防风多糖增强巨噬细胞抗肿瘤作用的实验研究*
作者：李 莉 周 勇 张 丽 陆蕴如 王旭丹 葛东宇 邓巧虹
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：防风多糖；抗肿瘤作用；巨噬细胞(Mφ)；小鼠
北京中医药大学学报990315 摘 要：观察了防风多糖体内对S180移植瘤生长的影响，以及对S180瘤细胞免疫小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)吞噬活性的影响；同时，将S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ再与S180瘤细胞混合后接种给小鼠，观察防风多糖对该Mφ直接抗肿瘤活性的影响。进一步用硅胶体内阻断Mφ功能，观察对防风多糖体内抗肿瘤效果的影响。结果表明，防风多糖体内应用能明显抑制S180实体瘤的生长(抑瘤率为52.92%)，提高S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ的吞噬活性(P<0.01)，并能提高S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种时的抗肿瘤活性(P<0.01)；但是，用硅胶阻断Mφ机能后，防风多糖的抗肿瘤作用大大下降，抑瘤率由52.92%降到11.82%，表明防风多糖的抗肿瘤作用与Mφ密切相关。
, 百拇医药
Effect of Polysaccharide of Radix Sileris on Enhancing Macrophagocyte’s Antineoplastic Function
Li Li, Zhou Yong, Zhang Li, et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Observe the effect of polysaccharide of radix sileris (PRS) on the growth of S180 transplantation tumor in vivo, and celiac macrophagocytic activity of S180 oncocyte immunized mice. At the same time, combining the S180 oncocyte again with celiac macrophagocyte (Mф) of the immunized mice, vaccinate the mice and observe the effect of PRS on the Mф direct antineoplastic activity. Further, blocking the function of Mф by silica gel, observe the effect on antineoplastic function of PRS in vivo. The results show that PRS in vivo can obviously inhibit S180 tumor growth(inhibitory rate: 52.92%), increase the celiac Mф activity of S180 oncocyte immunized mice(P<0.01) and increase the antineoplastic activity when vaccinated with the combined S180 oncocyte and celiac Mф of the immunized mice(P<0.01). But, after Mф function blocked by silica gel, the antineoplastic function of PRS was greatly decreased, whose tumor inhibitory rate decreased from 52.92% to 11.82%. It indicated that the antineoplastic function of PRS closely related to Mф.
, 百拇医药
KEY WORDS: Polysaccharide of radix sileris; Antineoplastic function; Macrophagocyte (Mф)
防风多糖是从植物中药防风中提取的有效多糖部位，本室以前的研究证明，防风多糖有明显的体内抗肿瘤作用[1]。为了探讨防风多糖抗肿瘤机制的作用环节，我们采用免疫原性较强的S180瘤细胞株，着重观察了防风多糖对S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ抗肿瘤活性的作用。
1 材料和方法
1.1 动物与瘤株
昆明种小鼠：雌性，18～22g，购于北京医科大学实验动物中心。S180细胞株：引自医学科学院药物研究所，液氮冻存，复苏，动物腹腔内传代。
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1.2 药品与试剂
防风多糖：由北京中医药大学中药学院药物化学室提供，用蒸馏水溶解，经高压灭菌、高速离心后取上清液用于实验。RPMI 1640培养基：GIBCO公司，1640完全培养液中加青霉素100
U/mL、链霉素100mg/L、谷氨酰胺2mmol/L及10%的灭活新生小牛血清。绵羊红细胞(SRBC)：购自中日友好医院检验科，加阿氏液于4 ℃分装保存，使用时以生理盐水洗3次，配成所需的溶液。硅胶G：为层析用硅胶，过200目标准筛，用蒸馏水配成16g/L的硅胶悬液，灭菌后应用，注射时需不断摇匀。
