视网膜神经节细胞体外培养、纯化及生物学特性研究
作者：吴永青 葛坚 邱鹏新 李艳艳 林明楷 郭彦
单位：吴永青 葛坚 李艳艳 林明楷 郭彦(510060广州，中山医科大学中山眼科中心眼科医院)；邱鹏新(药理学教研室)
关键词：视网膜神经节细胞；细胞；培养的；细胞纯化；抗原Thy-1.1；青光眼
中华眼科杂志990309 【摘要】 目的 建立体外视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)培养和纯化模型。方法 出生后1～3天Sprague-Dawley(SD)乳鼠，RGCs在basal medium eagle(BME)培养基中培养，相差显微镜下观察细胞生长规律。羊抗鼠单克隆抗体FITC-Thy-1.1鉴定RGCs，并通过Thy1.1单抗进行RGCs的分离纯化。四唑盐(monotetrazolium,MTT)微量比色法检测细胞活性。结果 较高的细胞接种密度或加入顶盖提取液(tectal extract,Te)均有利于混合培养的RGCs生长存活。MTT检测法显示加Te培养的实验组其吸光度(A)值较对照组增加了3倍；在RGCs培养2天时，按细胞接种密度为1×103个/mm2的培养组较500个/mm2的培养组，有突起的细胞数多3倍以上。RGCs经Thy1.1单抗纯化，其纯化率约达95%。在无神经营养因子的条件下，纯化培养的RGCs于48h后很少存活。而混合培养的RGCs存活时间可持续2或3周。结论 在一定条件下的RGCs能够于体外培养存活，其生长存活能力依赖于靶组织及其它视网膜细胞的营养作用。采用Thy1.1单克隆抗体纯化的方法可获得高纯度的RGCs。体外培养和纯化RGCs是研究青光眼及视网膜疾患发病机制的理想模型。
, 百拇医药
The experimental research of purification and character of cultured retinal ganglion cell WU Yongqing, GE Jian, QIU Pengxin, et al. Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sun University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective To establish a cell line and purification model of retinal ganglion cells (RGCs) in vitro. Method RGCs from Sprague Dawley neonatal rats (postnatal 1-3 days) were cultured in basal medium eagle (BME) basal medium. The growth regularity of RGCs in vitro was observed under phase-contrast microscope. RGCs were purified by Thy 1.1 with FITC antibody and detected under fluorescent microscope and phase-contrast microscope. Results Higher density of retinal cells and tectal extract facilitate cultured RGCs to survive. The purification rate of retinal ganglion cells in the experiment arrived at 95 percent. Conclusion Cytokine and trophic factors from other cells in the retina and tectal extract can promote RGCs to survive, and they can be purified by Thy 1.1 antibody.
, 百拇医药
【Key words】 Cell culture Retinal ganglion cells
视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)具有高度分化的特点，出生后一般不再进行有丝分裂，因而其体外培养只属于原代培养。与其它组织相比，RGCs对培养环境的要求更高，因此要使其存活并维持一段时间，技术难度较大，培养条件也较复杂。青光眼视功能损害的主要原因是RGCs受损，研究RGCs损害的细胞和分子机制在青光眼的研究中具有重要意义。我们改进了以往的实验方法[1]，成功地进行了鼠RGCs的培养和纯化，现将结果报告如下。
材料和方法
一、实验动物
出生1～3天标准实验用Sprague-Dawley(SD)乳鼠，由中山医科大学动物实验中心提供。符合国家医用动物使用标准，标准号为清洁级，检证字95A05(广东省实验动物质量检测合格证号)；医动字第26-001号(广东省医学实验动物管理委员会合格证号)。
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二、视网膜神经节细胞体外培养
