大蒜GO889对HIV等病毒作用的实验研究
作者：王满霞 卢长安 孙 刚
单位：王满霞 卢长安 孙 刚(中国中医研究院基础理论研究所 北京 100700)
关键词：大蒜；HIV-1；HSV-1；MTTassay； CPE
摘 要 目的 研究大蒜提取物GO889对人类免疫缺陷病毒1型 摘 要 目的 研究大蒜提取物GO889对人类免疫缺陷病毒1型(HIV—1)及其他与呼吸道感染有关病毒的作用。方法 采用MTT法及CPE法测定药物对病毒所致细胞病变的抑制作用。结果 GO889对HIV-1、HSV-1、HSV-2、ADA3、ADA7、COXB5、COXB6等病毒，有一定的抑制作用。结论 说明大蒜提取物GO889有较广的抗病毒谱，为临床用其治疗艾滋病及上呼吸道感染提供了参考依据。
Experimental Study on Anti-HIV and Other Viruses
, http://www.100md.com
by GO889,an Extract of Bulbus Allii
Wang manxia Lu changan Sun gang
(Institute of Basic Theory,China Academy of TCM,Beijing 100700)
Abstract:Objective:GO889 is an Extract of Bulbus Allii,in this paper,examined for its effects on human immunodeficiency virus type 1(HIV-1) and other viruses of infection respiratory.Methods:Determine the Inhibition of GO889 on cytopathic effect induced by viruses using MTT assay or CPE method in votro.Results:GO889,an extract of Bulbus Alii can inhibited cytopathic effect induced by HIV-1,HSV-1,HSV-2,ADA3,ADA7,CoxB5，CoxB6.Conclusions:Our studies indicates that GO889 is a broad-spectrum antiviral agent and recommended it to clinical treatment AIDS and respiratory infection.
, 百拇医药
Key words Bulbus Allii HIV-1 HSV-1 MTT assay CPE testosterone
文献报道大蒜有抑制HIV的作用，我们以往的工作证明其具有较强的抗肿瘤作用，本文在证实其抗HIV作用的同时，进一步研究了对其他与呼吸道感染有关病毒的作用。
材料和方法
细胞：MT-4细胞和Hep-2细胞由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。
病毒：人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、流感病毒甲3型(A3)副流感病毒(HVJ)、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、腺病毒(ADA3和ADA7)、呼吸道合胞病毒(RS)、科萨奇病毒(Coxsackie B5和B6)等，均由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。经常规传代测定感染滴度(TCID50)后用于实验。
, 百拇医药
药物：大蒜GO889(批号：980224-2)提取物由本所制剂室制备。
试剂：所用的噻唑兰即MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]，为美国进口试剂，以pH7.2 PBS配制成0.7 mg/ml溶液置4℃冰箱保存备用。
仪器：测定光密度所用酶标仪为法国生产的LP 400全自动酶标仪。
步骤：抗HIV-1实验和抗其他呼吸道感染病毒实验方法不尽相同。
1 抗HIV-1实验
参照文献[1]，简言之，将药样在96孔细胞板中用1640培养液倍比稀释，使各孔中保留100μl药液，向各孔加入50μl(含104个)MT-4细胞，再加入50μl 100TCID50的HIV-1病毒液。同时设正常细胞对照及病毒感染对照若干孔。置37℃ 5%CO2箱中培养。第3日各孔补2倍浓缩1640液20μl继续培养。第5日按MTT法染色测定光密度OD值。求出药物对HIV-1感染细胞的保护率。实验前先测定药物对MT-4细胞的毒性界限，求出50%细胞毒性浓度(CC50)。
, 百拇医药
2 抗呼吸道病毒实验
