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编号:10245235
眼部鳞状细胞癌p53基因突变的研究
http://www.100md.com 《中华眼科杂志》 1999年第3期
     作者:牛膺筠 严瑛 纪建中 罗兵

    单位:牛膺筠 严瑛 纪建中(266003青岛大学医学院附属医院眼科);罗兵(青岛大学医学院微生物教研室)

    关键词:聚合酶链反应;多态性;限制性片段长度;p53基因;眼部鳞状细胞癌

    中华眼科杂志990317 【摘要】 目的 探讨眼部鳞状细胞癌发生的分子生物学机制。方法 采用聚合酶链反应――限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms,PCR-RFLP)方法,对63例患者的送检标本(包括36例浸润性鳞状细胞癌,7例原位癌,20例乳头状瘤)中p53基因248位点的突变进行检测。结果 22.2%(8/36)的浸润性鳞状细胞癌及14.3%(1/7)的原位癌中有p53基因248位点的突变,而在乳头状瘤中则未检测到,差异有显著性(P=0.021)。70岁以上的患者中未发现p53基因的突变,70岁以下突变率为33.3%,差异有显著性(P=0.024)。p53基因突变与眼部鳞状细胞癌临床病理特征无关(P>0.05)。结论 p53基因突变在眼部鳞状细胞癌的发生早期起一定作用,与临床病理特征无关。在70岁以上的老年患者中p53基因突变不是肿瘤发生的主要原因。
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    A study of p53 gene mutations in squamous cell carcinoma in eyes NIU Yingjun, YAN Ying, JI Jianzhong, et al. Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital, Qingdao Medical College, Qingdao 266003

    【Abstract】 Objective To inquire into the molecular biological mechanisms of the occurrence of squamous cell carcinoma in eyes. Methods Using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method, we detected 63 samples taken from 63 cases (including 36 invasive squamous carcinoma, 7 carcinoma in situ, 20 papillomas) for 248 point mutations in p53 gene. Results 22.2% (8/36) squamous cell carcinomas, 14.3% (1/7) carcinomas in situ were shown to contain the point mutation in codon 248 of p53 gene exon 7 and no point mutation was found in papillomas, the difference being significant (P=0.021). No point mutation was in patients over 70, while in patients younger than 70, the mutation rate was 33.3%, the difference being significant (P=0.24). No significant correlation was found between p53 gene mutations and clinical pathological manifestations (P>0.05). Conclusions p53 gene mutations play roles in the early stage of the development of squamous cell carcinomas, and there is no correlation between p53 gene mutations and clinical manifestations. The mutation in p53 gene is not the main cause of neoplasms in the elder persons after the seventh decade of life.
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    【Key words】 Polymerase chain reaction Polymorphism, restriction fragment length p53 gene Squamous cell carcinomas in eyes

    肿瘤的发生是多种因素共同作用的结果。目前在人类肿瘤中已发现许多癌基因的激活表达,并克隆鉴定出许多抑癌基因。其中p53肿瘤抑制基因在人类肿瘤中的频发失活令人瞩目。p53基因突变是导致p53蛋白功能失活最常见的机制。目前,在人体许多部位的鳞状细胞癌中已检测到野生型p53基因的突变。而p53基因突变在眼部鳞状细胞癌发生中的作用目前尚不明了。为此我们采用多聚酶链反应――限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms,PCR-RFLP)方法,对眼部鳞状细胞癌p53基因的点突变进行检测,以期探讨p53基因点突变在眼部鳞状细胞癌发生中的作用。
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    材料与方法

    一、标本收集

    选择本院眼科病理室1981~1997年间石蜡包埋的送检标本63例。其中包括36例浸润性鳞状细胞癌(简称浸润性鳞癌,指癌病变已突破上皮层基底膜),7例角膜、结膜原位癌(指病变未突破上皮层基底膜),20例乳头状瘤(细胞呈乳头状增生,未见癌细胞)。上述组织标本均经病理证实。

