当前位置: 首页 > 期刊 > 《肿瘤》 > 1999年第3期
编号:10246150
一种新的PCR产物克隆方法——DI/TRISEC
http://www.100md.com 《肿瘤》 1999年第3期
     作者:任功一* 赵新泰 万大方 顾健人**

    单位:上海市肿瘤研究所,癌基因及相关基因国家重点实验室(上海200032)

    关键词:PCR;DI/TRISEC

    肿瘤990322 目的 PCR产物的克隆。 方法 通过DI/TRISEC法克隆PCR产物。 结果 PCR产物被高效定向地克隆。 结论 DI/TRISEC是一种方便和高效的PCR产物克隆方法。

    A NEW PCR CLONING METHOD——DI/TRISEC

    Ren Gongyi,Zhao Xintai,Wan Dafang,et al.National Laboratory for Oncogenes and Related Genes,Shanghai Cancer Institute,Shanghai 200032
, http://www.100md.com
    Objective:A new method of PCR product cloning is developed.Methods:DI/TRISEC.Results:PCR products was efficiently and directionally cloned into plasmid.Conclusion:DI/TRISEC is an efficient and convenient method for PCR product cloning.

    Key words PCR Di- and tri-nucleotide sticky end cloning(DI/TRISEC)

    PCR在分子生物学中应用非常广泛。绝大多数情况下,PCR后只需要看一下有无产物和产物大小,有时却需要对产物进行克隆:如实验室中没有建立PCR产物直接测序的方法;希望永久保留PCR产物;需要对其进行表达等。最直接的方法是平端连接,但是其效率较低[1]。如果在引物两端增加核苷酸以产生酶切位点,则产物内部不能含有该位点。此外有些酶靠近线性分子末端时作用受到限制,多增加的核苷酸还可能增加PCR反应的非特异性[2]。利用Taq 酶往往在PCR产物末端多加一个A的特性进行TA连接,但不能做到定向克隆。而且由于是单核苷酸粘性末端,连接反应效率不高[3],不依赖连接酶的尿苷DNA糖苷酶克隆法需要在引物5’端多增加10多个核苷酸,这无疑增加了费用。
, 百拇医药
    这里作者介绍一种的PCR产物克隆方法-DI/TRISEC (Di and Tri-nucleotide Sticky End Cloning),能够方便、高效定向地克隆PCR产物。引物5’端分别多合成三和四个核苷酸,而PCR产物则利用T4 DNA多聚酶的3’→5’外切酶活性形成有两和三个核苷酸的粘性末端。与经双酶切后Klenow酶部分补平的载体进行连接,即可得到许多含定向插入载体的PCR产物的转化子。

    材料与方法

    材料 Taq、10×PCR缓冲液、dNTP购自生工公司。引物由中科院植生所合成,5’端分别多合成GCAT与TTA(5’→3’)。32-1:5’GCTAgaaccacctgccttctgtt3’;T3:5’TTAaattaaccctcactaaaggg。PCR产物纯化试剂盒购自QIAGEN公司。dTTP购自UBS公司。T4 DNA 多聚酶购自GIBCO公司。EcoRI、HindIII购自Boehringer 公司。dATP、Klenow酶为Amersham公司产品。T4 DNA连接酶与连接反应缓冲液购自Promega公司。
, 百拇医药
    连接用PCR片段的制备 人正常肝λZAPⅡ库液扩,制备噬菌体DNA,取1 ng作为模板。PCR按常规进行,50 μl体系中加入1/10体积DMSO。94℃变性3 min。94°、60°、72℃各1 min,30个循环。最后72℃延伸10 min。产物用硅膜柱纯化。取约200 ng DNA,加入3 μl 1 mg/ml BSA,0.1 μl 5 mM dTTP,5个单位T4 DNA多聚酶,再加水补至35 μl。12℃作用30 min。80℃ 15 min灭活多聚酶。乙醇沉淀,溶于16.5 μl水。

    连接用载体的制备 取1 μg pBluescript SK(+)质粒,加入5 U HindⅢ作用2 h。用0.5 mol/L NaCl调整盐浓度,加入10 U EcoRI作用2 h。加入2 U Klenow酶和1 μl 2 mmol/L dATP室温下作用15 min。酚抽后乙醇沉淀,溶于20 μl水。

    连接反应与转化 取0.5 μl制备载体,加入3.5 μl(约35 ng)制备PCR片段,0.5 μl 10×连接缓冲液,1.5 U T4 DNA连接酶,12℃过夜。转化DH10B感受态细胞(转化效率为1×107/μg),取100 μl涂布于X-gal板。16 h后计斑点数。随机挑取10个独立的白斑于LB培养,抽提质粒。HindⅢ酶切,电泳。
, 百拇医药
    结果与讨论

    按图1所示流程进行DI/TRISEC法克隆PCR产物。PCR产物中含有未知基因32的片段。该基因位于17p13.3,候选肿瘤抑制基因所在位置。目前仅得到其EST,本文中用cDNA文库进行单向PCR可能有助于得到基因全长,以便更深入的研究。转化后共得到93个白斑,1个蓝斑。随机挑选的10个白斑中均有插入子存在(图2)。用同等量PCR产物TA连接出现11个蓝斑,8个白斑。可见该法较之TA法效率高。由于模板是正常肝库,产物大小的差异可能是由于不同的转录子或反应的非特异性。

    图1 DI/TRISEC流程图

    如果引物5’端增加的核苷酸相同,载体只需单酶切,但是克隆方向不定。

    DI/TRISEC 方法通过在引物5’端多加两个和三个核苷酸,利用Klenow酶的部分补平和T4 DNA多聚酶的3’→5’外切酶活性形成两个和三个核苷酸的粘性末端,可以定向高效地把插入片段克隆入载体。载体无需去磷酸化,引物或产物不需要加磷酸集团,产物不需酶切,对使用的载体没有限制。因此DI/TRISEC是一种方便而且行之有效的PCR产物克隆方法。
, http://www.100md.com
    图2 含有PCR产物插入片段的克隆。M:λHindⅢ/EcoRI分子量标准;

    1-10:HindⅢ酶切的白斑质粒;11:HindⅢ酶切的SK。

    第一作者简介 任功一,男,博士研究生。*博士研究生 **导师

    参 考 文 献

    1 Cortland JL,Kemp BC.PCR using a thermostable polymerase with 3' to 5' exonuclesse activity generates blunt products suitable for direct cloning.Nucleic Acids Res,1991,20:144

    2 Jung V,Petska SB,Petska S.Efficient cloning of PCR generated DNA containing terminal restriction endonuclease recognition sites.Nucleic Acids Res,1990,18:6156
, http://www.100md.com
    3 Marchuk D,Drumm M,Sanlino A et al.Construction of T-vectors,a rapid and general system for direct cloning of unrelated PCR products.Nucleic Acids Res,1991,19:1154

    4 Dietmair W,Fabry S,Schmitt R.DISEC-TRISEC:di-and trinucleotide-sticky end cloning of PCR-amplified DNA,Nucleic Acids Res,1993,21:3603

    5 Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,136

    (收稿:1999-01-20 修回:1999-03-22), 百拇医药