实验性全厚板层角膜移植术的免疫组织学研究△
作者：陈冬红 袁南荣
单位：225001 江苏省扬州市第一人民医院眼科(陈冬红)；南京医科大学一附院(袁南荣)
关键词：全厚植片；角膜移植；免疫组织学
实验性全厚板层角膜移植术的免疫组织学研究 摘要 目的 对全厚板层角膜移植术后不同时期免疫状态的改变进行观察，以探讨该术式的可行性。方法 将22只受体兔随机分为实验组和对照组，实验组单眼施行全厚板层角膜移植术，对照组单眼施行穿透性角膜移植术，依据不同的实验阶段采取标本，在光镜和电镜下观察，同时应用ABC染色法标记纤维连接蛋白(FN)。结果 采用秩和检验，2组排斥反应积分相比较，实验组小于对照组。FN测定显示对照组术后FN较多，颜色较深，实验组症状反应较轻，持续时间较短。结论 本实验证明全厚板层角膜移植术是一种更为安全可靠的手术方式。
[眼科新进展 1999；19(3)∶169-171]
, http://www.100md.com
Experimental studies on the immunohistology
of full-thickness lamellar keratoplasty
CHEN Dong-Hong,YUAN Nan-Rong
Abstract Objective To observe the immunohistologic changes of the rabbits after full-thickness lamellar keratoplasty in different stages and to discuss the feasibility of full-thickness lamellar keratoplasty.Methods Twenty-two rabbits were devided into two groups randomly:experimental group and control group.One eye of every experimental rabit was performmed full-thickness lamellar keratoplasty and one eye of every control group rabbit was performmed on penetrating keratoplasty.According to the different experiment stages,samples were collected and observed under the optic microscope and the electronic microscope.Meanwhile ABC dying methods were applied to trace the fibronection.Result Rank sum test showed the rejection score of the experimental group is lower than that of the control group. The inflammation of the experimental group is lighter with short persistent time.There were more fibromection of the corneas in the control group with darker colour.Conclusion This experiment showed that full-thickness lamellar keratoplasty is a safe and comfortable surgery.
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Key words full-thickness lamellar;keratoplasty;immunohistology
[Rec Adv Ophthalmol 1999;19(3)∶169-171]
1982年Morrison等[1]首次提出了光学性全厚板层角膜移植的概念，即将全层供体角膜植片直接缝合在仅保留完整后弹力层和内皮细胞层的受眼植床上，以达到较好的增视效果。他认为同穿透性角膜移植相比，此术式具有排斥反应小、并发症少、对供体材料的新鲜度要求不高等优点，本实验试用家兔单眼施行全厚板层角膜移植术，对其术后排斥反应进行动态观察，并与穿透性角膜移植术角膜进行对照，从而探讨该术式的可行性。
1 材料和方法
1.1 动物实验模型的建立
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1.1.1 实验动物 选择2～3kg的健康成年青紫兰兔33只，其中11只为供体，22只为受体，所有实验兔均由南京医科大学动物实验中心提供，将22只受体兔随机分为实验组和对照组。