    二、仪器、材料和试剂

    1.仪器:DNA扩增仪4800型(美国PE公司产品),微量移液器(法国Gilson公司产品)。

    2.试剂:采用美国Promega公司生产的PCR反应体系[Taq DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP总称)、10×buffer反应液、氯化镁MgCl2],限制性核酸内切酶MSPⅠ,酶切缓冲液,Mark100bp ladder,蛋白酶K。琼脂糖(德国宝灵曼公司产品),p53基因第7外显子引物(美国CyberSyn公司合成)。
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    三、DNA抽提

    石蜡标本切成10μm厚的蜡屑5~10片,置于1.5ml离心管中。切片时注意清洁切片刀,防止标本间DNA污染。经二甲苯脱蜡,无水乙醇洗涤,乙醇梯度水化。蛋白酶K裂解液(10mmol/LTris Ph8,5mmol/L EDTA,300μg/ml蛋白酶K,0.5%SDS)50~100μl消化,过夜。常规行酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提。取上层水相于干净离心管中,加入1/10体积(约1滴)3mol/L冰醋酸钠(NaAc)及2倍体积预冷无水乙醇,沉淀DNA。-20℃过夜。沉淀物于室温下干燥,加入30μl去离子水,溶解DNA沉淀,4℃贮存,备用。

    四、p53基因PCR扩增及限制性酶切

    1.p53基因第7外显子引物序列[1]

    Primer1:5’-CCC AAG GCG CAC TGA CCT CA-3’(20bp)
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    Primer2:5’-GCT CCT GAC CTG GAG TCT TC-3’(20bp)

    扩增片段长164bp。野生型p53基因第7外显子248位点为限制性核酸内切酶MSPⅠ的酶切位点(CCGG-MSPⅠ酶切位点)。PCR产物经此酶酶切后电泳,在琼脂糖凝胶上可观察到113bp和51bp两条核酸电泳条带。若相应酶切位点的核苷酸出现变化,则不能被酶切,只能观察到总长度为164bp核酸对的电泳带,即为突变型p53(图1,2)。220-1.gif (1711 bytes)

    图1 p53基因PCR扩增产物及酶切示意220-2.gif (3711 bytes)
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    1示100bpmark ladder(其中最亮的条带长度为500bp) 2,4分别示标本1(含野生型p53基因)标本2(含突变型p53基因)中p53基因第7外显子扩增产物的电泳条带(164bp)3示标本1p53基因第7外显子扩增产物MSPⅠ酶切后的电泳条带(113bp+51bp) 5示标本2 p53基因第7外显子扩增产物MSPⅠ酶切后的电泳条带(164 bp) 6示标本3中p53基因第7外显子扩增产物的电泳条带(164bp)

    图2 p53基因第7外显子扩增及MSPⅠ酶切产物电泳

    2.扩增条件:反应总体积30μl。反应体系包括:10×buffer反应液3μl,dNTP终浓度1.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1U,引物终浓度0.6μmol/L,模板8μl,加入去离子水至终体积30μl。混匀后离心,加无菌石蜡油覆盖液面。置DNA扩增仪。反应条件:94℃变性45s,55℃复性45s,72℃延伸1min,共35个循环数。最后72℃延伸5min。PCR产物用氯仿抽提一次备用。
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    3.酶切条件:取PCR产物18μl,加入限制性内切酶MSPⅠ酶3U,37℃水浴1.5h。分别取PCR产物及酶切产物各10μl,以100bpmarkladder作为扩增片段长度标准,于含溴化乙锭(0.5μ?/ml)的2.5%琼脂糖凝胶电泳80V1h。由紫外光透射仪观察结果并摄像。

    五、统计学分析

    本文数据采用四格表精确概率法进行统计学处理,P≤0.05为差异有显著性。

    结果

    一、p53基因248位点的突变检测

    1.眼部鳞状细胞癌p53基因第7外显子MSPⅠ酶切位点突变率:63例组织标本p53基因第7外显子全长序列PCR扩增均获成功。36例浸润性鳞癌患者组织标本PCR产物经MSPⅠ酶切后,8例未被切开,为突变型,突变率为22.2%;7例原位癌患者中,1例为突变型,突变率为14.3%;20例乳头状瘤均为野生型,突变率为0%。
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    2.p53基因突变与性别的关系:36例浸润性鳞癌患者中,男22例,突变型5例;女14例,突变型3例。突变率分别为22.7%和21.4%。经统计学分析,p53基因突变与性别无关(P>0.05)。