1.3 实验方法
1.3.1 体内抑瘤实验
采用S180瘤株，抽取传代第7天的富含瘤细胞的小鼠腹腔液，用生理盐水稀释4倍，于右腋部皮下接种，0.2mL/只。接种前3天开始腹腔注射防风多糖溶液60mg/kg。对照组每天注射等量的生理盐水。接种后用药10 d，第11天剥瘤称重，计算抑瘤率。抑瘤率=(1-实验组肿瘤重量(g)/对照组肿瘤重量(g)×100%。
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1.3.2 S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ抗肿瘤作用的实验分组与方法[2]
实验分组：分为正常对照组、肿瘤免疫组和肿瘤免疫防风组。采用S180瘤细胞株，用生理盐水稀释成3×1010L-1，接种于后两组小鼠腹部皮下，0.1mL/只。接种当天开始用药，瘤免防风组每天腹腔注射防风多糖60mg/kg，共用药3周；正常对照组及肿瘤免疫组每天注射等量的生理盐水。
腹腔Mφ吞噬功能的测定：采用无色孔雀绿法[3]，给以上3组小鼠腹腔注射10%硫乙醇酸盐培养基，每只0.9mL，3d后断头处死小鼠。用含肝素的冷Hank's液灌洗腹腔，吸取腹腔液，以Hank's液洗细胞2次，调细胞浓度为5×109L-1，加到24孔板，1mL/孔，置37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，弃上清，用温Hank's液洗3次，然后加SRBC 5×1011L-1，1mL/孔，作用1 h后去SRBC，洗3次，加显色剂(A液：无色孔雀绿100mg,乙二醇20mL，无水乙醇80mL；B液：冰醋酸100mL，水400mL，EDTA1g；C液：丙酮；D液：1%H2O2；用时混合比例为A∶B∶C∶D=1∶4∶1∶1)1mL/孔，过夜于酶标仪λ=600nm处测OD值。
, 百拇医药
混合接种的抑瘤实验[4]：取上述3组小鼠的腹腔Mφ，以3∶1的比例与S180瘤细胞混合后(温箱中孵育40min)接种到小鼠右腋部皮下，10 d后处死小鼠测实体瘤重，计算抑瘤率。
1.3.3 阻断Mφ机能的方法[5]
实验动物分为对照组、硅胶组和硅胶防风多糖组3组。硅胶组及硅胶防风多糖组每组腹腔注射硅胶悬液1mL，对照组注射1mL生理盐水。注射3d后接种S180瘤细胞，当天开始用药，硅胶防风多糖组每天腹腔注射防风多糖60mg/kg，对照组及硅胶组注射等量的生理盐水。肿瘤接种7d后再向硅胶组及硅胶防风多糖组各鼠腹腔注射硅胶悬液1mL，接种10d，处死小鼠，剥瘤称重。
2 结果
2.1 防风多糖对S180移植瘤生长的抑制作用
, http://www.100md.com
结果见表1。
表1 防风多糖对S180移植瘤生长的抑制作用(n=10; g;
±s) 组 别
体 重
瘤 重
抑瘤率/%
始
末
肿瘤对照组
19.23±1.10
23.74±2.45
, http://www.100md.com 1.63±0.45
—
防风多糖组
19.57±1.49
22.08±0.92
0.77±0.33△△
52.92
注：与对照组比△△P<0.012.2 防风多糖对S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ吞噬活性的影响
结果见表2。
表2 防风多糖对S180瘤免小鼠腹腔Mφ蚕噬活性的影响 组 别
, http://www.100md.com
n
吞噬活性(±s)
正常对照组
10
0.129±0.005
肿瘤免疫组
10
0.115±0.003△
瘤免防风组
10
0.149±0.009**
, 百拇医药
注：与正常对照组比△P<0.05；与肿瘤免疫组比**P<0.012.3 防风多糖对S180瘤免小鼠腹腔Mφ抗肿瘤活性的影响
结果见表3。
表3 防风多糖对S180瘤免小鼠腹腔Mφ抗肿瘤活性的影响 (n=10; g；±s) 组 别
体 重
瘤 重
抑瘤率/%
始
末
肿瘤对照组
, http://www.100md.com
20.29±1.13
24.83±2.01
2.223±0.838
—
正常组Mφ+S180
19.55±1.67
23.19±1.98
1.406±0.867△
36.1
瘤免组Mφ+S180
19.42±1.65
, 百拇医药
23.08±2.37
0.724±0.583△△
67.5
瘤免防风组Mφ+S180
20.05±1.97
22.91±2.05
0.027±0.046**△△△
98.6
注：与肿瘤对照组比△P<0.05 △△P<0.01 △△△P<0.001； 与瘤免组
Mφ+S180比**P<0.01
, 百拇医药
2.4 硅胶体内阻断Mφ后防风多糖对S180移植瘤生长的影响
结果见表4。
表4 硅胶阻断Mφ后防风多糖对S180移植瘤生长的影响 (g；±s) 组 别
n
体 重
瘤 重
抑瘤率/%
始
末
对照组
, http://www.100md.com
10
18.98±1.65
22.01±2.25
1.798±0.661
—
硅胶组
10
19.08±2.33
23.67±2.41
2.275±0.374△
—
硅胶防风组
, 百拇医药
10
19.54±1.79
23.32±1.99
2.172±0.453
11.82
注：与对照组比△P<0.053 讨论
本研究的结果进一步证明，防风多糖体内应用对S180移植瘤的生长有一定的抑制作用。并且证明防风多糖能提高S180瘤细胞免疫小鼠腹腔Mφ的吞噬活性。S180瘤细胞免疫小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种的实验，结果显示，单用瘤免小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种的抑瘤率为67.5%，而应用了防风多糖的瘤免小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种的抑瘤率则提高为98.6%，进一步证明防风多糖体内能激活Mφ的抗肿瘤免疫功能；当用硅胶阻断Mφ机能后，防风多糖的抗肿瘤作用大大下降，抑瘤率由52.92%降到11.82%，表明防风多糖的抗肿瘤活性依赖Mφ。以上结果充分证明，防风多糖促进抗肿瘤免疫的作用与促进Mφ的抗肿瘤作用有密切关系，当然也并不排除防风多糖促进其他的抗肿瘤免疫机制。
