中药复方制剂免疫抗病毒性心肌炎的实验研究
作者：孙 寒 孙 非 张淑芹 刘志屹 闫 琪 于起福
单位：孙 寒 孙 非 张淑芹 刘志屹(白求恩医科大学 长春 130021)；闫 琪 于起福(长春中医学院 长春 130021)
关键词：中药；复方制剂；病毒性心肌炎
中国中医基础医学杂志990312 摘 要 目的 研究高山红景天复方制剂对病毒性心肌炎小鼠模型的影响，探讨该方的药理作用机理。方法 采用免疫学和抗氧化酶活性分析技术。结果 高山红景天复方制剂具有提高病毒性心肌炎小鼠模型及培养细胞中IFN-γ水平的作用；它可使模型小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性增强；心肌SOD和GSH-Px活性升高，同时降低血清中LP0含量。证明，高山红景天复方制剂具有调节鼠心肌炎模型免疫功能及抗氧化酶活性的作用。提示：对免疫机制的调节和体内氧自由基的快速清除是高山红景天复方制剂治疗病毒性心肌炎的途径之一。
, 百拇医药
病毒性心肌炎的免疫治疗近年来已取得较大进展[1]，特别是应用中草药的有效成分，通过调节机体的免疫机能而达到对病毒性心肌炎的有效治疗，被证明是有相当发展前景的[2]。我们已通过大量的实验证明高山红景天及其复方制剂对柯萨奇B组病毒在宿主细胞内的繁殖有抑制作用[3，4]。为了深入探讨高山红景天及其复方制剂对病毒性心肌炎的治疗机理，我们利用BALB/c小鼠建立了病毒性心肌炎动物模型，并对其免疫治疗病毒性心肌炎的实验机制进行了研究，目的在于全面阐明高山红景天复方制剂的药理作用机制。
材料与方法
1 材料
1.1 细胞 非洲绿猴肾细胞(Vero)，本室保存。
1.2 病毒株 柯萨奇B3病毒(Nancy)株(Coxsackie B virus)，本室保存。
, 百拇医药
1.3 动物 雄性BALB/c纯系小鼠，平均体重14g，购于白求恩医科大学实验动物中心。
1.4 试剂 3H-TdR，中国科学院原子能研究所；IFN-γ试剂盒，北京中山试剂公司；Con-A、SOD均为Sigma公司产品；RPMI-1640培养液，美国Gibco公司；小牛血清(FSC)大连生化试剂厂产品。
1.5 受试药物 高山红景天、人参、黄芪、麦冬、五味子和苦参共6味中草药，均购于市医药公司。复方制剂的制备参照文献[4]进行。
2 实验方法
2.1 实验分组及动物模型的建立 实验设正常对照组，每日用0.2ml生理盐水灌胃；病毒对照组，实验前一周由腹腔注射100TCID50柯萨奇B3病毒液0.1ml，连续3d，实验开始后，每日用0.2ml生理盐水灌胃；实验组，病毒模型制造同病毒对照组，每日用制备好的高山红景天复方制剂灌胃，剂量为0.1g/kg，相当于临床使用剂量的4倍。实验期为30d。
, 百拇医药
2.2 IFN-γ检测 兔抗IFN-γ抗体(IgG)100μl/孔，置37℃温育2h，洗涤；分别加入IFN-γ标准品和实验样品100μ1/孔，37℃温育1h，洗涤；加生物素化单抗100μ1/孔37℃温育45min，洗涤；终止反应，测定492nm的OD值，计算各组含量。
2.3 淋巴细胞增殖试验 制备4×106/ml小鼠脾脏淋巴细胞悬液，用10%FCS-RPMI1640培养液于96孔培养板2×106/ml培养，加入终浓度10μg/ml Con-A，37℃、5%CO2培养48h，终止反应前6h，加入3H-TdR10μ Ci/ml 25μl，部分细胞收集器收集细胞，洗涤，用液闪仪测定CPM。刺激指数(SI)=实验组CPM/对照组CPM。
2.4 脾脏NK细胞活性检测 靶细胞为Yac-1淋巴细胞瘤，10%FCS-RPMI1640饲养，调整细胞浓度为1×106/ml，加入10-3mol3H-TdR，终浓度为5μCi/ml/孔。置37℃、5%CO2培养4h，备用。效应细胞采用小鼠脾脏细胞，去除红细胞。效靶细胞的比较为200：1，培养18h，同时设自发释放管。最后用γ-射线计数仪测定各管的放射强度，计算细胞毒指数(%)[5]。
, http://www.100md.com
2.5 抗氧化酶活性和LP0含量检测 SOD活性测定采用肾上腺素自氧化法[6]；GSH-Px活性测定按文献[7]进行；LP0含量测定采用荧光分光光度法，激发波长为350nm，发射波长为460nm。
结果