    二、年龄与p53基因248位点突变的关系(表1)

    表1 36例患者年龄与p53基因248位点突变的关系 年龄(岁)

    例数

    突变

    未突变

    阳性率(%)

    P值

    ≥70

    12
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    0

    12

    0.0

    0.024

    <70

    24

    8

    16

    33.3

    合计

    36

    8

    28

    22.2
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    经统计学分析,70岁以上的患者中p53基因突变率低于70岁以下者(P<0.05)。

    三、肿瘤恶性程度及细胞分化程度与p53基因248位点突变的关系(表2)

    表2 63例患者肿瘤恶性程度及细胞分化程度与p53基因248位点突变的关系 分化程度

    例数

    突变

    未突变

    阳性率(%)

    P*

    原位癌

    7
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    1

    6

    14.3

    浸润性鳞癌

    36

    8

    28

    22.2

    高分化

    13

    3

    10

    23.1

, 百拇医药     中分化

    18

    4

    14

    22.2

    <0.05

    低分化

    5

    1

    4

    20.0

    乳头状瘤

    20

    0
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    20

    0.0

    合计

    63

    9

    54

    14.3

    *系浸润性鳞癌与乳头状瘤比较 经统计学分析,浸润性鳞癌p53基因248位点的突变率高于乳头状瘤(P=0.021)。36例浸润性鳞癌与7例原位癌共43例,突变型9例,突变率为20.9%,经统计学分析,其突变率明显高于乳头状瘤(P=0.024)。而p53基因248位点的突变与浸润性鳞癌细胞分化程度无关(P>0.05)。

    四、肿瘤复发与p53基因248位点突变的关系(表3)
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    表3 36例患者肿瘤复发与p53基因248位点突变的关系 肿瘤

    例数

    突变

    未突变

    阳性率(%)

    P值

    原发

    26

    6

    20

    23.1

    >0.05

    复发
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    10

    2

    8

    20.0

    合计

    36

    8

    28

    22.2

    经统计学分析,肿瘤复发与p53基因248位点的突变无关(P>0.05)。

    五、肿瘤生长部位与p53基因248位点突变的关系

    36例浸润性鳞癌中,肿瘤位于眼睑19例,角、结膜15例,突变率分别为26.3%和13.3%,另有2例位于眶内(1例见角结膜原发病灶,另1例为额窦、筛窦肿瘤切除术后,以眶内肿瘤转入眼科),其中1例为突变型(角结膜见原发病灶者)。经统计学分析,突变型与肿瘤生长部位无关(P>0.05)。
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    讨论

    一、p53基因及其突变的特点

    p53肿瘤抑制基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,是当前肿瘤分子生物学研究的热点。自1979年Lane等[2]发现p53基因以来,人们对它的认识经历了肿瘤抗原、癌基因、抑癌基因3个阶段。近年的研究已证明,野生型p53基因是一种抑癌基因,对细胞的生长、分化、增殖起调控作用。p53基因突变已被证实是许多肿瘤发病的动因,其异常的检测对人类恶性肿瘤的诊断和治疗具有一定的参考意义。人类p53基因定位于17P13.1,全长约20000碱基对,由11个外显子和10个内含子组成。第1外显子无编码功能,其余10个外显子编码相对分子质量为52581.3u的核磷蛋白。关于p53蛋白生物活性机制的研究表明,野生型p53蛋白参与基因转录、DNA合成和修复及监视基因组的完整性和细胞的程序性死亡[3-6]。p53蛋白功能失活的主要方式是基因突变。早期的研究注意到多数p53基因的突变主要发生在进化过程中高度保守的区域,即外显子5~8(126~306密码子)。Levine等[7]总结以往的研究,发现p53基因突变有下列特点:(1)多数为错义突变,以致产生变异蛋白。(2)突变的选择并不是随机分布,多数集中在130~290号氨基酸,尤其4个高度保守区(117~142、171~181、234~258及270~286号氨基酸)。(3)至少存在3个突变热点(175、248和273号氨基酸)。
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    二、p53基因248位点的突变与眼部鳞状细胞癌发生的关系