将Hep-2细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2中培养48h长成细胞单层，再将各药用Eagle's液作倍比稀释，加入细胞板中(每稀释加3孔)，设正常细胞对照若干孔，置相同条件下继续培养，于第3d观察结果，以出现“2+”(50%)及其以上细胞病变(CPE)作为毒性标准，找出亚毒性浓度(SC)，采用Reed-Muench法计算出药物对细胞的50%毒性浓度(CC50)。做抗病毒实验时以同样方法将无毒界限以下不同稀释度的药物加到板孔细胞单层上，每稀释度加3孔，再分别感染100 TCID50的各种病毒，置于37℃，5%CO2中培养，第3d观察细胞病变(CPE)。以出现CPE在“1+”(25%)及其以下的试验孔认为药物有抑制细胞病变的作用，以同法求出50%有效浓度(EC50)，计算治疗指数(TI=CC50/EC50)。
, 百拇医药
结果
1 抗HIV-1实验结果
实验前测定大蒜提取物GO889对MT-4细胞的CC50为0.89%，亚毒性浓度SC=0.625%。
大蒜提取物GO889对HIV-1的抑制作用见表1，其50%抑制浓度EC50为0.19%，最高保护率(抑制率)达94.76%，治疗指数TI=0.89/0.19=5。同时观察了CPE结果相近。
表1 大蒜提取物GO889对HIV-1感染MT-4细胞的保护作用
药物浓度(%)
OD均值
标准差(s)
, 百拇医药
保护率(%)
0.625
0.1857
0.0384
94.76
0.313
0.1453
0.0509
65.41
0.156
0.1067
0.0230
37.26
, 百拇医药
0.078
0.0807
0.0188
18.33
细胞对照
0.1928
0.0109
病毒对照
0.0555
0.0073
2 抗呼吸道病毒实验结果
按上述方法测得大蒜提取物GO889对Hep-2细胞的毒性果为CC50=0.89%，亚毒性浓度SC=0.625%，对各种病毒所致细胞病变(CPE)的作用见表2。
, http://www.100md.com
表2 大蒜提取物GO889对常见呼吸道病毒的作用
病毒
感染量
TCID50
MIC
CC50=0.89%
EC50
TI
A3
100
—
, 百拇医药 —
—
HVJ
100
—
—
—
RS
100
—
—
—
COXB5
100
, http://www.100md.com
0.078%
0.102%
9
COXB6
100
0.078%
0.048%
19
ADA3
100
0.156%
0.112%
, 百拇医药
8
ADA7
100
0.313%
0.220%
4
HSV-1
100
0.156%
0.112%
8
HSV-2
100
, 百拇医药
0.156%
0.112%
8
结果可见大蒜提取物GO889对流感甲3型(A3)、副流感(HVJ)和呼吸道合病毒(RS)未显示出活性，而对疱疹病毒1，2型(HSV-1，HSV-2)、腺病毒3，7型(ADA3，ADA7)、科萨奇B5，B6型(Coxsackie B5，B6)具有不同程度的抑制作用，且多数治疗指数较高(8～19)。讨论
大蒜性味辛温，能消肿、解毒、杀虫，临床用于痈疖肿毒，癣疮，肺痨等。药理研究证明其具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、保肝、降压、降血糖、杀精等多种作用[2]。另据资料载大蒜尚具有抗HIV的作用[3]，我们以往的工作也证实其具有较强的抑制肿瘤细胞的作用，对人白血病粒细胞和肝癌细胞生长的抑制率分别为69.21%和75.94%，与对照组相比P<0.01[4-7]。文献[2]仅载大蒜有抗巨细胞病毒(CMV)作用，为探讨大蒜的抗病毒谱，我们进行了以上研究，结果表明，我所制剂室制备的大蒜提取物不仅对HIV-1有一定的抑制作用，而且还发现对单纯疱疹病毒1，2型(HSV-1，HSV-2)、腺病毒3，7型(ADA3，ADA7)、科萨奇病毒B5，B6型(Coxsackie B5，B6)等多种与呼吸道感染有关病毒具有一定的抑制作用。其作用强度不尽相同，对HIV-1的治疗指数较低，对其他病毒多数表显为治疗指数较高。这些结果为临床用药和新药开发会提供一些参考依据。
, 百拇医药
作者简介：王满霞，女，44岁，中国中医研究院基础理论研究所P3实验室副研究员，从事中药抗艾滋病病毒研究工作。地址：北京市东直门内北新仑18号电话：64014411-2645 邮编：100700
参考文献
[1] 卢长安，等.MTT法在抗HIV药物研究中的应用.中国中医基础医学杂志，1998，4(9)：23
[2] 黄泰康.常用中药成分与药理手册.第一版.北京：中国医药科技出版社，1994.328
[3] 吕维柏.艾滋病中西医防治学.第一版.北京：人民卫生出版社，1994.164
[4] 王满霞，等.中药889对人白血病粒细胞、肝癌细胞和绿猴肾细胞生长的影响.中国中医基础医学杂志，1998，4(10)：37
[5] 高玉民.大蒜油诱发瘤灶内中性粒细胞和巨噬细胞的超微结构观察.中国中西医结合杂志，1993，13(9)：546
[6] 高玉民，等.大蒜乳剂对小鼠S180腹水癌细胞作用的电镜和电镜细胞化学观察.中国解剖学报，23(2)：213
[7] 高玉民，等.大蒜油不同给药途径对癌周期移行过程的影响.中国组织化学与细胞化学杂志，1993，2(1)：37
(收稿日期 1998—09—13 修回日期 1998—11—20), 百拇医药
单位：王满霞 卢长安 孙 刚(中国中医研究院基础理论研究所 北京 100700)