1.培养皿的制备：采用直径35mm培养皿或96孔培养板,以0.1mg/ml多聚鸟氨酸(poly-l-ornithine,PO；硼酸缓冲液稀释,美国Sigma公司产品,P-3530)室温包被2h后，用PBS液漂洗3次，再以1μg/ml层粘连蛋白(laminin,LN；PBS液稀释，美国Sigma公司产品,C-6171)包被，37℃过夜备用。
2.取材：出生1～3天SD乳鼠，无菌条件下断头处死，解剖显微镜下分离视网膜，0.125%胰蛋白酶消化，37℃条件下放置20min，1000r/min离心，去除上清液。再以0.25%胰蛋白大豆抑制剂(美国Sigma公司产品，A-2268)中和。再离心，去除上清液。用含镁离子的Kreb液(含1%小牛血清白蛋白)漂洗3次，加培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀。计数后进行培养。
3.RGCs的培养：上述的单细胞悬液根据实验要求按不同的密度置入经PO和LN包被的培养皿或培养板中，BME(美国Gibco公司产品，cat#21010-20)培养基，其中含25μmol/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、0.1mg/ml庆大霉素。置5%CO2培养箱(37℃恒温及饱和湿度)中培养。
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三、RGCs鉴定
在直径35mm的培养皿中培养混合及纯化的RGCs细胞，4h后，去除培养液，4%多聚甲醛固定；再经4h后，用PBS液漂洗3次，每次5min，加羊抗鼠FITC-Thy1.1单克隆抗体(1∶100，PBS液稀释，美国Sigma公司产品，F-2887)，37℃条件下放置30min。PBS液漂洗3次，荧光显微镜下观察。
四、RGCs的纯化及纯度检测
取材方法同上，以羊抗鼠IgG(1∶100，PBS液稀释,华美生物工程制品公司产品，IR-2080)室温包被直径为100mm的细胞培养皿，24h后用培养液漂洗3次，继以羊抗鼠Thy-1.1单克隆抗体(1∶150,PBS液稀释,美国Sigma公司产品，M-7898)室温下包被，2h后再以培养液漂洗3次。
在包被好的培养皿内加入视网膜单细胞悬液及培养液，37℃条件下孵育30min，使视网膜神经节细胞与Thy-1.1单克隆抗体充分结合。去除悬液，用培养液反复漂洗，清除培养皿表面未粘附的细胞，用0.125%胰酶消化，收集粘附的视网膜神经节细胞，计数后进行培养和检测。
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经纯化的RGCs在包被了PO和LN、直径为35mm的培养皿上培养4h后，以4%多聚甲醛固定，4h后以PBS液漂洗3次，加羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体，置37℃下30min，再以PBS液漂洗3次。分别在荧光显微镜和相差显微镜下观察计数。荧光显微镜下的阳性细胞数占同一视野中相差显微镜下细胞总数的百分比即RGCs的纯度。
五、形态学观察
相差显微镜下观察细胞生长规律，视网膜神经节细胞混合培养1天、2天及4天，以每组3个培养皿，每个培养皿中央为中心，取上、中、下3个显微镜拍照视野框(目镜10倍，物镜20倍，框面积单位mm2)，计数每框细胞数(有光晕和突起的细胞)，取均值，进行统计学处理。另每组随机选15个细胞，以图像分析处理系统分析细胞胞体直径及突起长度，结果经统计学处理。
六、体外培养的视网膜神经节细胞存活观察
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1.混合培养的RGCs活性观察：以96孔培养板进行细胞培养，6孔为实验组，另6孔为对照组。培养开始，实验组加入顶盖提取液(tectalextract,Te)，对照组不加。Te的制备是通过取顶盖脑组织，以0.08%胰蛋白酶消化制成顶盖脑细胞悬液，离心取上清液而获得[2]。以4只出生1～3天SD鼠顶盖，制备2.5ml的顶盖提取液。Te加入量为每孔15μl，培养20h后，加入MTT(1.5mg/ml，BME培养液配制)10μl/孔，24h后在酶标仪上测吸光度(A)值。
2.纯化后的RGCs观察：以96孔培养板培养纯化的RGCs，以上述方法加入Te，并于培养后2h、24h及48h的不同时间计数存活细胞。
3.不同接种密度对细胞的作用：将96孔培养皿分成两组，一组按1000个/mm2细胞密度接种，另一组按500个/mm2细胞密度接种，分别于接种后12h、1天、2天和4天计数有突起的细胞。
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七、统计学处理方法
各组间培养的细胞数比较均采用t检验。
结果
一、混合培养的RGCs存活及生长规律
混合培养的RGCs按500个/mm2细胞密度接种，相差显微镜下观察，细胞于培养3或4h开始贴壁，贴壁后细胞有聚集生长的现象，24h细胞伸出粗、细、长、短不等的突起。细胞体呈多边形，胞体中部较暗，光晕明显，大多数细胞质折光强；2天后突起增多，并伸长(图1，2)。培养1周后，胞体折光降低。培养2或3周后存活细胞已很少。
