中药2号方抗肝纤维化的形态学和血清学实验研究*
作者：姜学连 贲长恩 于世瀛 杨美娟
单位：北京中医药大学组织与胚胎学教研室 北京100029
关键词：中药2号方；肝纤维化；形态学；血清学；大鼠
北京中医药大学学报990314 摘 要：用猪血清腹腔注射法复制大鼠免疫性肝纤维化模型，用以清热利湿、补气健脾、养血活血为主要治法的中药2号方进行预防和治疗，用光镜观察肝脏HE、Mallory染色的变化，用电镜观察肝脏超微结构的变化，并检测了血清生物化学的变化。结果证明中药2号方有明显的改善肝功能和抗肝纤维化的作用。
Experimental Study on the Prevention and Treatment of Hepatic Fibrosis with the TCM Decoction Ⅱ
, http://www.100md.com Jiang Xuelian, Ben Chang’en, Yu Shiying, et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: The immunohepatic fibrosis model was induced by intraperitoneal injection of porcine serum, treated with the TCM Decoction Ⅱ whose function was removing heat and dampness, nourishing qi and spleen, tonifing blood and motivating blood circulation. The changes of HE、Mallory were observed with optic microscope, the extra-structure of the rats' livers were observed with electronic microscope, and the changes of serology were tested. The results showed that the TCM Decoction Ⅱ can markedly improve the hepatic function and prevent hepatic fibrosis.
, 百拇医药
KEY WORDS: TCM Decoction Ⅱ； Hepatic fibrosis; Experimental study
近几年，我们应用中药2号方治疗慢性活动性乙型肝炎取得良好效果[1]。在此基础上，我们以中药2号方对治疗猪血清所致大鼠肝纤维化的治疗作用进行了实验研究，结果如下：
1 材料与方法
1.1 动物分组：雄性Wistar大鼠93只，体重140g左右，随机分为7组，每组14只：①正常对照组；②模型1组；③模型2组；④中药治疗组；⑤中药预防组；⑥西药治疗组；⑦西药预防组。
1.2 造模与取材：除正常组外，其余各组均参照于氏等[2]的方法复制肝纤维化模型。取猪血清0.5 mL给大鼠腹腔内注射，每周2次，于注射开始后的第35天，正常组(7只)、模型1组(13只)、中药预防组(14只)和西药预防组(13只)断头处死，取血分离血清做生化检查；取肝左叶距边缘3 mm处肝脏，中性福尔马林固定，制作光镜标本，用2.5%戊二醛固定制作电镜标本。造模后第70天，正常组(7只)，模型2组(13只)、中药治疗组(13只)及西药治疗组(13只)取材，方法同第1次取材。
, http://www.100md.com
1.3 给药方法：中药2号方(黄芪、白术、柴胡、丹参、黄芩、当归、茵陈、甘草等)水煎剂含生药3g/mL。中药预防组于造模后同时给药，给药剂量30g/kg，每天上午灌胃1次，连续35 d；西药预防组给以秋水仙碱0.2mg/kg的剂量灌胃，连续35 d。中药治疗组、西药治疗组第36天开始给药，剂量、方式、时间同前。