, 百拇医药
防风多糖增强Mφ抗肿瘤活性的机理尚不清楚，可能同促进其溶酶体酶的分泌有关，或是与促进其分泌细胞毒性细胞因子有关，详细的机制有待我们进一步深入研究。
* 卫生部科研基金资助课题(No.96-1-254)
李 莉，女，26岁，在读医学博士生
参考文献
1 周 勇，马学清，张 丽，等.防风多糖JBO-6体内对小鼠免疫功能的影响及抗肿瘤作用.北京中医药大学学报，1996，19(4)：25～27
2 罗利群.绿茶儿茶素体内增强小鼠的肿瘤免疫反应.中国免疫学杂志，1995，11(5)：294～297
3 张玉纯，李 磊，胡承香.创伤血清免疫抑制物对巨噬细胞吞噬功能及粘附性的影响.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(1)：21～23
4 秋山由纪雄，羽室淳尔.多糖の抗肿疡性发现の机序と免疫学的性状の特征.蛋白质核酸酵素，1984，26(3)：208～224
5 于立坚，马润娣，朱鹃莉.小鼠移植性肿瘤生长的性别差异及其原因的探讨(II)：阻断巨噬细胞机能对不同性别小鼠移植性肿瘤生长的影响.天津医药肿瘤学附刊，1981，8(3)：187～189
(收稿日期：1998-10-29), 百拇医药
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：防风多糖；抗肿瘤作用；巨噬细胞(Mφ)；小鼠
北京中医药大学学报990315 摘 要：观察了防风多糖体内对S180移植瘤生长的影响，以及对S180瘤细胞免疫小鼠腹腔巨噬细胞(Mφ)吞噬活性的影响；同时，将S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ再与S180瘤细胞混合后接种给小鼠，观察防风多糖对该Mφ直接抗肿瘤活性的影响。进一步用硅胶体内阻断Mφ功能，观察对防风多糖体内抗肿瘤效果的影响。结果表明，防风多糖体内应用能明显抑制S180实体瘤的生长(抑瘤率为52.92%)，提高S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ的吞噬活性(P<0.01)，并能提高S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种时的抗肿瘤活性(P<0.01)；但是，用硅胶阻断Mφ机能后，防风多糖的抗肿瘤作用大大下降，抑瘤率由52.92%降到11.82%，表明防风多糖的抗肿瘤作用与Mφ密切相关。
, 百拇医药
Effect of Polysaccharide of Radix Sileris on Enhancing Macrophagocyte’s Antineoplastic Function
Li Li, Zhou Yong, Zhang Li, et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: Observe the effect of polysaccharide of radix sileris (PRS) on the growth of S180 transplantation tumor in vivo, and celiac macrophagocytic activity of S180 oncocyte immunized mice. At the same time, combining the S180 oncocyte again with celiac macrophagocyte (Mф) of the immunized mice, vaccinate the mice and observe the effect of PRS on the Mф direct antineoplastic activity. Further, blocking the function of Mф by silica gel, observe the effect on antineoplastic function of PRS in vivo. The results show that PRS in vivo can obviously inhibit S180 tumor growth(inhibitory rate: 52.92%), increase the celiac Mф activity of S180 oncocyte immunized mice(P<0.01) and increase the antineoplastic activity when vaccinated with the combined S180 oncocyte and celiac Mф of the immunized mice(P<0.01). But, after Mф function blocked by silica gel, the antineoplastic function of PRS was greatly decreased, whose tumor inhibitory rate decreased from 52.92% to 11.82%. It indicated that the antineoplastic function of PRS closely related to Mф.