1.1.2 手术方法及术后处理 (1)实验组：30g.L-1戊巴比妥钠静脉麻醉，局部用10g.L-1丁卡因表面麻醉，剪去上下睑睫毛，冲洗结膜囊，消毒铺无菌巾，开睑器开睑，用直径为6.3mm的角膜环钻在受体眼角膜上垂直钻切，深达2/3角膜厚度，用角膜镊提起3点钟处环切创口，用27G针头斜面向下平行刺入角膜基质中，缓慢注入消毒空气，可见小气泡扩散到角膜基质之间使之变白，膨胀变厚(见图1、2)。用剃须刀板层剖切直到无小气泡的一层即为后弹力层，然后将全厚植片覆盖于植床上，用10-0尼龙线连续缝合[2]。术毕球结膜下注射庆大霉素40×103U加地塞米松2mg，术后氟哌酸眼药水滴术眼，4次.d-1，术后3wk拆除角膜缝线；(2)对照组：手术步骤同常规穿透性角膜移植术、术后处理同实验组。
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Figure 1 The air dissects into the deep stroma,almost above the Descements(HE×100) 角膜注气分离至深层基质，几乎达后弹力层
Figure 2 Air bubbles distend the corneal stroma,enlarging its thickness (HE×200) 气泡分隔在角膜基质层内，使之膨胀变厚
1.2 病理组织学检查 术后第2、3、4、12wk 2组各处死1只典型动物，立即摘取眼球，切取带有1mm角巩膜缘的全层角膜片，置于100g.L-1福尔马林液中固定，石蜡包埋，HE染色光镜下观察。
, 百拇医药
1.3 免疫组化染色标记FN 采用ABC染色，试剂盒购自上海华美生物工程公司。单克隆兔抗人FN标记角膜石蜡切片，常规石蜡切片脱蜡、水化；蒸馏水洗净后用10g.L-1胰蛋白酶消化20min，室温下，缓冲液PBS洗5min，正常与血清浸育5min后弃去，单克隆兔抗人FN 1∶10置温盒37℃孵育60min，缓冲液洗5min。Bio-抗兔IgG l∶100 37℃孵育30min，缓冲液洗5min；甲醇—过氧化氢溶液浸育20min，缓冲液洗5min，ABC复合物(美国Vector公司产品)A∶B=1∶1，1∶100 37℃孵育30min缓冲液洗5min；DAB—H2O液中显色，用缓冲液洗苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透析，树胶封固，在光学显微镜下观察FN的变化[3]。
2 结果
2.1 临床观察 2组术眼均有球结膜充血，分泌物增多等刺激反应，术后1wk出现角膜血管翳，2组角膜植片出现不同程度混浊。3wk拆线后，实验组角膜植片转为透明。6wk后反应消失，对照组眼部刺激反应较重，3mo时角膜有7只转为透明，另4只表现为水肿和新生血管增生，根据Holand[4]的排斥反应记分标准，术后21d免疫排斥反应平均积分实验组是2.72±0.79，对照组是5.09±1.38，采用秩和检验P<0.005，实验组排斥反应明显小于对照组(见表1)。
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表1 2组不同时期排斥反应积分
Table 1 The rejection score of two
groups in different stages
Group
2wk
3wk
4wk
12wk
Ⅰ
2.91±0.83
2.72±0.79
, http://www.100md.com
2.36±0.67
1.91±0.70
Ⅱ
5.36±1.29
5.09±1.38
4.45±1.37
3.64±1.29
Ⅰ=experiment group,Ⅱ=control group
2.2 病理组织学检查
2.2.1 实验组 术后1、2wk时，在供受体分界处及缝线周围，上皮下方和基质层内可见嗜中性粒细胞浸润及小血管增生，术后3wk，上皮下方基质层内浸润细胞成分增多。见多量散在分布的中性粒细胞，边缘见小血管增生，上皮已移行成单层扁平上皮或立方上皮，生长良好。术后4wk炎性细胞很少，血管少，纤维组织增生，胶原化，上皮细胞及内皮细胞均良好，基质层稍增厚。3mo时，角膜似正常角膜。
, 百拇医药
2.2.2 对照组 术后1、2wk时，基质层内见散在性淋巴细胞及小血管增生，纤维组织结构紊乱。术后3wk，基质层内纤维组织增生变性，灶性结构紊乱，可见少量小血管及炎性细胞。术后4wk，上皮下方见多量中性粒细胞增生及增生的小血管，纤维细胞增生。3mo时，角膜结构基本恢复正常。
2.3 免疫组化检查 2wk时2组角膜皆有细胞浸润，FN着色较正常角膜明显，穿透性角膜移植组反应略重，随着细胞浸润加重，FN着色相应加深，而实验组角膜反应较轻，FN着色较浅，FN的排列呈线状与纤维排列一致，同期相比较，实验组角膜FN排列更为整齐(见图3，4)。