1.4 检测指标：①光镜标本：石蜡包埋，常规切片，HE染色，Mallory染色；②电镜标本：2.5%戊二醛前固定，锇酸后固定染色，切片厚50nm，JEM-120EXDJD电镜观察；③血清指标：应用日立750型自动生化分析仪检测ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(门冬氨酸氨基转移酶)、TBIL(血清总胆红素)、ALB(血清白蛋白)、ALP(碱性磷酸酶)、BUN(尿素氮)、A/G(白蛋白/球蛋白)。
1.5 统计处理：Mallory三色胶原染色结果用图像分析仪作定量分析测量均值，血清指标计算均值，各组间用t检验进行统计处理。
, 百拇医药
2 结果
2.1 光镜下形态学变化：正常组肝小叶间无纤维间隔，没有肝细胞变性、坏死、模型组肝脏内有明显的纤维组织增生，正常肝小叶结构被破坏，假小叶形成，部分肝细胞变性、坏死，胞质空泡状；中药预防组肝脏结构基本正常，未见纤维组织增生；中药治疗组肝脏结构基本正常，汇管区仍有少量结缔组织增生，肝细胞变性较轻；西药预防组有纤维组织增生，但未形成纤维间隔，小叶结构完整；西药治疗组增生的纤维间隔分割肝小叶，但增生的纤维量少于模型组，可见变性的肝细胞。胶原染色图像分析结果见表1。
表1 各组胶原含量图像分析测量结果 (
±s) 组 别
n
光密度(MOD)
正 常 组
, http://www.100md.com
14
16.12±3.43
模 型 组
26
186.76±17.89**
中药预防组
14
18.59±2.23＃＃
中药治疗组
13
23.14±4.98*＃＃△△
, http://www.100md.com 西药预防组
13
35.46±6.76**＃＃
西药治疗组
13
80.74±13.59**＃＃
注：与正常组比*P<0.05**P<0.01；
与模型组比#P<0.05##P<0.01；
与西药治疗组比△P<0.05△△P<0.01
2.2 电镜下形态学变化：正常组线粒体呈圆形或椭圆形，分布较均匀，粗面内质网较多，平行排列，滑面内质网较少，核大而圆，偶见双核，核仁明显；模型组肝细胞变性、坏死，线粒体形态不规则，部分嵴退化、消化，粗面内质网较少、扩张、脱颗粒，糖原颗粒减少，滑面内质网较多，核固缩，核仁消失，血窦壁变成连续性，血窦向毛细血管样变化，肝窦内有大量交织排列的纤维束，贮脂细胞变大，胞质内脂滴减少而细胞器增多；中药预防组肝细胞结构基本正常；中药治疗组肝窦周胶原含量很少，肝细胞内线粒体丰富，粗面内质网较多，糖原颗粒增多，变性肝细胞少见；西药预防组肝细胞形态结构基本正常，窦周隙内可见胶原纤维束；西药治疗组肝细胞内线粒体、粗面内质网及糖原颗粒明显比中药组少，窦周隙和门管区可见交织存在的胶原纤维束，肝窦毛细血管化，仍有较多的变性肝细胞，贮脂细胞、成纤维细胞较多。
, 百拇医药
2.3 血清指标：见表2。
表2 各组血清学检查结果 (±s) 组 别
n
ALT/IU/L
AST/IU/L
ALP/IU/L
TBIL/μmol/L
ALB/g/L
A/G
BUN/μmol/L
正常组
, 百拇医药
14
50.12±
6.08
129.25±
40.52
245.88±
57.89
6.83±1.70
37.6±2.1
1.11±0.05
7.04±0.78
模型组
, 百拇医药
24
95.11±1
2.27**
235.22±
46.28**
598.54±
93.90**
10.71±2.55**
30.8±2.2**
0.73±0.17**
, 百拇医药 10.00±1.62**
中药预
防组
14
46.65±
8.19＃＃
157.16±
41.02＃＃
244.67±
24.91＃＃
7.99±2.04＃
, 百拇医药
37.8±1.5＃＃
1.14±0.06＃＃
8.30±1.54#
中药治
疗组
13
46.00±
6.92＃＃△△
177.33±
26.25＃＃△
282.17±
, 百拇医药
52.29＃＃△△
7.65±1.02＃＃△
38.6±2.2＃＃△△
1.07±0.07＃＃△△