, 百拇医药
KEY WORDS: Polysaccharide of radix sileris; Antineoplastic function; Macrophagocyte (Mф)
防风多糖是从植物中药防风中提取的有效多糖部位，本室以前的研究证明，防风多糖有明显的体内抗肿瘤作用[1]。为了探讨防风多糖抗肿瘤机制的作用环节，我们采用免疫原性较强的S180瘤细胞株，着重观察了防风多糖对S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ抗肿瘤活性的作用。
1 材料和方法
1.1 动物与瘤株
昆明种小鼠：雌性，18～22g，购于北京医科大学实验动物中心。S180细胞株：引自医学科学院药物研究所，液氮冻存，复苏，动物腹腔内传代。
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1.2 药品与试剂
防风多糖：由北京中医药大学中药学院药物化学室提供，用蒸馏水溶解，经高压灭菌、高速离心后取上清液用于实验。RPMI 1640培养基：GIBCO公司，1640完全培养液中加青霉素100
U/mL、链霉素100mg/L、谷氨酰胺2mmol/L及10%的灭活新生小牛血清。绵羊红细胞(SRBC)：购自中日友好医院检验科，加阿氏液于4 ℃分装保存，使用时以生理盐水洗3次，配成所需的溶液。硅胶G：为层析用硅胶，过200目标准筛，用蒸馏水配成16g/L的硅胶悬液，灭菌后应用，注射时需不断摇匀。
1.3 实验方法
1.3.1 体内抑瘤实验
采用S180瘤株，抽取传代第7天的富含瘤细胞的小鼠腹腔液，用生理盐水稀释4倍，于右腋部皮下接种，0.2mL/只。接种前3天开始腹腔注射防风多糖溶液60mg/kg。对照组每天注射等量的生理盐水。接种后用药10 d，第11天剥瘤称重，计算抑瘤率。抑瘤率=(1-实验组肿瘤重量(g)/对照组肿瘤重量(g)×100%。
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1.3.2 S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ抗肿瘤作用的实验分组与方法[2]
实验分组：分为正常对照组、肿瘤免疫组和肿瘤免疫防风组。采用S180瘤细胞株，用生理盐水稀释成3×1010L-1，接种于后两组小鼠腹部皮下，0.1mL/只。接种当天开始用药，瘤免防风组每天腹腔注射防风多糖60mg/kg，共用药3周；正常对照组及肿瘤免疫组每天注射等量的生理盐水。
腹腔Mφ吞噬功能的测定：采用无色孔雀绿法[3]，给以上3组小鼠腹腔注射10%硫乙醇酸盐培养基，每只0.9mL，3d后断头处死小鼠。用含肝素的冷Hank's液灌洗腹腔，吸取腹腔液，以Hank's液洗细胞2次，调细胞浓度为5×109L-1，加到24孔板，1mL/孔，置37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，弃上清，用温Hank's液洗3次，然后加SRBC 5×1011L-1，1mL/孔，作用1 h后去SRBC，洗3次，加显色剂(A液：无色孔雀绿100mg,乙二醇20mL，无水乙醇80mL；B液：冰醋酸100mL，水400mL，EDTA1g；C液：丙酮；D液：1%H2O2；用时混合比例为A∶B∶C∶D=1∶4∶1∶1)1mL/孔，过夜于酶标仪λ=600nm处测OD值。
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混合接种的抑瘤实验[4]：取上述3组小鼠的腹腔Mφ，以3∶1的比例与S180瘤细胞混合后(温箱中孵育40min)接种到小鼠右腋部皮下，10 d后处死小鼠测实体瘤重，计算抑瘤率。
1.3.3 阻断Mφ机能的方法[5]
实验动物分为对照组、硅胶组和硅胶防风多糖组3组。硅胶组及硅胶防风多糖组每组腹腔注射硅胶悬液1mL，对照组注射1mL生理盐水。注射3d后接种S180瘤细胞，当天开始用药，硅胶防风多糖组每天腹腔注射防风多糖60mg/kg，对照组及硅胶组注射等量的生理盐水。肿瘤接种7d后再向硅胶组及硅胶防风多糖组各鼠腹腔注射硅胶悬液1mL，接种10d，处死小鼠，剥瘤称重。
2 结果
2.1 防风多糖对S180移植瘤生长的抑制作用
, http://www.100md.com
结果见表1。
表1 防风多糖对S180移植瘤生长的抑制作用(n=10; g;
±s) 组 别体 重
瘤 重
抑瘤率/%
始
末
