,1983,3:97-100.

    [3] 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.第1版.北京:北京出版社,1994.155-156.

    [4] 王申五,白桃,张晓红,等.多元药物抗性细胞株mdr-mRNA及P170糖蛋白的分析.中华肿瘤杂志,1993,5:329-331.

    [5] Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, et al. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res, 1987, 47:936-442.
, http://www.100md.com
    [6] 吴军正,司徒镇强,刘斌,等.MTT试验及其在抗癌药筛选中的应用.中华口腔医学杂志,1992,27:373-375.

    [7] Biedler JL. Genetic aspects of multidrug resistance. Cancer, 1992, 70:1799-1809.

    [8] Ling V, Kettering P. P-glycoprotein and resistance to anticancer drugs. Cancer, 1992, 69:2603-2609.

    [9] Goldstein LJ, Galski H, Fojo AT, et al. Expression of multidrug resistance gene in human cancer. J Natl Cancer Inst,1989, 81:116-124.

    [10] Moscow JA, Fairchild CR, Madden MJ, et al. Expression of anionic glutathione-S-transferase and P-glycoprotein genes in human tissues and tumors. Cancer Res, 1989, 49:1422-1428.

    (收稿:1997-12-24 修回:1998-10-20), http://www.100md.com