1 高山红景天复方制剂对体外培养细胞和小鼠心肌炎模型IFN-γ水平的影响 实验表明(见表1)，高山红景天复方制剂不仅对体外培养的Vero细胞具有提高IFN-γ水平的作用，对利用BALB/c小鼠制做的心肌炎模型中IFN-γ的含量提高同样具有促进作用。在培养细胞中，复方制剂加药组比正常对照组高32.1%；比病毒对照组高170.5%。在小鼠心肌炎模型中，复方制剂治疗组与正常对照组差异不明显，但比病毒对照组提高了208.7%，差异极显著(P<0.001)。
2 高山红景天复方制剂对小鼠心肌炎模型NK细胞活性的影响 测定结果表明(见表1)，复方制剂治疗组NK细胞活性显著高于病毒对照组，为病毒对照组的3.4倍，与正常对照组未见明显差异。
, 百拇医药
表1 高山红景天复方制剂对心肌炎模型小鼠部分免疫指标的影响 Groups
Cell IFN-γ
(ng/ml)
Heart IFN-γ
(ng/g/wet wight)
SI
NK cell activity
(%)
Control
4.3±0.56
9.82±0.63
, http://www.100md.com
3.1±0.34
13.46±1.33
CoxB3V
2.10±0.34
3.10±0.34
0.8±0.06
4.51±0.74
CoxB3V+制剂
5.68±0.49**
9.57±0.66**
3.71±0.25**
, http://www.100md.com
15.37±1.87**
**同病毒对照组比较P<0.001 3 高山红景天复方制剂对小鼠心肌炎模型淋巴细胞增殖活性的影响 经高山红景天复方制剂治疗一定时间之后，模型淋巴细胞增殖活性明显增强，表现为刺激指数增高，与病毒对照组比较，差异极显著(P<0.001)。而复方制剂治疗组与正常对照组之间，淋巴细胞增殖活性差异不明显。
表2 高山红景天复方制剂对小鼠部分生化指标的影响 Groups
Heart SOD activity
(U/g/wet wight)
Heart GSH-Px activity
(U/g/wet wight)
, http://www.100md.com
Serum LDH activity
(IU/L)
Serum LP0 content
(mmol/L)
Control
0.43±0.011
5.77±1.21
432±45
20.21±0.43
CoxB3V
0.145±0.03
, 百拇医药
1.36±0.12
887±203
25.38±0.55
CoxB3V+制剂
0.51±0.015**
6.81±1.37**
487±91**
17.96±0.37**
**同病毒对照组比较：P<0.001
4 高山红景天复方制剂对小鼠心肌炎模型抗氧化酶活性的影响 病毒性心肌炎小鼠模型服用高山红景天复方制剂后，心肌细胞中的SOD和GSH-Px活性明显升高，模型小鼠血清中的LDH活性下降，血清LP0含量降低。与正常对照组比较，抗氧化酶活性变化不明显。
, http://www.100md.com
讨论
目前，对病毒性心肌炎的临床应用药物研究已经受到普遍重视，有一些研究报道，但都未应用于临床。而国内在中草药治疗药物研究方面也取得了一定研究进展。我们通过大量的实验组成了以高山红景天为君药的，用于治疗病毒性心肌炎的复方制剂。该复方制剂具有抑制柯萨奇B组病毒在宿主细胞中繁殖的作用。本实验中利用免疫学方法研究证明，高山红景天复方制剂对实验动物模型多种免疫功能均具有正向调节作用。
IFN-γ是一种广谱性抗病毒细胞因子。实验证明，IFN-γ使由柯萨奇B组病毒引发的病毒性心肌炎早期症状可以得到缓解[8]。所以，高山红景天复方制剂促进宿主细胞内IFN-γ含量的提高对机体心肌组织抵抗柯萨奇B组病毒感染及早期病毒性心肌炎的治愈是致关重要的。这一实验结果为高山红景天复方制剂对病毒性心肌炎的临床应用提供了有力的证据。
高山红景天复方制剂可以促进小鼠病毒性心肌炎模型淋巴细胞增殖。这种调节作用将增强模型淋巴细胞对抗原的免疫反应，从而显著提高病毒性心肌炎小鼠自身抗病毒感染的能力。近几年来的研究表明，在病毒性心肌炎的免疫治疗过程中，调节NK细胞活性是其最终治疗途径，许多细胞因子对病毒性心肌炎的治疗都是通过这一途径来完成的[9]。我们在实验中也发现，脾脏NK细胞的活性，特别是药物治疗组模型中，NK细胞活性明显升高，说明这一机制是存在的。
, http://www.100md.com