图1 相差显微镜下，混合培养24h的RGCs，细胞为多边形。箭头示其中的单个细胞及其突起 ×100
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图2 相差显微镜下，混合培养2天的RGCs。箭头示其中的单个细胞及其突起 ×100
视网膜细胞于培养1天、2天及4天，经自动图像分析系统处理，得出细胞的胞体直径和突起长度(表1)。
表1 不同培养时间RGCs细胞突起长度及胞体直径(
±s) 培养时间(d)
细胞突起长度(μm)
细胞体直径(μm)
1
14.70±1.60
, 百拇医药 9.27±1.05
2
19.50±9.70*
10.78±0.98*
4
22.20±3.80**
11.18±1.62
*细胞培养2天与1天比较，P<0.01 **细胞培养4天与2天比较，P<0.01 由表1可见细胞培养第2天，RGCs胞体直径增大，突起增长，与培养第1天比较差异有显著性(P<0.01)。至培养第4天，细胞胞体直径不再增大，与第2天比较差异无显著性(P>0.05)；但突起仍增长，与第2天组比较差异仍有显著性(P<0.01)。
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二、RGCs存活生长特性
1.Te对混合培养的RGCs存活生长的影响：MTT微量比色法定量培养24h后(细胞接种密度5000个/mm2)细胞存活的吸光度(A)值，无Te的对照组为0.029±0.006，加Te的实验组为0.089±0.005；可见加Te组比较活跃,吸光度(A)值增加了3倍(P<0.01)。
2.不同接种密度时，有突起生长的细胞数比较(表2)。
表2 SD乳鼠RGCS体外培养不同接种密度的细胞中有突起的细胞数 接种密度
不同培养时间的细胞计数(±s)
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12h
1d
2d
4d
500个/mm2
94.50±
7.05
104.50±
5.50
166.75±
5.40
99.75±
4.26
, 百拇医药
1000个/mm2
192.25±
8.46*
263.00±
8.57*
507.00±
17.10**
235.25±
11.39*
*两种接种密度比较,P<0.05 **两种接种密度比较,P<0.01
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由表2可见细胞接种密度500个/mm2与1×1000个/mm2相比，有突起的细胞数差异有显著性；且在培养第2天，后者高于前者3倍以上。
3.纯化后的RGCs存活生长特性：纯化后的RGCs按500个/mm2接种，培养3h后，相差显微镜下观察细胞已贴壁，形态为多边形，无细胞突起伸出。培养24h后细胞长出突起，且细胞分布稀疏、分散，无聚集生长的现象(图3,4)。48h后很少见到存活的细胞。加入Te后存活的细胞数增多，同一时间内加Te组与不加Te组比较差异有显著性(表3)。
图3 相差显微镜下，纯化培养24h的RGCs，细胞稀疏、分散。箭头示其中的单个细胞及其突起 ×100
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图4 相差显微镜(高倍镜)下，纯化培养24h的RGCs。箭头示其中的单个细胞及细胞突起×400
表3 接种密度为500个/mm2纯化培养的SD乳鼠RGCs细胞计数 组别
不同培养时间的细胞计数(±s)
2h
24h
48h
加Te组
244.00± 7.57
, 百拇医药
95.00± 8.08
29.70±7.61
不加Te组
222.50±19.46*
60.50±13.90**
1.17±0.22**
*不加Te与加Te组比较，P<0.05 **不加Te与加Te组比较，P<0.01 三、RGCs的鉴定
经FITC-Thy-1.1单克隆抗体免疫反应，荧光显微镜下见RGCs呈阳性，表现为细胞膜表面呈黄绿色荧光，形态为多边形，有时可显示有伸出的突起。纯化培养时阳性细胞数较混合培养时为多(图5,6)。
, 百拇医药
图5 混合培养4h的RGCs，经羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体免疫染色，荧光显微镜下表现为细胞膜表面黄绿色荧光着色。箭头示阳性细胞 ×400
图6 纯化培养4h的RGCs，经羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体免疫染色。荧光显微镜下阳性细胞数较混合培养时明显增多。箭头示阳性细胞 ×400
四、RGCs的纯度检测
随机取10个视野，分别于荧光显微镜和相差显微镜下观察计数，并计算出荧光显微镜下阳性细胞数占相差显微镜下细胞总数的百分比，结果为94.7%～96.1%。
讨论
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一、RGCs体外培养的取材
实验动物的年龄直接影响RGCs的培养结果。进行RGCs体外培养的较好取材时机是大鼠胚胎10～20天，不但获得RGCs数量多，且细胞存活能力强；缺点是大鼠的胚胎年龄难以确定,取材较困难，易被色素上皮污染。生后1～3天的乳鼠，其RGCs有丰富的分裂像，视网膜分层尚未完成，RGCs存在于内网状层，内颗粒层已经显示某些细胞的同源性。该期外网状层尚未形成，光镜下无明显的光感受器分化表现，在神经上皮和色素上皮间有明显的裂隙，使视网膜神经上皮容易与色素上皮分离，而不被色素上皮污染。