8.09±0.91＃＃△
西药预
防组
13
78.23±
7.51**＃
, http://www.100md.com 190.35±
20.82**
422.51±
37.39**＃＃
9.69±1.53
32.3±1.7**
1.05±0.08＃＃
9.17±1.12**
西药治
疗组
13
, 百拇医药
86.78±
11.50**
216.47±3
1.26**
510.37±
42.72**
10.37±1.87**
31.5±2.1**
0.81±0.12**
9.81±1.51**
, http://www.100md.com
注：与正常组比*P<0.05**P<0.01； 与模型组比#P<0.05##P<0.01； 与西药治疗组比△P<0.05△△P<0.013 讨论
各种原因引起的慢性肝病都具有炎症、坏死和纤维化的病理特征，肝脏纤维组织增生是慢性肝炎、肝硬化的基本病理改变之一，对于慢性肝炎肝纤维化的治疗，目前尚缺乏理想的药物。近几年我们应用中药2号方治疗慢性肝炎、早期肝硬化取得良好效果。该方主要由黄芪、白术、柴胡、丹参、黄芩、当归、茵陈、甘草等药物组成，方中黄芪、白术补气健脾，丹参、当归养血活血，黄芩清热解毒燥湿，茵陈清热利湿，甘草调和诸药，全方具有补气健脾、养血活血、清热利湿的作用。现代医学研究证明，黄芪能减少胶原在肝内的沉积，并可通过多环节抗肝细胞变性坏死，促进再生，改善免疫功能；丹参可以保护肝细胞，抗炎症反应，抑制胶原合成，促进胶原降解；柴胡能抑制肝纤维化的形成，促进蛋白质合成，增加肝糖原，抗炎症反应；白术可以提高免疫功能，抗肝损伤；当归能促进肝细胞合成白蛋白，抑制胶原沉积；甘草中的甘草甜素、甘草次酸可以降低转氨酶，抑制炎症反应，保护肝细胞；黄芩、茵陈具有保肝利胆作用[3]。
, http://www.100md.com
我们在实验中采用猪血清腹腔注射法复制大鼠肝纤维化模型，该模型较其他模型具有方法简单、周期短、经济、肝纤维化出现率高、整体损伤轻等特点[4]。本实验的中药预防组血窦及中央静脉结构基本不变，血液循环正常，未见纤维组织增生，肝细胞很少变性、坏死；中药治疗组变性的肝细胞明显减少，仅汇管区有少量的纤维组织增生，贮脂细胞明显少于西药组；秋水仙碱对肝纤维化也有一定的治疗作用，但其治疗组肝内胶原纤维含量明显超过中药治疗组。各组Mallory染色，经图像分析仪处理，模型组肝内胶原含量是正常组的11.6倍，西药治疗组是正常组的5.0倍，中药治疗组是正常组的1.4倍，中药治疗组明显优于西药治疗组。模型组血清中的ALT、AST、TBIL、ALP、BUN等均明显升高，ALB明显下降，表明肝细胞功能遭到破坏[5]；模型组与正常组相比有统计学意义，中药治疗组血清指标与正常组相比变化不明显，西药治疗组虽然变化较明显，但中药预防组、治疗组与西药预防组、治疗组相比差异显著。本实验结果表明，中药2号方能够保护肝细胞膜系统，减轻肝细胞变性、坏死，抑制贮脂细胞活化和增殖，减少胶原合成和分泌，阻抑肝纤维化发展，其效果明显优于秋水仙碱。
, http://www.100md.com
* 教育部博士学科点专项科研基金资助课题(No.9505144)
作者简介：姜学连，男，33岁，主治医师，在读医学博士生
参考文献
1 姜学连，张卫国，邢曰利，等.浅谈湿热与慢性活动性肝炎.滨州医学院学报，1995，(5)：120～121
2 于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.免疫性和化学性损伤肝纤维化动物模型的比较研究.实验动物科学与管理，1995，12(4)：5～12
3 程明亮，刘三都主编.肝纤维化的基础研究与临床.北京：人民卫生出版社，1996.231～247
4 于世瀛，贲长恩，王德福.活血化瘀方药抗大鼠肝纤维化的形态学和组织化学定量研究.中西医结合肝病杂志，1996，6(2)：21～23
5 曹献英，贲长恩，于世瀛，等.活血化瘀方药治疗大鼠肝纤维化的组织学和血清学实验研究.北京中医药大学学报，1998，21(2)：36～37
