雄黄诱导K562细胞凋亡的研究
作者：张 晨 黄世林 卢步峰 于丽敏
单位：张 晨 黄世林(中国人民解放军210医院血液病中医研究所 大连 116021)；卢步峰 于丽敏(大连医科大学组胚教研室 大连 116027)
关键词：雄黄；凋亡；K562细胞
摘 要 目的 检测雄黄诱导K562细胞的能力 摘 要 目的 检测雄黄诱导K562细胞的能力。方法 应用形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡。利用FCM分析细胞周期并测定K562细胞线粒体膜APO2.7蛋白表达。结果 雄黄可以诱导K562细胞产生凋亡现象，并导致S期细胞降低。结论 雄黄具有诱导K562细胞凋亡的作用。
Realgar Induces Apoptosis in K562 Cells
, http://www.100md.com
Zhang Chen Huang Shilin
(Institute of Chinese Tradition al Mdical Hematology,The 210trh hospital,Dlalian 116021)
Abstract:Objective:To investigate the apoplosis of K562 cells induced by realgar.Methods:Apoptosis was detected by morphological observation DNA gel electrophoresis and flow cytometric cell cycle analysis.APO2.7 expression was detected by flow cytometery.Results: Realgar induced K562 cells into sub-G1 cells and significantly decreased S phase cells.Conclusion:Realgar can induce apoptosis in K562 cells.
, 百拇医药
Key words Realgar Apoptosis K562 cell
慢性髓细胞白血病(CML)是由ph染色体，即t(9;22)易位导致融合基因bcr/abl的形成所致。采用中药雄黄治疗CML国内已有报告，如周霭祥[1]等所用的青黄散(青黛、雄黄)。近年来，有学者报告某些砷化合物能有效地治疗急性早幼粒细胞白血病，且有促细胞凋亡效应[2，3]。最近我们研究所报告了雄黄诱导NB4和HL-60细胞的凋亡情况[4]，在此基础上，采用雄黄处理K562细胞，体外观察其对CML细胞系的诱导凋亡作用。
材料和方法
1 制剂 1%雄黄溶液由本研究所制备，以磷酸盐缓冲液配制成储存液。
2 细胞培养与细胞形态 以2×105/ml的K562细胞接种于新鲜RPMI 1640完全培养基中，37℃，5%CO2孵育。取对数生长期细胞，经不同浓度雄黄处理后，细胞涂片，分别进行Wright染色和Hoechst 33342(8μg/ml)荧光染色，镜下观察细胞形态与凋亡情况。
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3 流式细胞仪(FCM)检测 各实验组中分别取1×106个细胞，PBS洗涤，70%冷乙醇固定，4℃过夜，离心去除乙醇，用100μg/ml RNA酶消化，50μg/ml碘化丙锭染色30分钟，FCM(Coulter EPICS XL型)测定细胞周期和细胞凋亡。
4 APO 2.7蛋白表达，收集106个细胞，PE标记的APO 2.7蛋白单克隆抗体直标法染色，PE标记的非特异性鼠的IgG1作阴性对照(均为1mmunotech公司产品)，FCM检测。
5 DNA凝胶电泳 细胞经雄黄处理后，加入1ml裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl PH 8.0，10mmol/L EDTA PH8.0,75mmol/L NaCl,0.5% SDS,0.15mg/ml蛋白酶K)，离心取上清加入0.5mol/L NaCl和50%乙醇使DNA沉淀，沉淀再溶于适量TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl PH8.0,1mmol/L EDTA PH8.0)，65℃水浴1h，然后加入200μg/ml RNA酶，37℃水浴2h，1.5%琼脂糖凝胶上电泳1h，Hae-III酶解的pGEM-TZf(+)DNA作分子标志。紫外灯下、摄片。
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结果