二、培养条件对RGCs生长存活的影响
通过对体外培养的RGCs形态学观察，发现RGCs生长存活与培养条件有密切关系。首先，视网膜中除神经节细胞外，还含有较多的神经胶质细胞，这些神经胶质细胞的存在对RGCs的生长存活特别重要。神经胶质细胞通过分泌胶质源性生长因子[3]，为RGCs提供了营养支持作用。神经胶质细胞还通过与神经节细胞之间的细胞通道影响RGCs。因此当混合培养时，RGCs体外可存活2周左右，而纯化的RGCs在培养48h就很少见到存活细胞。本组研究还显示，培养至第2天，接种密度为1000个/mm2者有突起的细胞数高出500个/mm2者3倍以上。其原因可能与轴突在生长过程中分泌的调节因子(the axonal glycoprotein-1,TAG-1)对细胞突起的生长具有正性的反馈调节作用有关。
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三、视网膜神经节细胞诱向因子(retinal ganglion neuronotrophic factor,RGNTF)对RGCs的生物学作用
RGCs的发育受靶组织产生的某些特定的神经诱向因子所诱导。视神经的靶组织顶盖中可提纯一种可溶性分子，周明华等[4]对这种可溶性分子进行分离纯化，并经蛋白质鉴定，认为是一种相对分子质量为30×103的蛋白质，命名为RGNTF。我们通过对顶盖组织的处理得到顶盖提取液，并研究其对培养RGCs的作用。实验中我们观察到顶盖提取液能够促进细胞的生长存活。RGNTF可能是其中发挥主要作用的物质。由此可见，顶盖作为RGCs的靶组织，不仅能够诱导RGCs的发育，还能促进RGCs的存活。进一步研究RGNTF对RGCs的具体作用机制及这类因子表达的基因调控，将使我们对青光眼等眼病导致视功能损害的机制及预后有更深入的认识。
四、RGCs的纯化及意义
, 百拇医药
RGCs是视网膜中分化最早的神经元，RGCs经过增殖、分化逐渐发育成熟。Thy-1.1抗原是RGCs的成熟标志，同时又是RGCs的特异性标志[5]。有研究表明，Thy-1.1单克隆抗体能够促进RGCs的生存和再生[6]。与以往的方法相比[7，8]，Thy-1.1单克隆抗体用于RGCs的分离纯化,不但可获得更多的培养细胞，且可得到更高的纯度。
建立RGCs体外培养和纯化模型是研究青光眼及其它视网膜疾病的基础。在此基础上我们还研究了RGCs体外生长的生物学特性及顶盖提取液对RGCs生长存活的作用，发现顶盖提取液中具有促进RGCs生存的活性物质。这将为今后进一步研究RGCs的保护和死亡机制提供重要的理论依据。
本课题受国家自然科学基金(基金编号39770789)、广东省科委重点攻关项目基金(基金编号44)、广东省中医药管理局基金资助(基金编号97233)
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参考文献
1 Alfredo RT, Jeffrey PL, Thoenen H. The survival of chick retinal ganglion cells in response to brain-derived neurotrophic factor depends on their embryonic age. Dev Biol, 1989,136:296-303.
2 周明华，赵丽萍. 中脑顶盖提取液对培养在不同支持物的初生大鼠视网膜神经节细胞生长的影响. 解剖学报, 1990,22:195-199.
3 Xiong WC, Montell C. Defective glia Induce neuronal apoptosis in the repo visual system of drosophila. Neurology, 1995,14: 581-590.
, 百拇医药
4 周明华，黄威权，任峰. 大鼠胚胎视网膜内RGNTF及其受体的免疫组织化学定位.科学通报,1992,37:1220-1222.
5 Barnstable CJ, Drager UC. Thy-1.1 antigen: a ganglion cell special marker in rodent retina. Neuroscience, 1984,4:847-855.
6 Leifer D, Lipton SA, Barnstable CJ. Monoclonal antibody to Thy-1 enhances regeneration of processes by rat retinal ganglion cells in culture. Science,1984,224:303-306.
7 Sarthy PV, Curtis BM, Catterall WA. Retrograde labeling, enrichment, and characterization of retinal ganglion cells from the neonatal rat. J Neurol Sci, 1983,3:2532-2544.