(收稿日期：1998-11-20), http://www.100md.com
单位：北京中医药大学组织与胚胎学教研室 北京100029
关键词：中药2号方；肝纤维化；形态学；血清学；大鼠
北京中医药大学学报990314 摘 要：用猪血清腹腔注射法复制大鼠免疫性肝纤维化模型，用以清热利湿、补气健脾、养血活血为主要治法的中药2号方进行预防和治疗，用光镜观察肝脏HE、Mallory染色的变化，用电镜观察肝脏超微结构的变化，并检测了血清生物化学的变化。结果证明中药2号方有明显的改善肝功能和抗肝纤维化的作用。
Experimental Study on the Prevention and Treatment of Hepatic Fibrosis with the TCM Decoction Ⅱ
, http://www.100md.com Jiang Xuelian, Ben Chang’en, Yu Shiying, et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT: The immunohepatic fibrosis model was induced by intraperitoneal injection of porcine serum, treated with the TCM Decoction Ⅱ whose function was removing heat and dampness, nourishing qi and spleen, tonifing blood and motivating blood circulation. The changes of HE、Mallory were observed with optic microscope, the extra-structure of the rats' livers were observed with electronic microscope, and the changes of serology were tested. The results showed that the TCM Decoction Ⅱ can markedly improve the hepatic function and prevent hepatic fibrosis.
, 百拇医药
KEY WORDS: TCM Decoction Ⅱ； Hepatic fibrosis; Experimental study
近几年，我们应用中药2号方治疗慢性活动性乙型肝炎取得良好效果[1]。在此基础上，我们以中药2号方对治疗猪血清所致大鼠肝纤维化的治疗作用进行了实验研究，结果如下：
1 材料与方法
1.1 动物分组：雄性Wistar大鼠93只，体重140g左右，随机分为7组，每组14只：①正常对照组；②模型1组；③模型2组；④中药治疗组；⑤中药预防组；⑥西药治疗组；⑦西药预防组。
1.2 造模与取材：除正常组外，其余各组均参照于氏等[2]的方法复制肝纤维化模型。取猪血清0.5 mL给大鼠腹腔内注射，每周2次，于注射开始后的第35天，正常组(7只)、模型1组(13只)、中药预防组(14只)和西药预防组(13只)断头处死，取血分离血清做生化检查；取肝左叶距边缘3 mm处肝脏，中性福尔马林固定，制作光镜标本，用2.5%戊二醛固定制作电镜标本。造模后第70天，正常组(7只)，模型2组(13只)、中药治疗组(13只)及西药治疗组(13只)取材，方法同第1次取材。
, http://www.100md.com
1.3 给药方法：中药2号方(黄芪、白术、柴胡、丹参、黄芩、当归、茵陈、甘草等)水煎剂含生药3g/mL。中药预防组于造模后同时给药，给药剂量30g/kg，每天上午灌胃1次，连续35 d；西药预防组给以秋水仙碱0.2mg/kg的剂量灌胃，连续35 d。中药治疗组、西药治疗组第36天开始给药，剂量、方式、时间同前。