Figure 3 The stainess of fibronection of experiment groups cornea was positive and the inflammation was seen in two week(ABC×200)
, 百拇医药
2wk时实验组角膜FN着色阳性，并可见炎症浸润
Figure 4 The stainness of fibronection of control groups cornea is positive and the inflammation is heavier in two weeks(ABC×200)
2wk时对照组角膜FN着色阳性，并可见炎症浸润较重
3 讨论
常规的板层角膜移植术是切除受体表面的角膜基质后应用相应厚度的供体板层取代切除的组织。但是此手术的植片植床表现不光滑。植片厚度与植床深度不相一致，术后植片植床界面的瘢痕形成而影响透明度，基质深层的新生血管无法彻底清除，以致于临床上更多地采用穿透性角膜移植术，近年来，由于显微手术技术的提高，材料保存技术的改进，使穿透性角膜植术的成功率大大提高，但是与板层角膜移植术相比，穿透性角膜移植术对材料的新鲜度要求较高，手术操作难度大，并发症多，而且排斥反应的发生率较高。
, 百拇医药
本研究采用注气法制作植床建立了全厚板层角膜移植模型，并对其术后免疫反应进行动态观察，临床观察证实了全厚板层角膜移植术后的排斥反应大大低于穿透性角膜移植术。全厚板层角膜移植术后角膜由供体的角膜基质、后弹力层内皮层和受体的后弹力层和内皮层组成，术后植片角膜上皮由受体上皮细胞替代，供体的内皮细胞将自行解体吸收，所以全厚板层角膜移植术的植片依赖于受体内皮细胞，可以不考虑内皮细胞的排斥反应问题，抗原性降低使排斥反应的发生率降低，我们的研究也证实了这个结果。
病理组织学检查全厚板层角膜移植术的炎症反应较穿透性角膜移植术轻，持续时间短。全厚板层角膜移植术后1、2wk时主要表现为手术创伤和缝线反应。炎症细胞浸润和新生血管主要发生在供受体交界处及缝线周围，细胞成分主要是嗜中性粒细胞，3wk拆线后炎症反应迅速消退，而穿透性角膜移植术炎症反应出现较急，程度重，持续时间也较长，炎症反应持续3～4wk，随后有组织排斥参与，此时角膜局部FN增多，其来源可能是房水和泪液中的FN进入角膜组织的缘故[3]。FN是一种存在于血浆和细胞表面的高分子糖蛋白，它是细胞与细胞、细胞与基质粘连的重要因子，并对保持组织的正常和生理功能，促进上皮细胞移行，加速损伤的修复，以及机体免疫的调换方向，也起重要作用。FN的改变与角膜创伤和排斥反应的轻重相平行，本研究测定了2组角期移植的FN改变，其结果显示穿透性角膜移植术后FN较多，颜色加深，也从一个侧面反映了全厚板层角膜移植的炎症反应和排斥反应较轻。
, http://www.100md.com
因此，我们认为全厚板层角膜移植术手术全过程均在眼外进行不涉及前房，对受体角膜内皮和眼内组织无损伤，术后炎症反应少，排斥反应发生率较低，是一种很有前途的手术方式，但作为一种新的手术方式，其手术的长期效果尚有待于进一步评价。手术方式也有待于进一步完善。
△ 在中华医学会第2次全国中青年医师学术会议作大会交流，并获“优秀论文三等奖”
作者简介：陈冬红，女，出生于1970年11月，江苏省扬州市人，汉族，硕士，主治医师。1997年毕业于南京医科大学临床医学系，现在江苏省扬州市第一人民医院眼科从事临床工作。联系电话：0514-7233351-3114。
Accepted for publication Apr 6,1998
From the Department of Ophthalmology, First Peoples Hospital of Yangzhou(CHEN Dong-Hong),Yangzhou 225001,Jiangsu Province,P.R.China; Department of Ophthalmology,First Affilated Hospital of Nanjing Medical University(YUAN Nan-Rong),Nanjing 210029,Jiangsu Province,P.R.China
, http://www.100md.com
参考文献
1 Morrison JC,Swan KC.Fullthickness lamellar keratoplasty a histologic study in human eyes.Ophthalmology 1982;89∶715-719.
2 赵东卿，孙乘基，贺 焱.角膜层间注气在全厚板层角膜移植术中的应用.中华眼科杂志 1994；30∶150-151.
3 张泺，沈远平，何宇光.同种和异种角膜板层移植时纤维连接蛋白的变化.眼科新进展 1995；15∶1-3.