8 Armson PF, Bennett MR. Neonatal retinal ganglion cell cultures of high purity: effect of superior colliculus on their survival. Neurosci Lett, 1983,38:181-186.
(收稿：1998-10-25 修回：1999-02-13), 百拇医药
单位：吴永青 葛坚 李艳艳 林明楷 郭彦(510060广州，中山医科大学中山眼科中心眼科医院)；邱鹏新(药理学教研室)
关键词：视网膜神经节细胞；细胞；培养的；细胞纯化；抗原Thy-1.1；青光眼
中华眼科杂志990309 【摘要】 目的 建立体外视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)培养和纯化模型。方法 出生后1～3天Sprague-Dawley(SD)乳鼠，RGCs在basal medium eagle(BME)培养基中培养，相差显微镜下观察细胞生长规律。羊抗鼠单克隆抗体FITC-Thy-1.1鉴定RGCs，并通过Thy1.1单抗进行RGCs的分离纯化。四唑盐(monotetrazolium,MTT)微量比色法检测细胞活性。结果 较高的细胞接种密度或加入顶盖提取液(tectal extract,Te)均有利于混合培养的RGCs生长存活。MTT检测法显示加Te培养的实验组其吸光度(A)值较对照组增加了3倍；在RGCs培养2天时，按细胞接种密度为1×103个/mm2的培养组较500个/mm2的培养组，有突起的细胞数多3倍以上。RGCs经Thy1.1单抗纯化，其纯化率约达95%。在无神经营养因子的条件下，纯化培养的RGCs于48h后很少存活。而混合培养的RGCs存活时间可持续2或3周。结论 在一定条件下的RGCs能够于体外培养存活，其生长存活能力依赖于靶组织及其它视网膜细胞的营养作用。采用Thy1.1单克隆抗体纯化的方法可获得高纯度的RGCs。体外培养和纯化RGCs是研究青光眼及视网膜疾患发病机制的理想模型。
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The experimental research of purification and character of cultured retinal ganglion cell WU Yongqing, GE Jian, QIU Pengxin, et al. Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sun University of Medical Sciences, Guangzhou 510060
【Abstract】 Objective To establish a cell line and purification model of retinal ganglion cells (RGCs) in vitro. Method RGCs from Sprague Dawley neonatal rats (postnatal 1-3 days) were cultured in basal medium eagle (BME) basal medium. The growth regularity of RGCs in vitro was observed under phase-contrast microscope. RGCs were purified by Thy 1.1 with FITC antibody and detected under fluorescent microscope and phase-contrast microscope. Results Higher density of retinal cells and tectal extract facilitate cultured RGCs to survive. The purification rate of retinal ganglion cells in the experiment arrived at 95 percent. Conclusion Cytokine and trophic factors from other cells in the retina and tectal extract can promote RGCs to survive, and they can be purified by Thy 1.1 antibody.
, 百拇医药
【Key words】 Cell culture Retinal ganglion cells
视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)具有高度分化的特点，出生后一般不再进行有丝分裂，因而其体外培养只属于原代培养。与其它组织相比，RGCs对培养环境的要求更高，因此要使其存活并维持一段时间，技术难度较大，培养条件也较复杂。青光眼视功能损害的主要原因是RGCs受损，研究RGCs损害的细胞和分子机制在青光眼的研究中具有重要意义。我们改进了以往的实验方法[1]，成功地进行了鼠RGCs的培养和纯化，现将结果报告如下。
材料和方法
一、实验动物