1.4 检测指标：①光镜标本：石蜡包埋，常规切片，HE染色，Mallory染色；②电镜标本：2.5%戊二醛前固定，锇酸后固定染色，切片厚50nm，JEM-120EXDJD电镜观察；③血清指标：应用日立750型自动生化分析仪检测ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(门冬氨酸氨基转移酶)、TBIL(血清总胆红素)、ALB(血清白蛋白)、ALP(碱性磷酸酶)、BUN(尿素氮)、A/G(白蛋白/球蛋白)。
1.5 统计处理：Mallory三色胶原染色结果用图像分析仪作定量分析测量均值，血清指标计算均值，各组间用t检验进行统计处理。
, 百拇医药
2 结果
2.1 光镜下形态学变化：正常组肝小叶间无纤维间隔，没有肝细胞变性、坏死、模型组肝脏内有明显的纤维组织增生，正常肝小叶结构被破坏，假小叶形成，部分肝细胞变性、坏死，胞质空泡状；中药预防组肝脏结构基本正常，未见纤维组织增生；中药治疗组肝脏结构基本正常，汇管区仍有少量结缔组织增生，肝细胞变性较轻；西药预防组有纤维组织增生，但未形成纤维间隔，小叶结构完整；西药治疗组增生的纤维间隔分割肝小叶，但增生的纤维量少于模型组，可见变性的肝细胞。胶原染色图像分析结果见表1。
表1 各组胶原含量图像分析测量结果 (
±s) 组 别n
光密度(MOD)
正 常 组
, http://www.100md.com
14
16.12±3.43
模 型 组
26
186.76±17.89**
中药预防组
14
18.59±2.23＃＃
中药治疗组
13
23.14±4.98*＃＃△△
, http://www.100md.com 西药预防组
13
35.46±6.76**＃＃
西药治疗组
13
80.74±13.59**＃＃
注：与正常组比*P<0.05**P<0.01；
与模型组比#P<0.05##P<0.01；
与西药治疗组比△P<0.05△△P<0.01
2.2 电镜下形态学变化：正常组线粒体呈圆形或椭圆形，分布较均匀，粗面内质网较多，平行排列，滑面内质网较少，核大而圆，偶见双核，核仁明显；模型组肝细胞变性、坏死，线粒体形态不规则，部分嵴退化、消化，粗面内质网较少、扩张、脱颗粒，糖原颗粒减少，滑面内质网较多，核固缩，核仁消失，血窦壁变成连续性，血窦向毛细血管样变化，肝窦内有大量交织排列的纤维束，贮脂细胞变大，胞质内脂滴减少而细胞器增多；中药预防组肝细胞结构基本正常；中药治疗组肝窦周胶原含量很少，肝细胞内线粒体丰富，粗面内质网较多，糖原颗粒增多，变性肝细胞少见；西药预防组肝细胞形态结构基本正常，窦周隙内可见胶原纤维束；西药治疗组肝细胞内线粒体、粗面内质网及糖原颗粒明显比中药组少，窦周隙和门管区可见交织存在的胶原纤维束，肝窦毛细血管化，仍有较多的变性肝细胞，贮脂细胞、成纤维细胞较多。
, 百拇医药
2.3 血清指标：见表2。
表2 各组血清学检查结果 (
±s) 组 别n
ALT/IU/L
AST/IU/L
ALP/IU/L
TBIL/μmol/L
ALB/g/L
A/G
BUN/μmol/L
正常组
, 百拇医药
14
50.12±
6.08
129.25±
40.52
245.88±
57.89
6.83±1.70
37.6±2.1
1.11±0.05
7.04±0.78
模型组
, 百拇医药
24
95.11±1
2.27**
235.22±
46.28**
598.54±
93.90**
10.71±2.55**
30.8±2.2**
0.73±0.17**
, 百拇医药 10.00±1.62**
中药预
防组
14
46.65±
8.19＃＃
157.16±
41.02＃＃
244.67±
24.91＃＃
7.99±2.04＃
, 百拇医药
37.8±1.5＃＃
1.14±0.06＃＃
8.30±1.54#
中药治
疗组
13
46.00±
6.92＃＃△△
177.33±
26.25＃＃△
282.17±
, 百拇医药
52.29＃＃△△
7.65±1.02＃＃△
38.6±2.2＃＃△△
1.07±0.07＃＃△△