1 细胞形态变化 K562细胞经雄黄处理后，12h部分细胞出现凋亡，呈现细胞萎缩，发芽、出泡、核边集；当继续作用36h后，凋亡细胞量增多，细胞核形态多样化，染色质凝集，荧光染色增强(图1)。
图1 雄黄120μg/ml处理K562细胞36h(箭头所示为凋亡细胞，Hoechst33342染色，×100)
2 FCM鉴定凋亡细胞 乙醇固定细胞使细胞膜通透，降解的DNA释放至细胞外，产生亚二倍体细胞峰，这种低于G1期DNA含量的亚二倍体细胞为凋亡细胞。K562细胞经雄黄处理36h后，S期细胞显著减少，G2/M期细胞升高，形成低于G1期的亚二倍体细胞。雄黄浓度分别为30、60、120、150、210μg/ml，K562细胞的凋亡率分别为7.0%、13.6%、15.9%、9.1%和3.2%。
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3 APO2.7的表达 APO2.7是一种新的定量凋亡细胞的标志物，它能与38KDa的线粒体膜蛋白反应，表达在细胞凋亡的早期，与细胞凋亡的分子瀑布相关[5]。经雄黄处理的K562细胞明显地表达APO2.7蛋白(图2)。
图2 经雄黄处理后K562细胞APO2.7的表达
4 DNA电泳 雄黄处理K562细胞的DNA电泳出现明显阶梯状条带，而对照组细胞DNA电泳未发现阶梯状条带(图3)。
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图3 雄黄处理K562细胞电泳图(雄黄浓度分别为0、60、90、120μg/ml；M为分子标志)
讨论
细胞凋亡是一种主动的受基因调控的细胞自杀过程。许多药物通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程而最终触发肿瘤细胞的凋亡。某些中药具有损伤细胞DNA的细胞毒作用。如周霭祥[1]等报告具有解毒、化瘀、消积聚的青黄散对小鼠细胞的DNA、RNA有明显的抑制作用。我们研究发现，K562细胞经雄黄处理后，细胞形态上表现出细胞凋亡的特征，FCM检测S期细胞减少，出现了亚二倍体细胞群，DNA电泳证实了DNA片段的存在。
临床上CML对一般传统的化疗药物耐受，这种多药耐药机制极其复杂，已知药物与靶细胞的相互作用及靶细胞对DNA损伤的反应尤为重要。细胞受到DNA损伤剂作用后，若失去启动凋亡的能力，则对放化疗产生耐受，CML慢性期对多种药物的耐受很可能与bcr/abl抑制细胞凋亡有关[6]。本实验结果显示雄黄具有一定的诱导K562细胞凋亡的效应。但雄黄通过何种途径诱导K562细胞凋亡有待于深入研究。
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作者简介：张晨，男，35岁。医学硕士，主治医师。现在大连210医院血液病中医研究所工作，主要从事中医血液病临床及流式细胞仪的检测工作。
参考文献
[1] 周霭祥，姚宝森，郑金福.青黄散治疗慢性粒细胞白血病25例近期疗效观察.中西医结合杂志，1981，1(1)：16～18
[2] 黄世林，郭爱霞，向阳，等.复方青黛片为主治疗急性早幼粒细胞白血病的临床研究.中华血液学杂志，1995，16(1)：26～28
[3] 张鹏，胡龙虎，周晋，等.三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的机制研究.白血病，1996，5(3)：131～133
[4] 白月辉，黄世林.雄黄对NB4及HL-60细胞的促凋亡作用.中华血液学杂志，1998，19(9)：477～480
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[5] Zhang C.,A O Z.,Seth A.,et al.A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells.J,Immunol,1996,in press.3980～3987
[6] Bedi A.Barber JP.,Bedi GC.,et al.BCR-ABL mediated inhibition of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA damage:a mechanism of resistence to multiple anticancer agents.Blood,1995,86:1148
(收稿日期 1998—02—24 修回日期 1998—11—12), http://www.100md.com