出生1～3天标准实验用Sprague-Dawley(SD)乳鼠，由中山医科大学动物实验中心提供。符合国家医用动物使用标准，标准号为清洁级，检证字95A05(广东省实验动物质量检测合格证号)；医动字第26-001号(广东省医学实验动物管理委员会合格证号)。
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二、视网膜神经节细胞体外培养
1.培养皿的制备：采用直径35mm培养皿或96孔培养板,以0.1mg/ml多聚鸟氨酸(poly-l-ornithine,PO；硼酸缓冲液稀释,美国Sigma公司产品,P-3530)室温包被2h后，用PBS液漂洗3次，再以1μg/ml层粘连蛋白(laminin,LN；PBS液稀释，美国Sigma公司产品,C-6171)包被，37℃过夜备用。
2.取材：出生1～3天SD乳鼠，无菌条件下断头处死，解剖显微镜下分离视网膜，0.125%胰蛋白酶消化，37℃条件下放置20min，1000r/min离心，去除上清液。再以0.25%胰蛋白大豆抑制剂(美国Sigma公司产品，A-2268)中和。再离心，去除上清液。用含镁离子的Kreb液(含1%小牛血清白蛋白)漂洗3次，加培养液，用吸管反复吹打，使细胞分散均匀。计数后进行培养。
3.RGCs的培养：上述的单细胞悬液根据实验要求按不同的密度置入经PO和LN包被的培养皿或培养板中，BME(美国Gibco公司产品，cat#21010-20)培养基，其中含25μmol/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、0.1mg/ml庆大霉素。置5%CO2培养箱(37℃恒温及饱和湿度)中培养。
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三、RGCs鉴定
在直径35mm的培养皿中培养混合及纯化的RGCs细胞，4h后，去除培养液，4%多聚甲醛固定；再经4h后，用PBS液漂洗3次，每次5min，加羊抗鼠FITC-Thy1.1单克隆抗体(1∶100，PBS液稀释，美国Sigma公司产品，F-2887)，37℃条件下放置30min。PBS液漂洗3次，荧光显微镜下观察。
四、RGCs的纯化及纯度检测
取材方法同上，以羊抗鼠IgG(1∶100，PBS液稀释,华美生物工程制品公司产品，IR-2080)室温包被直径为100mm的细胞培养皿，24h后用培养液漂洗3次，继以羊抗鼠Thy-1.1单克隆抗体(1∶150,PBS液稀释,美国Sigma公司产品，M-7898)室温下包被，2h后再以培养液漂洗3次。
在包被好的培养皿内加入视网膜单细胞悬液及培养液，37℃条件下孵育30min，使视网膜神经节细胞与Thy-1.1单克隆抗体充分结合。去除悬液，用培养液反复漂洗，清除培养皿表面未粘附的细胞，用0.125%胰酶消化，收集粘附的视网膜神经节细胞，计数后进行培养和检测。
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经纯化的RGCs在包被了PO和LN、直径为35mm的培养皿上培养4h后，以4%多聚甲醛固定，4h后以PBS液漂洗3次，加羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体，置37℃下30min，再以PBS液漂洗3次。分别在荧光显微镜和相差显微镜下观察计数。荧光显微镜下的阳性细胞数占同一视野中相差显微镜下细胞总数的百分比即RGCs的纯度。
五、形态学观察
相差显微镜下观察细胞生长规律，视网膜神经节细胞混合培养1天、2天及4天，以每组3个培养皿，每个培养皿中央为中心，取上、中、下3个显微镜拍照视野框(目镜10倍，物镜20倍，框面积单位mm2)，计数每框细胞数(有光晕和突起的细胞)，取均值，进行统计学处理。另每组随机选15个细胞，以图像分析处理系统分析细胞胞体直径及突起长度，结果经统计学处理。
六、体外培养的视网膜神经节细胞存活观察
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1.混合培养的RGCs活性观察：以96孔培养板进行细胞培养，6孔为实验组，另6孔为对照组。培养开始，实验组加入顶盖提取液(tectalextract,Te)，对照组不加。Te的制备是通过取顶盖脑组织，以0.08%胰蛋白酶消化制成顶盖脑细胞悬液，离心取上清液而获得[2]。以4只出生1～3天SD鼠顶盖，制备2.5ml的顶盖提取液。Te加入量为每孔15μl，培养20h后，加入MTT(1.5mg/ml，BME培养液配制)10μl/孔，24h后在酶标仪上测吸光度(A)值。
2.纯化后的RGCs观察：以96孔培养板培养纯化的RGCs，以上述方法加入Te，并于培养后2h、24h及48h的不同时间计数存活细胞。
3.不同接种密度对细胞的作用：将96孔培养皿分成两组，一组按1000个/mm2细胞密度接种，另一组按500个/mm2细胞密度接种，分别于接种后12h、1天、2天和4天计数有突起的细胞。
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七、统计学处理方法
各组间培养的细胞数比较均采用t检验。
结果
一、混合培养的RGCs存活及生长规律
混合培养的RGCs按500个/mm2细胞密度接种，相差显微镜下观察，细胞于培养3或4h开始贴壁，贴壁后细胞有聚集生长的现象，24h细胞伸出粗、细、长、短不等的突起。细胞体呈多边形，胞体中部较暗，光晕明显，大多数细胞质折光强；2天后突起增多，并伸长(图1，2)。培养1周后，胞体折光降低。培养2或3周后存活细胞已很少。