关键词：大蒜；HIV-1；HSV-1；MTTassay； CPE
摘 要 目的 研究大蒜提取物GO889对人类免疫缺陷病毒1型 摘 要 目的 研究大蒜提取物GO889对人类免疫缺陷病毒1型(HIV—1)及其他与呼吸道感染有关病毒的作用。方法 采用MTT法及CPE法测定药物对病毒所致细胞病变的抑制作用。结果 GO889对HIV-1、HSV-1、HSV-2、ADA3、ADA7、COXB5、COXB6等病毒，有一定的抑制作用。结论 说明大蒜提取物GO889有较广的抗病毒谱，为临床用其治疗艾滋病及上呼吸道感染提供了参考依据。
Experimental Study on Anti-HIV and Other Viruses
, http://www.100md.com
by GO889,an Extract of Bulbus Allii
Wang manxia Lu changan Sun gang
(Institute of Basic Theory,China Academy of TCM,Beijing 100700)
Abstract:Objective:GO889 is an Extract of Bulbus Allii,in this paper,examined for its effects on human immunodeficiency virus type 1(HIV-1) and other viruses of infection respiratory.Methods:Determine the Inhibition of GO889 on cytopathic effect induced by viruses using MTT assay or CPE method in votro.Results:GO889,an extract of Bulbus Alii can inhibited cytopathic effect induced by HIV-1,HSV-1,HSV-2,ADA3,ADA7,CoxB5，CoxB6.Conclusions:Our studies indicates that GO889 is a broad-spectrum antiviral agent and recommended it to clinical treatment AIDS and respiratory infection.
, 百拇医药
Key words Bulbus Allii HIV-1 HSV-1 MTT assay CPE testosterone
文献报道大蒜有抑制HIV的作用，我们以往的工作证明其具有较强的抗肿瘤作用，本文在证实其抗HIV作用的同时，进一步研究了对其他与呼吸道感染有关病毒的作用。
材料和方法
细胞：MT-4细胞和Hep-2细胞由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。
病毒：人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、流感病毒甲3型(A3)副流感病毒(HVJ)、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)、腺病毒(ADA3和ADA7)、呼吸道合胞病毒(RS)、科萨奇病毒(Coxsackie B5和B6)等，均由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。经常规传代测定感染滴度(TCID50)后用于实验。
, 百拇医药
药物：大蒜GO889(批号：980224-2)提取物由本所制剂室制备。
试剂：所用的噻唑兰即MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide]，为美国进口试剂，以pH7.2 PBS配制成0.7 mg/ml溶液置4℃冰箱保存备用。
仪器：测定光密度所用酶标仪为法国生产的LP 400全自动酶标仪。
步骤：抗HIV-1实验和抗其他呼吸道感染病毒实验方法不尽相同。
1 抗HIV-1实验
参照文献[1]，简言之，将药样在96孔细胞板中用1640培养液倍比稀释，使各孔中保留100μl药液，向各孔加入50μl(含104个)MT-4细胞，再加入50μl 100TCID50的HIV-1病毒液。同时设正常细胞对照及病毒感染对照若干孔。置37℃ 5%CO2箱中培养。第3日各孔补2倍浓缩1640液20μl继续培养。第5日按MTT法染色测定光密度OD值。求出药物对HIV-1感染细胞的保护率。实验前先测定药物对MT-4细胞的毒性界限，求出50%细胞毒性浓度(CC50)。
, 百拇医药
2 抗呼吸道病毒实验