肿瘤对照组
19.23±1.10
23.74±2.45
, http://www.100md.com 1.63±0.45
—
防风多糖组
19.57±1.49
22.08±0.92
0.77±0.33△△
52.92
注：与对照组比△△P<0.012.2 防风多糖对S180瘤免疫小鼠腹腔Mφ吞噬活性的影响
结果见表2。
表2 防风多糖对S180瘤免小鼠腹腔Mφ蚕噬活性的影响 组 别
, http://www.100md.com
n
吞噬活性(
±s)正常对照组
10
0.129±0.005
肿瘤免疫组
10
0.115±0.003△
瘤免防风组
10
0.149±0.009**
, 百拇医药
注：与正常对照组比△P<0.05；与肿瘤免疫组比**P<0.012.3 防风多糖对S180瘤免小鼠腹腔Mφ抗肿瘤活性的影响
结果见表3。
表3 防风多糖对S180瘤免小鼠腹腔Mφ抗肿瘤活性的影响 (n=10; g；
±s) 组 别体 重
瘤 重
抑瘤率/%
始
末
肿瘤对照组
, http://www.100md.com
20.29±1.13
24.83±2.01
2.223±0.838
—
正常组Mφ+S180
19.55±1.67
23.19±1.98
1.406±0.867△
36.1
瘤免组Mφ+S180
19.42±1.65
, 百拇医药
23.08±2.37
0.724±0.583△△
67.5
瘤免防风组Mφ+S180
20.05±1.97
22.91±2.05
0.027±0.046**△△△
98.6
注：与肿瘤对照组比△P<0.05 △△P<0.01 △△△P<0.001； 与瘤免组
Mφ+S180比**P<0.01
, 百拇医药
2.4 硅胶体内阻断Mφ后防风多糖对S180移植瘤生长的影响
结果见表4。
表4 硅胶阻断Mφ后防风多糖对S180移植瘤生长的影响 (g；
±s) 组 别n
体 重
瘤 重
抑瘤率/%
始
末
对照组
, http://www.100md.com
10
18.98±1.65
22.01±2.25
1.798±0.661
—
硅胶组
10
19.08±2.33
23.67±2.41
2.275±0.374△
—
硅胶防风组
, 百拇医药
10
19.54±1.79
23.32±1.99
2.172±0.453
11.82
注：与对照组比△P<0.053 讨论
本研究的结果进一步证明，防风多糖体内应用对S180移植瘤的生长有一定的抑制作用。并且证明防风多糖能提高S180瘤细胞免疫小鼠腹腔Mφ的吞噬活性。S180瘤细胞免疫小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种的实验，结果显示，单用瘤免小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种的抑瘤率为67.5%，而应用了防风多糖的瘤免小鼠腹腔Mφ与S180瘤细胞混合接种的抑瘤率则提高为98.6%，进一步证明防风多糖体内能激活Mφ的抗肿瘤免疫功能；当用硅胶阻断Mφ机能后，防风多糖的抗肿瘤作用大大下降，抑瘤率由52.92%降到11.82%，表明防风多糖的抗肿瘤活性依赖Mφ。以上结果充分证明，防风多糖促进抗肿瘤免疫的作用与促进Mφ的抗肿瘤作用有密切关系，当然也并不排除防风多糖促进其他的抗肿瘤免疫机制。
, 百拇医药
防风多糖增强Mφ抗肿瘤活性的机理尚不清楚，可能同促进其溶酶体酶的分泌有关，或是与促进其分泌细胞毒性细胞因子有关，详细的机制有待我们进一步深入研究。
* 卫生部科研基金资助课题(No.96-1-254)
李 莉，女，26岁，在读医学博士生
参考文献
1 周 勇，马学清，张 丽，等.防风多糖JBO-6体内对小鼠免疫功能的影响及抗肿瘤作用.北京中医药大学学报，1996，19(4)：25～27
2 罗利群.绿茶儿茶素体内增强小鼠的肿瘤免疫反应.中国免疫学杂志，1995，11(5)：294～297
3 张玉纯，李 磊，胡承香.创伤血清免疫抑制物对巨噬细胞吞噬功能及粘附性的影响.中国实验临床免疫学杂志，1997，9(1)：21～23
4 秋山由纪雄，羽室淳尔.多糖の抗肿疡性发现の机序と免疫学的性状の特征.蛋白质核酸酵素，1984，26(3)：208～224
5 于立坚，马润娣，朱鹃莉.小鼠移植性肿瘤生长的性别差异及其原因的探讨(II)：阻断巨噬细胞机能对不同性别小鼠移植性肿瘤生长的影响.天津医药肿瘤学附刊，1981，8(3)：187～189
(收稿日期：1998-10-29), 百拇医药