图1 相差显微镜下，混合培养24h的RGCs，细胞为多边形。箭头示其中的单个细胞及其突起 ×100
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图2 相差显微镜下，混合培养2天的RGCs。箭头示其中的单个细胞及其突起 ×100
视网膜细胞于培养1天、2天及4天，经自动图像分析系统处理，得出细胞的胞体直径和突起长度(表1)。
表1 不同培养时间RGCs细胞突起长度及胞体直径(
±s) 培养时间(d)细胞突起长度(μm)
细胞体直径(μm)
1
14.70±1.60
, 百拇医药 9.27±1.05
2
19.50±9.70*
10.78±0.98*
4
22.20±3.80**
11.18±1.62
*细胞培养2天与1天比较，P<0.01 **细胞培养4天与2天比较，P<0.01 由表1可见细胞培养第2天，RGCs胞体直径增大，突起增长，与培养第1天比较差异有显著性(P<0.01)。至培养第4天，细胞胞体直径不再增大，与第2天比较差异无显著性(P>0.05)；但突起仍增长，与第2天组比较差异仍有显著性(P<0.01)。
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二、RGCs存活生长特性
1.Te对混合培养的RGCs存活生长的影响：MTT微量比色法定量培养24h后(细胞接种密度5000个/mm2)细胞存活的吸光度(A)值，无Te的对照组为0.029±0.006，加Te的实验组为0.089±0.005；可见加Te组比较活跃,吸光度(A)值增加了3倍(P<0.01)。
2.不同接种密度时，有突起生长的细胞数比较(表2)。
表2 SD乳鼠RGCS体外培养不同接种密度的细胞中有突起的细胞数 接种密度
不同培养时间的细胞计数(
±s), 百拇医药
12h
1d
2d
4d
500个/mm2
94.50±
7.05
104.50±
5.50
166.75±
5.40
99.75±
4.26
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1000个/mm2
192.25±
8.46*
263.00±
8.57*
507.00±
17.10**
235.25±
11.39*
*两种接种密度比较,P<0.05 **两种接种密度比较,P<0.01
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由表2可见细胞接种密度500个/mm2与1×1000个/mm2相比，有突起的细胞数差异有显著性；且在培养第2天，后者高于前者3倍以上。
3.纯化后的RGCs存活生长特性：纯化后的RGCs按500个/mm2接种，培养3h后，相差显微镜下观察细胞已贴壁，形态为多边形，无细胞突起伸出。培养24h后细胞长出突起，且细胞分布稀疏、分散，无聚集生长的现象(图3,4)。48h后很少见到存活的细胞。加入Te后存活的细胞数增多，同一时间内加Te组与不加Te组比较差异有显著性(表3)。
图3 相差显微镜下，纯化培养24h的RGCs，细胞稀疏、分散。箭头示其中的单个细胞及其突起 ×100
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图4 相差显微镜(高倍镜)下，纯化培养24h的RGCs。箭头示其中的单个细胞及细胞突起×400
表3 接种密度为500个/mm2纯化培养的SD乳鼠RGCs细胞计数 组别
不同培养时间的细胞计数(
±s)2h
24h
48h
加Te组
244.00± 7.57
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95.00± 8.08
29.70±7.61
不加Te组
222.50±19.46*
60.50±13.90**
1.17±0.22**
*不加Te与加Te组比较，P<0.05 **不加Te与加Te组比较，P<0.01 三、RGCs的鉴定
经FITC-Thy-1.1单克隆抗体免疫反应，荧光显微镜下见RGCs呈阳性，表现为细胞膜表面呈黄绿色荧光，形态为多边形，有时可显示有伸出的突起。纯化培养时阳性细胞数较混合培养时为多(图5,6)。
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图5 混合培养4h的RGCs，经羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体免疫染色，荧光显微镜下表现为细胞膜表面黄绿色荧光着色。箭头示阳性细胞 ×400
图6 纯化培养4h的RGCs，经羊抗鼠FITC-Thy-1.1单克隆抗体免疫染色。荧光显微镜下阳性细胞数较混合培养时明显增多。箭头示阳性细胞 ×400
四、RGCs的纯度检测
随机取10个视野，分别于荧光显微镜和相差显微镜下观察计数，并计算出荧光显微镜下阳性细胞数占相差显微镜下细胞总数的百分比，结果为94.7%～96.1%。
讨论
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一、RGCs体外培养的取材
实验动物的年龄直接影响RGCs的培养结果。进行RGCs体外培养的较好取材时机是大鼠胚胎10～20天，不但获得RGCs数量多，且细胞存活能力强；缺点是大鼠的胚胎年龄难以确定,取材较困难，易被色素上皮污染。生后1～3天的乳鼠，其RGCs有丰富的分裂像，视网膜分层尚未完成，RGCs存在于内网状层，内颗粒层已经显示某些细胞的同源性。该期外网状层尚未形成，光镜下无明显的光感受器分化表现，在神经上皮和色素上皮间有明显的裂隙，使视网膜神经上皮容易与色素上皮分离，而不被色素上皮污染。