4 Holland EJ.The study of clinic and immunohistology in rat model of penetrating keratoplasty.Cornea 1991；10(5)∶374-380.
收稿 1998-04-06 修回 1998-07-16, 百拇医药
单位：225001 江苏省扬州市第一人民医院眼科(陈冬红)；南京医科大学一附院(袁南荣)
关键词：全厚植片；角膜移植；免疫组织学
实验性全厚板层角膜移植术的免疫组织学研究 摘要 目的 对全厚板层角膜移植术后不同时期免疫状态的改变进行观察，以探讨该术式的可行性。方法 将22只受体兔随机分为实验组和对照组，实验组单眼施行全厚板层角膜移植术，对照组单眼施行穿透性角膜移植术，依据不同的实验阶段采取标本，在光镜和电镜下观察，同时应用ABC染色法标记纤维连接蛋白(FN)。结果 采用秩和检验，2组排斥反应积分相比较，实验组小于对照组。FN测定显示对照组术后FN较多，颜色较深，实验组症状反应较轻，持续时间较短。结论 本实验证明全厚板层角膜移植术是一种更为安全可靠的手术方式。
[眼科新进展 1999；19(3)∶169-171]
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Experimental studies on the immunohistology
of full-thickness lamellar keratoplasty
CHEN Dong-Hong,YUAN Nan-Rong
Abstract Objective To observe the immunohistologic changes of the rabbits after full-thickness lamellar keratoplasty in different stages and to discuss the feasibility of full-thickness lamellar keratoplasty.Methods Twenty-two rabbits were devided into two groups randomly:experimental group and control group.One eye of every experimental rabit was performmed full-thickness lamellar keratoplasty and one eye of every control group rabbit was performmed on penetrating keratoplasty.According to the different experiment stages,samples were collected and observed under the optic microscope and the electronic microscope.Meanwhile ABC dying methods were applied to trace the fibronection.Result Rank sum test showed the rejection score of the experimental group is lower than that of the control group. The inflammation of the experimental group is lighter with short persistent time.There were more fibromection of the corneas in the control group with darker colour.Conclusion This experiment showed that full-thickness lamellar keratoplasty is a safe and comfortable surgery.
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Key words full-thickness lamellar;keratoplasty;immunohistology
[Rec Adv Ophthalmol 1999;19(3)∶169-171]
1982年Morrison等[1]首次提出了光学性全厚板层角膜移植的概念，即将全层供体角膜植片直接缝合在仅保留完整后弹力层和内皮细胞层的受眼植床上，以达到较好的增视效果。他认为同穿透性角膜移植相比，此术式具有排斥反应小、并发症少、对供体材料的新鲜度要求不高等优点，本实验试用家兔单眼施行全厚板层角膜移植术，对其术后排斥反应进行动态观察，并与穿透性角膜移植术角膜进行对照，从而探讨该术式的可行性。
1 材料和方法
1.1 动物实验模型的建立
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1.1.1 实验动物 选择2～3kg的健康成年青紫兰兔33只，其中11只为供体，22只为受体，所有实验兔均由南京医科大学动物实验中心提供，将22只受体兔随机分为实验组和对照组。