单位：张 晨 黄世林(中国人民解放军210医院血液病中医研究所 大连 116021)；卢步峰 于丽敏(大连医科大学组胚教研室 大连 116027)
关键词：雄黄；凋亡；K562细胞
摘 要 目的 检测雄黄诱导K562细胞的能力 摘 要 目的 检测雄黄诱导K562细胞的能力。方法 应用形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡。利用FCM分析细胞周期并测定K562细胞线粒体膜APO2.7蛋白表达。结果 雄黄可以诱导K562细胞产生凋亡现象，并导致S期细胞降低。结论 雄黄具有诱导K562细胞凋亡的作用。
Realgar Induces Apoptosis in K562 Cells
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Zhang Chen Huang Shilin
(Institute of Chinese Tradition al Mdical Hematology,The 210trh hospital,Dlalian 116021)
Abstract:Objective:To investigate the apoplosis of K562 cells induced by realgar.Methods:Apoptosis was detected by morphological observation DNA gel electrophoresis and flow cytometric cell cycle analysis.APO2.7 expression was detected by flow cytometery.Results: Realgar induced K562 cells into sub-G1 cells and significantly decreased S phase cells.Conclusion:Realgar can induce apoptosis in K562 cells.
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Key words Realgar Apoptosis K562 cell
慢性髓细胞白血病(CML)是由ph染色体，即t(9;22)易位导致融合基因bcr/abl的形成所致。采用中药雄黄治疗CML国内已有报告，如周霭祥[1]等所用的青黄散(青黛、雄黄)。近年来，有学者报告某些砷化合物能有效地治疗急性早幼粒细胞白血病，且有促细胞凋亡效应[2，3]。最近我们研究所报告了雄黄诱导NB4和HL-60细胞的凋亡情况[4]，在此基础上，采用雄黄处理K562细胞，体外观察其对CML细胞系的诱导凋亡作用。
材料和方法
1 制剂 1%雄黄溶液由本研究所制备，以磷酸盐缓冲液配制成储存液。
2 细胞培养与细胞形态 以2×105/ml的K562细胞接种于新鲜RPMI 1640完全培养基中，37℃，5%CO2孵育。取对数生长期细胞，经不同浓度雄黄处理后，细胞涂片，分别进行Wright染色和Hoechst 33342(8μg/ml)荧光染色，镜下观察细胞形态与凋亡情况。
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3 流式细胞仪(FCM)检测 各实验组中分别取1×106个细胞，PBS洗涤，70%冷乙醇固定，4℃过夜，离心去除乙醇，用100μg/ml RNA酶消化，50μg/ml碘化丙锭染色30分钟，FCM(Coulter EPICS XL型)测定细胞周期和细胞凋亡。
4 APO 2.7蛋白表达，收集106个细胞，PE标记的APO 2.7蛋白单克隆抗体直标法染色，PE标记的非特异性鼠的IgG1作阴性对照(均为1mmunotech公司产品)，FCM检测。
5 DNA凝胶电泳 细胞经雄黄处理后，加入1ml裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl PH 8.0，10mmol/L EDTA PH8.0,75mmol/L NaCl,0.5% SDS,0.15mg/ml蛋白酶K)，离心取上清加入0.5mol/L NaCl和50%乙醇使DNA沉淀，沉淀再溶于适量TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl PH8.0,1mmol/L EDTA PH8.0)，65℃水浴1h，然后加入200μg/ml RNA酶，37℃水浴2h，1.5%琼脂糖凝胶上电泳1h，Hae-III酶解的pGEM-TZf(+)DNA作分子标志。紫外灯下、摄片。
, 百拇医药