    本研究采用PCR-RFLP方法对63例送检组织中p53基因第7外显子248位点进行检测。结果显示,p53基因突变在眼部恶性肿瘤中有较高的发生率,而良性乳头状瘤中则未见(P<0.05),表明p53基因突变在眼部鳞状细胞癌的发生中起重要作用,248位点的突变是p53基因突变的一个热点。研究结果显示,p53基因第7外显子248位点的突变与眼部鳞状细胞癌的临床病理特征(包括性别、年龄、肿瘤的分化程度及肿瘤的复发)无关,且浸润性鳞癌与原位癌之间突变率无明显差异,表明p53基因突变在眼部鳞状细胞癌发生的早期起作用,与肿瘤的进展无关。因此,许多国外学者在研究肺癌、头颈部癌及皮肤癌中的p53基因突变,也得出相似的结论[8-10]。目前的研究表明,p53基因突变的位点和类型可因不同地理位置、不同人类肿瘤存在差异,这些差异可能是由于不同组织生物学特性的差异或暴露于某种类型的致癌物引起。如肺癌p53基因的G∶C→T∶A置换与烟草中的苯并芘有关[11]。在我国启东及南非等肝癌高发区,由于饮食中黄曲霉素B1的污染,这些地区患者肝癌组织中p53基因表现为第249密码子(G∶C→T∶A)的点突变位点[12]。人类皮肤鳞状细胞癌中,存在p53基因双嘌呤CC向TT转变,提示可能与这类人群长期接受紫外线照射有关[13]。248位密码子的碱基置换在人体多种肿瘤中均有发现。其中,该位点G→A的转换,多为CPG三核苷酸位点自发突变的结果;而G→T的置换,则与环境中诱变剂的作用相关。体外实验证明:3,4-苯并芘和黄曲霉素B1处理p53cDNA,碱基置换多为G→T,且前者对248密码,后者对249密码有特异的亲和性[14]。因此,不同肿瘤组织中p53基因突变的位点和类型,可为肿瘤的病因学和发病机制提供线索。本研究中,248位密码子的突变是眼部鳞状细胞癌p53基因突变的热点,是否与患者接触了烟草中的苯并芘或是长期接受紫外线照射有关,可进一步测定DNA序列,观察其突变类型,从分子机制上揭示眼部鳞状细胞癌的发生机制。
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    综上所述,p53基因第7外显子248位点的突变在眼部浸润性鳞癌的发生中起一定作用,248位点是p53基因突变的一个热点。在70岁以上的老年患者中,p53基因突变不是眼部鳞状细胞癌发生的主要原因,其肿瘤发生可能与该年龄段患者对肿瘤的易感性增高有关。

    参考文献

    1 罗元辉,房殿春,鲁荣,等.采用PCR-RFLP技术分析石蜡包埋胃癌组织ras和p53基因点突变.肿瘤防治研究,1995,10:116-121.

    2 Lane DP,Crawford LV. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells.Nature,1979,278:261-263.

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    11 de Fromental CC, Soussi T. Tp53 tumor suppressor gene: a model for investigating human mutagenesis. Gen Chrom Cancer,1992,4:1-15.

    12 Hsu IC, Metcalf RA, Sun T, et al. Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinomas. Nature,1990,350:427-428.
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    13 Brash DE, Ruldolph JA, Simon JA, et al. A role for sunlight in skin cancer, UV-induced p53 mutations in squamous cell carcinoma.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:10124-10128.

    14 Puisieux M, Lim S, Groopman J, et al. Selective targeting of p53 gene mutational hotspots in human cancers by etiologically defined carcinogens. Cancer Res,1991,51:6185-6189.

    (收稿:1998-08-18 修回:1999-02-06), 百拇医药