1.1.2 手术方法及术后处理 (1)实验组：30g.L-1戊巴比妥钠静脉麻醉，局部用10g.L-1丁卡因表面麻醉，剪去上下睑睫毛，冲洗结膜囊，消毒铺无菌巾，开睑器开睑，用直径为6.3mm的角膜环钻在受体眼角膜上垂直钻切，深达2/3角膜厚度，用角膜镊提起3点钟处环切创口，用27G针头斜面向下平行刺入角膜基质中，缓慢注入消毒空气，可见小气泡扩散到角膜基质之间使之变白，膨胀变厚(见图1、2)。用剃须刀板层剖切直到无小气泡的一层即为后弹力层，然后将全厚植片覆盖于植床上，用10-0尼龙线连续缝合[2]。术毕球结膜下注射庆大霉素40×103U加地塞米松2mg，术后氟哌酸眼药水滴术眼，4次.d-1，术后3wk拆除角膜缝线；(2)对照组：手术步骤同常规穿透性角膜移植术、术后处理同实验组。
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Figure 1 The air dissects into the deep stroma,almost above the Descements(HE×100) 角膜注气分离至深层基质，几乎达后弹力层
Figure 2 Air bubbles distend the corneal stroma,enlarging its thickness (HE×200) 气泡分隔在角膜基质层内，使之膨胀变厚
1.2 病理组织学检查 术后第2、3、4、12wk 2组各处死1只典型动物，立即摘取眼球，切取带有1mm角巩膜缘的全层角膜片，置于100g.L-1福尔马林液中固定，石蜡包埋，HE染色光镜下观察。
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1.3 免疫组化染色标记FN 采用ABC染色，试剂盒购自上海华美生物工程公司。单克隆兔抗人FN标记角膜石蜡切片，常规石蜡切片脱蜡、水化；蒸馏水洗净后用10g.L-1胰蛋白酶消化20min，室温下，缓冲液PBS洗5min，正常与血清浸育5min后弃去，单克隆兔抗人FN 1∶10置温盒37℃孵育60min，缓冲液洗5min。Bio-抗兔IgG l∶100 37℃孵育30min，缓冲液洗5min；甲醇—过氧化氢溶液浸育20min，缓冲液洗5min，ABC复合物(美国Vector公司产品)A∶B=1∶1，1∶100 37℃孵育30min缓冲液洗5min；DAB—H2O液中显色，用缓冲液洗苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透析，树胶封固，在光学显微镜下观察FN的变化[3]。
2 结果
2.1 临床观察 2组术眼均有球结膜充血，分泌物增多等刺激反应，术后1wk出现角膜血管翳，2组角膜植片出现不同程度混浊。3wk拆线后，实验组角膜植片转为透明。6wk后反应消失，对照组眼部刺激反应较重，3mo时角膜有7只转为透明，另4只表现为水肿和新生血管增生，根据Holand[4]的排斥反应记分标准，术后21d免疫排斥反应平均积分实验组是2.72±0.79，对照组是5.09±1.38，采用秩和检验P<0.005，实验组排斥反应明显小于对照组(见表1)。
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表1 2组不同时期排斥反应积分
Table 1 The rejection score of two
groups in different stages
Group
2wk
3wk
4wk
12wk
Ⅰ
2.91±0.83
2.72±0.79
, http://www.100md.com
2.36±0.67
1.91±0.70
Ⅱ
5.36±1.29
5.09±1.38
4.45±1.37
3.64±1.29
Ⅰ=experiment group,Ⅱ=control group
2.2 病理组织学检查
2.2.1 实验组 术后1、2wk时，在供受体分界处及缝线周围，上皮下方和基质层内可见嗜中性粒细胞浸润及小血管增生，术后3wk，上皮下方基质层内浸润细胞成分增多。见多量散在分布的中性粒细胞，边缘见小血管增生，上皮已移行成单层扁平上皮或立方上皮，生长良好。术后4wk炎性细胞很少，血管少，纤维组织增生，胶原化，上皮细胞及内皮细胞均良好，基质层稍增厚。3mo时，角膜似正常角膜。
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2.2.2 对照组 术后1、2wk时，基质层内见散在性淋巴细胞及小血管增生，纤维组织结构紊乱。术后3wk，基质层内纤维组织增生变性，灶性结构紊乱，可见少量小血管及炎性细胞。术后4wk，上皮下方见多量中性粒细胞增生及增生的小血管，纤维细胞增生。3mo时，角膜结构基本恢复正常。
2.3 免疫组化检查 2wk时2组角膜皆有细胞浸润，FN着色较正常角膜明显，穿透性角膜移植组反应略重，随着细胞浸润加重，FN着色相应加深，而实验组角膜反应较轻，FN着色较浅，FN的排列呈线状与纤维排列一致，同期相比较，实验组角膜FN排列更为整齐(见图3，4)。
Figure 3 The stainess of fibronection of experiment groups cornea was positive and the inflammation was seen in two week(ABC×200)