结果
1 细胞形态变化 K562细胞经雄黄处理后，12h部分细胞出现凋亡，呈现细胞萎缩，发芽、出泡、核边集；当继续作用36h后，凋亡细胞量增多，细胞核形态多样化，染色质凝集，荧光染色增强(图1)。
图1 雄黄120μg/ml处理K562细胞36h(箭头所示为凋亡细胞，Hoechst33342染色，×100)
2 FCM鉴定凋亡细胞 乙醇固定细胞使细胞膜通透，降解的DNA释放至细胞外，产生亚二倍体细胞峰，这种低于G1期DNA含量的亚二倍体细胞为凋亡细胞。K562细胞经雄黄处理36h后，S期细胞显著减少，G2/M期细胞升高，形成低于G1期的亚二倍体细胞。雄黄浓度分别为30、60、120、150、210μg/ml，K562细胞的凋亡率分别为7.0%、13.6%、15.9%、9.1%和3.2%。
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3 APO2.7的表达 APO2.7是一种新的定量凋亡细胞的标志物，它能与38KDa的线粒体膜蛋白反应，表达在细胞凋亡的早期，与细胞凋亡的分子瀑布相关[5]。经雄黄处理的K562细胞明显地表达APO2.7蛋白(图2)。
图2 经雄黄处理后K562细胞APO2.7的表达
4 DNA电泳 雄黄处理K562细胞的DNA电泳出现明显阶梯状条带，而对照组细胞DNA电泳未发现阶梯状条带(图3)。
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图3 雄黄处理K562细胞电泳图(雄黄浓度分别为0、60、90、120μg/ml；M为分子标志)
讨论
细胞凋亡是一种主动的受基因调控的细胞自杀过程。许多药物通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程而最终触发肿瘤细胞的凋亡。某些中药具有损伤细胞DNA的细胞毒作用。如周霭祥[1]等报告具有解毒、化瘀、消积聚的青黄散对小鼠细胞的DNA、RNA有明显的抑制作用。我们研究发现，K562细胞经雄黄处理后，细胞形态上表现出细胞凋亡的特征，FCM检测S期细胞减少，出现了亚二倍体细胞群，DNA电泳证实了DNA片段的存在。
临床上CML对一般传统的化疗药物耐受，这种多药耐药机制极其复杂，已知药物与靶细胞的相互作用及靶细胞对DNA损伤的反应尤为重要。细胞受到DNA损伤剂作用后，若失去启动凋亡的能力，则对放化疗产生耐受，CML慢性期对多种药物的耐受很可能与bcr/abl抑制细胞凋亡有关[6]。本实验结果显示雄黄具有一定的诱导K562细胞凋亡的效应。但雄黄通过何种途径诱导K562细胞凋亡有待于深入研究。
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作者简介：张晨，男，35岁。医学硕士，主治医师。现在大连210医院血液病中医研究所工作，主要从事中医血液病临床及流式细胞仪的检测工作。
参考文献
[1] 周霭祥，姚宝森，郑金福.青黄散治疗慢性粒细胞白血病25例近期疗效观察.中西医结合杂志，1981，1(1)：16～18
[2] 黄世林，郭爱霞，向阳，等.复方青黛片为主治疗急性早幼粒细胞白血病的临床研究.中华血液学杂志，1995，16(1)：26～28
[3] 张鹏，胡龙虎，周晋，等.三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病的机制研究.白血病，1996，5(3)：131～133
[4] 白月辉，黄世林.雄黄对NB4及HL-60细胞的促凋亡作用.中华血液学杂志，1998，19(9)：477～480
, http://www.100md.com
[5] Zhang C.,A O Z.,Seth A.,et al.A mitochondrial membrane protein defined by a novel monoclonal antibody is preferentially detected in apoptotic cells.J,Immunol,1996,in press.3980～3987
[6] Bedi A.Barber JP.,Bedi GC.,et al.BCR-ABL mediated inhibition of apoptosis with delay of G2/M transition after DNA damage:a mechanism of resistence to multiple anticancer agents.Blood,1995,86:1148
(收稿日期 1998—02—24 修回日期 1998—11—12), http://www.100md.com