二、培养条件对RGCs生长存活的影响
通过对体外培养的RGCs形态学观察，发现RGCs生长存活与培养条件有密切关系。首先，视网膜中除神经节细胞外，还含有较多的神经胶质细胞，这些神经胶质细胞的存在对RGCs的生长存活特别重要。神经胶质细胞通过分泌胶质源性生长因子[3]，为RGCs提供了营养支持作用。神经胶质细胞还通过与神经节细胞之间的细胞通道影响RGCs。因此当混合培养时，RGCs体外可存活2周左右，而纯化的RGCs在培养48h就很少见到存活细胞。本组研究还显示，培养至第2天，接种密度为1000个/mm2者有突起的细胞数高出500个/mm2者3倍以上。其原因可能与轴突在生长过程中分泌的调节因子(the axonal glycoprotein-1,TAG-1)对细胞突起的生长具有正性的反馈调节作用有关。
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三、视网膜神经节细胞诱向因子(retinal ganglion neuronotrophic factor,RGNTF)对RGCs的生物学作用
RGCs的发育受靶组织产生的某些特定的神经诱向因子所诱导。视神经的靶组织顶盖中可提纯一种可溶性分子，周明华等[4]对这种可溶性分子进行分离纯化，并经蛋白质鉴定，认为是一种相对分子质量为30×103的蛋白质，命名为RGNTF。我们通过对顶盖组织的处理得到顶盖提取液，并研究其对培养RGCs的作用。实验中我们观察到顶盖提取液能够促进细胞的生长存活。RGNTF可能是其中发挥主要作用的物质。由此可见，顶盖作为RGCs的靶组织，不仅能够诱导RGCs的发育，还能促进RGCs的存活。进一步研究RGNTF对RGCs的具体作用机制及这类因子表达的基因调控，将使我们对青光眼等眼病导致视功能损害的机制及预后有更深入的认识。
四、RGCs的纯化及意义
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RGCs是视网膜中分化最早的神经元，RGCs经过增殖、分化逐渐发育成熟。Thy-1.1抗原是RGCs的成熟标志，同时又是RGCs的特异性标志[5]。有研究表明，Thy-1.1单克隆抗体能够促进RGCs的生存和再生[6]。与以往的方法相比[7，8]，Thy-1.1单克隆抗体用于RGCs的分离纯化,不但可获得更多的培养细胞，且可得到更高的纯度。
建立RGCs体外培养和纯化模型是研究青光眼及其它视网膜疾病的基础。在此基础上我们还研究了RGCs体外生长的生物学特性及顶盖提取液对RGCs生长存活的作用，发现顶盖提取液中具有促进RGCs生存的活性物质。这将为今后进一步研究RGCs的保护和死亡机制提供重要的理论依据。
本课题受国家自然科学基金(基金编号39770789)、广东省科委重点攻关项目基金(基金编号44)、广东省中医药管理局基金资助(基金编号97233)
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参考文献
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3 Xiong WC, Montell C. Defective glia Induce neuronal apoptosis in the repo visual system of drosophila. Neurology, 1995,14: 581-590.
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4 周明华，黄威权，任峰. 大鼠胚胎视网膜内RGNTF及其受体的免疫组织化学定位.科学通报,1992,37:1220-1222.
5 Barnstable CJ, Drager UC. Thy-1.1 antigen: a ganglion cell special marker in rodent retina. Neuroscience, 1984,4:847-855.
6 Leifer D, Lipton SA, Barnstable CJ. Monoclonal antibody to Thy-1 enhances regeneration of processes by rat retinal ganglion cells in culture. Science,1984,224:303-306.
7 Sarthy PV, Curtis BM, Catterall WA. Retrograde labeling, enrichment, and characterization of retinal ganglion cells from the neonatal rat. J Neurol Sci, 1983,3:2532-2544.
8 Armson PF, Bennett MR. Neonatal retinal ganglion cell cultures of high purity: effect of superior colliculus on their survival. Neurosci Lett, 1983,38:181-186.
(收稿：1998-10-25 修回：1999-02-13), 百拇医药