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2wk时实验组角膜FN着色阳性，并可见炎症浸润
Figure 4 The stainness of fibronection of control groups cornea is positive and the inflammation is heavier in two weeks(ABC×200)
2wk时对照组角膜FN着色阳性，并可见炎症浸润较重
3 讨论
常规的板层角膜移植术是切除受体表面的角膜基质后应用相应厚度的供体板层取代切除的组织。但是此手术的植片植床表现不光滑。植片厚度与植床深度不相一致，术后植片植床界面的瘢痕形成而影响透明度，基质深层的新生血管无法彻底清除，以致于临床上更多地采用穿透性角膜移植术，近年来，由于显微手术技术的提高，材料保存技术的改进，使穿透性角膜植术的成功率大大提高，但是与板层角膜移植术相比，穿透性角膜移植术对材料的新鲜度要求较高，手术操作难度大，并发症多，而且排斥反应的发生率较高。
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本研究采用注气法制作植床建立了全厚板层角膜移植模型，并对其术后免疫反应进行动态观察，临床观察证实了全厚板层角膜移植术后的排斥反应大大低于穿透性角膜移植术。全厚板层角膜移植术后角膜由供体的角膜基质、后弹力层内皮层和受体的后弹力层和内皮层组成，术后植片角膜上皮由受体上皮细胞替代，供体的内皮细胞将自行解体吸收，所以全厚板层角膜移植术的植片依赖于受体内皮细胞，可以不考虑内皮细胞的排斥反应问题，抗原性降低使排斥反应的发生率降低，我们的研究也证实了这个结果。
病理组织学检查全厚板层角膜移植术的炎症反应较穿透性角膜移植术轻，持续时间短。全厚板层角膜移植术后1、2wk时主要表现为手术创伤和缝线反应。炎症细胞浸润和新生血管主要发生在供受体交界处及缝线周围，细胞成分主要是嗜中性粒细胞，3wk拆线后炎症反应迅速消退，而穿透性角膜移植术炎症反应出现较急，程度重，持续时间也较长，炎症反应持续3～4wk，随后有组织排斥参与，此时角膜局部FN增多，其来源可能是房水和泪液中的FN进入角膜组织的缘故[3]。FN是一种存在于血浆和细胞表面的高分子糖蛋白，它是细胞与细胞、细胞与基质粘连的重要因子，并对保持组织的正常和生理功能，促进上皮细胞移行，加速损伤的修复，以及机体免疫的调换方向，也起重要作用。FN的改变与角膜创伤和排斥反应的轻重相平行，本研究测定了2组角期移植的FN改变，其结果显示穿透性角膜移植术后FN较多，颜色加深，也从一个侧面反映了全厚板层角膜移植的炎症反应和排斥反应较轻。
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因此，我们认为全厚板层角膜移植术手术全过程均在眼外进行不涉及前房，对受体角膜内皮和眼内组织无损伤，术后炎症反应少，排斥反应发生率较低，是一种很有前途的手术方式，但作为一种新的手术方式，其手术的长期效果尚有待于进一步评价。手术方式也有待于进一步完善。
△ 在中华医学会第2次全国中青年医师学术会议作大会交流，并获“优秀论文三等奖”
作者简介：陈冬红，女，出生于1970年11月，江苏省扬州市人，汉族，硕士，主治医师。1997年毕业于南京医科大学临床医学系，现在江苏省扬州市第一人民医院眼科从事临床工作。联系电话：0514-7233351-3114。
Accepted for publication Apr 6,1998
From the Department of Ophthalmology, First Peoples Hospital of Yangzhou(CHEN Dong-Hong),Yangzhou 225001,Jiangsu Province,P.R.China; Department of Ophthalmology,First Affilated Hospital of Nanjing Medical University(YUAN Nan-Rong),Nanjing 210029,Jiangsu Province,P.R.China
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参考文献
1 Morrison JC,Swan KC.Fullthickness lamellar keratoplasty a histologic study in human eyes.Ophthalmology 1982;89∶715-719.
2 赵东卿，孙乘基，贺 焱.角膜层间注气在全厚板层角膜移植术中的应用.中华眼科杂志 1994；30∶150-151.
3 张泺，沈远平，何宇光.同种和异种角膜板层移植时纤维连接蛋白的变化.眼科新进展 1995；15∶1-3.
4 Holland EJ.The study of clinic and immunohistology in rat model of penetrating keratoplasty.Cornea 1991；10(5)∶374-380.
收稿 1998-04-06 修回 1998-07-16, 百拇医药