8.09±0.91＃＃△
西药预
防组
13
78.23±
7.51**＃
, http://www.100md.com 190.35±
20.82**
422.51±
37.39**＃＃
9.69±1.53
32.3±1.7**
1.05±0.08＃＃
9.17±1.12**
西药治
疗组
13
, 百拇医药
86.78±
11.50**
216.47±3
1.26**
510.37±
42.72**
10.37±1.87**
31.5±2.1**
0.81±0.12**
9.81±1.51**
, http://www.100md.com
注：与正常组比*P<0.05**P<0.01； 与模型组比#P<0.05##P<0.01； 与西药治疗组比△P<0.05△△P<0.013 讨论
各种原因引起的慢性肝病都具有炎症、坏死和纤维化的病理特征，肝脏纤维组织增生是慢性肝炎、肝硬化的基本病理改变之一，对于慢性肝炎肝纤维化的治疗，目前尚缺乏理想的药物。近几年我们应用中药2号方治疗慢性肝炎、早期肝硬化取得良好效果。该方主要由黄芪、白术、柴胡、丹参、黄芩、当归、茵陈、甘草等药物组成，方中黄芪、白术补气健脾，丹参、当归养血活血，黄芩清热解毒燥湿，茵陈清热利湿，甘草调和诸药，全方具有补气健脾、养血活血、清热利湿的作用。现代医学研究证明，黄芪能减少胶原在肝内的沉积，并可通过多环节抗肝细胞变性坏死，促进再生，改善免疫功能；丹参可以保护肝细胞，抗炎症反应，抑制胶原合成，促进胶原降解；柴胡能抑制肝纤维化的形成，促进蛋白质合成，增加肝糖原，抗炎症反应；白术可以提高免疫功能，抗肝损伤；当归能促进肝细胞合成白蛋白，抑制胶原沉积；甘草中的甘草甜素、甘草次酸可以降低转氨酶，抑制炎症反应，保护肝细胞；黄芩、茵陈具有保肝利胆作用[3]。
, http://www.100md.com
我们在实验中采用猪血清腹腔注射法复制大鼠肝纤维化模型，该模型较其他模型具有方法简单、周期短、经济、肝纤维化出现率高、整体损伤轻等特点[4]。本实验的中药预防组血窦及中央静脉结构基本不变，血液循环正常，未见纤维组织增生，肝细胞很少变性、坏死；中药治疗组变性的肝细胞明显减少，仅汇管区有少量的纤维组织增生，贮脂细胞明显少于西药组；秋水仙碱对肝纤维化也有一定的治疗作用，但其治疗组肝内胶原纤维含量明显超过中药治疗组。各组Mallory染色，经图像分析仪处理，模型组肝内胶原含量是正常组的11.6倍，西药治疗组是正常组的5.0倍，中药治疗组是正常组的1.4倍，中药治疗组明显优于西药治疗组。模型组血清中的ALT、AST、TBIL、ALP、BUN等均明显升高，ALB明显下降，表明肝细胞功能遭到破坏[5]；模型组与正常组相比有统计学意义，中药治疗组血清指标与正常组相比变化不明显，西药治疗组虽然变化较明显，但中药预防组、治疗组与西药预防组、治疗组相比差异显著。本实验结果表明，中药2号方能够保护肝细胞膜系统，减轻肝细胞变性、坏死，抑制贮脂细胞活化和增殖，减少胶原合成和分泌，阻抑肝纤维化发展，其效果明显优于秋水仙碱。
, http://www.100md.com
* 教育部博士学科点专项科研基金资助课题(No.9505144)
作者简介：姜学连，男，33岁，主治医师，在读医学博士生
参考文献
1 姜学连，张卫国，邢曰利，等.浅谈湿热与慢性活动性肝炎.滨州医学院学报，1995，(5)：120～121
2 于世瀛，贲长恩，杨美娟，等.免疫性和化学性损伤肝纤维化动物模型的比较研究.实验动物科学与管理，1995，12(4)：5～12
3 程明亮，刘三都主编.肝纤维化的基础研究与临床.北京：人民卫生出版社，1996.231～247
4 于世瀛，贲长恩，王德福.活血化瘀方药抗大鼠肝纤维化的形态学和组织化学定量研究.中西医结合肝病杂志，1996，6(2)：21～23
5 曹献英，贲长恩，于世瀛，等.活血化瘀方药治疗大鼠肝纤维化的组织学和血清学实验研究.北京中医药大学学报，1998，21(2)：36～37
(收稿日期：1998-11-20), http://www.100md.com