将Hep-2细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃，5% CO2中培养48h长成细胞单层，再将各药用Eagle's液作倍比稀释，加入细胞板中(每稀释加3孔)，设正常细胞对照若干孔，置相同条件下继续培养，于第3d观察结果，以出现“2+”(50%)及其以上细胞病变(CPE)作为毒性标准，找出亚毒性浓度(SC)，采用Reed-Muench法计算出药物对细胞的50%毒性浓度(CC50)。做抗病毒实验时以同样方法将无毒界限以下不同稀释度的药物加到板孔细胞单层上，每稀释度加3孔，再分别感染100 TCID50的各种病毒，置于37℃，5%CO2中培养，第3d观察细胞病变(CPE)。以出现CPE在“1+”(25%)及其以下的试验孔认为药物有抑制细胞病变的作用，以同法求出50%有效浓度(EC50)，计算治疗指数(TI=CC50/EC50)。
, 百拇医药
结果
1 抗HIV-1实验结果
实验前测定大蒜提取物GO889对MT-4细胞的CC50为0.89%，亚毒性浓度SC=0.625%。
大蒜提取物GO889对HIV-1的抑制作用见表1，其50%抑制浓度EC50为0.19%，最高保护率(抑制率)达94.76%，治疗指数TI=0.89/0.19=5。同时观察了CPE结果相近。
表1 大蒜提取物GO889对HIV-1感染MT-4细胞的保护作用
药物浓度(%)
OD均值
标准差(s)
, 百拇医药
保护率(%)
0.625
0.1857
0.0384
94.76
0.313
0.1453
0.0509
65.41
0.156
0.1067
0.0230
37.26
, 百拇医药
0.078
0.0807
0.0188
18.33
细胞对照
0.1928
0.0109
病毒对照
0.0555
0.0073
2 抗呼吸道病毒实验结果
按上述方法测得大蒜提取物GO889对Hep-2细胞的毒性果为CC50=0.89%，亚毒性浓度SC=0.625%，对各种病毒所致细胞病变(CPE)的作用见表2。
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表2 大蒜提取物GO889对常见呼吸道病毒的作用
病毒
感染量
TCID50
MIC
CC50=0.89%
EC50
TI
A3
100
—
, 百拇医药 —
—
HVJ
100
—
—
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RS
100
—
—
—
COXB5
100
, http://www.100md.com
0.078%
0.102%
9
COXB6
100
0.078%
0.048%
19
ADA3
100
0.156%
0.112%
, 百拇医药
8
ADA7
100
0.313%
0.220%
4
HSV-1
100
0.156%
0.112%
8
HSV-2
100
, 百拇医药
0.156%
0.112%
8
结果可见大蒜提取物GO889对流感甲3型(A3)、副流感(HVJ)和呼吸道合病毒(RS)未显示出活性，而对疱疹病毒1，2型(HSV-1，HSV-2)、腺病毒3，7型(ADA3，ADA7)、科萨奇B5，B6型(Coxsackie B5，B6)具有不同程度的抑制作用，且多数治疗指数较高(8～19)。讨论
大蒜性味辛温，能消肿、解毒、杀虫，临床用于痈疖肿毒，癣疮，肺痨等。药理研究证明其具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、保肝、降压、降血糖、杀精等多种作用[2]。另据资料载大蒜尚具有抗HIV的作用[3]，我们以往的工作也证实其具有较强的抑制肿瘤细胞的作用，对人白血病粒细胞和肝癌细胞生长的抑制率分别为69.21%和75.94%，与对照组相比P<0.01[4-7]。文献[2]仅载大蒜有抗巨细胞病毒(CMV)作用，为探讨大蒜的抗病毒谱，我们进行了以上研究，结果表明，我所制剂室制备的大蒜提取物不仅对HIV-1有一定的抑制作用，而且还发现对单纯疱疹病毒1，2型(HSV-1，HSV-2)、腺病毒3，7型(ADA3，ADA7)、科萨奇病毒B5，B6型(Coxsackie B5，B6)等多种与呼吸道感染有关病毒具有一定的抑制作用。其作用强度不尽相同，对HIV-1的治疗指数较低，对其他病毒多数表显为治疗指数较高。这些结果为临床用药和新药开发会提供一些参考依据。
, 百拇医药
作者简介：王满霞，女，44岁，中国中医研究院基础理论研究所P3实验室副研究员，从事中药抗艾滋病病毒研究工作。地址：北京市东直门内北新仑18号电话：64014411-2645 邮编：100700
参考文献
[1] 卢长安，等.MTT法在抗HIV药物研究中的应用.中国中医基础医学杂志，1998，4(9)：23
[2] 黄泰康.常用中药成分与药理手册.第一版.北京：中国医药科技出版社，1994.328
[3] 吕维柏.艾滋病中西医防治学.第一版.北京：人民卫生出版社，1994.164
[4] 王满霞，等.中药889对人白血病粒细胞、肝癌细胞和绿猴肾细胞生长的影响.中国中医基础医学杂志，1998，4(10)：37
[5] 高玉民.大蒜油诱发瘤灶内中性粒细胞和巨噬细胞的超微结构观察.中国中西医结合杂志，1993，13(9)：546
[6] 高玉民，等.大蒜乳剂对小鼠S180腹水癌细胞作用的电镜和电镜细胞化学观察.中国解剖学报，23(2)：213
[7] 高玉民，等.大蒜油不同给药途径对癌周期移行过程的影响.中国组织化学与细胞化学杂志，1993，2(1)：37
(收稿日期 1998—09—13 修回日期 1998—11—20), 百拇医药