在炎症治愈过程中，自由基的消除将起到相当重要的作用。而自由基的消除主要依赖生物体内抗氧化酶系的作用。细胞毒性T细胞可以促进巨噬细胞积聚，从而对心肌纤维起到损伤作用，产生T细胞介导的免疫致心肌损害。在这一过程中，大量的超氧自由基离子在心肌细胞及其周围组织中积累，最终的结果是造成心肌细胞的直接损伤。而病毒性心肌炎模型小鼠体内发生的自身免疫现象，同样会产生大量的超氧自由基离子的积累。高山红景天复方制剂可以调节模型小鼠心肌细胞内的SOD和GSH-Px活性增强。结果对细胞内膜系统起到了有效的保护作用，使其过氧化损伤过程受到抑制。进一步阻止了自由基的协同损伤作用。小鼠血清中的LDH活性下降、LPO含量的降低，都证明这一机制的存在。
总之，高山红景天复方制剂治疗病毒性心肌炎的作用途径是多方面的，而免疫抗病毒作用机制在对病毒性心肌炎的治疗过程中，是重要的途径之一。
参考文献
[1] Maisch B.，Herzum M.,Hufnnagel G.et al.Immunsuppressiuer and Immunomodu Latory treatement for myocarditis.curr opin Cardio,1996 May;11(3)310—324
, http://www.100md.com
[2] 涂秀华，徐风琴，等.芪冬口服液治疗病毒性心肌炎的临床实验.中药新药与临床药理，1996，7(4)：6
[3] 孙非，于起福，孙寒，等.高山红景天多糖对病毒感染大鼠心肌细胞的抑制作用.中国药理学通报，1997，13(6)：525～8
[4] 孙非，于起福，张淑芹，等.中药复方制剂抗柯萨奇B组病毒的实验研究.中国中医基础医学杂志，1997，3(6)：30～2
[5] 龚守良.实用基础医学实验技术.长春：吉林科学技术出版社，1990：198～9
[6] 魏重琴，张菊娥，艾建芳，等.大鼠组织中铜锌及锰超氧化物岐化酶活性的比较.生物化学与生物物理进展，1993，20(2)：154～6
[7] 夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987,16(4):29～33
, 百拇医药
[8] Hiraoka Y;Kishimoto C;Takada H et al.Colony stimulating factors and coxsackie B3 myocarditis in mice:macrophage colony-stimulating factor supresses acute myocarditis with increasing interferon-alpha.Am.Heart J,1995 Dec,130(6):1259
[9] Kishimoto C;Kuroki K;Hiraoka Y et al.Cytokine and murine coxsackie virus B3 myocarditis.interleukin -2 supresses myocarditis in the acute stage but enhanced the condition in the swbsequent.Circulation,1994 Jun,89(6):2836
(收稿日期 1998—07—29 修回日期 1998—11—29), http://www.100md.com
单位：孙 寒 孙 非 张淑芹 刘志屹(白求恩医科大学 长春 130021)；闫 琪 于起福(长春中医学院 长春 130021)
关键词：中药；复方制剂；病毒性心肌炎
中国中医基础医学杂志990312 摘 要 目的 研究高山红景天复方制剂对病毒性心肌炎小鼠模型的影响，探讨该方的药理作用机理。方法 采用免疫学和抗氧化酶活性分析技术。结果 高山红景天复方制剂具有提高病毒性心肌炎小鼠模型及培养细胞中IFN-γ水平的作用；它可使模型小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性增强；心肌SOD和GSH-Px活性升高，同时降低血清中LP0含量。证明，高山红景天复方制剂具有调节鼠心肌炎模型免疫功能及抗氧化酶活性的作用。提示：对免疫机制的调节和体内氧自由基的快速清除是高山红景天复方制剂治疗病毒性心肌炎的途径之一。
, 百拇医药
病毒性心肌炎的免疫治疗近年来已取得较大进展[1]，特别是应用中草药的有效成分，通过调节机体的免疫机能而达到对病毒性心肌炎的有效治疗，被证明是有相当发展前景的[2]。我们已通过大量的实验证明高山红景天及其复方制剂对柯萨奇B组病毒在宿主细胞内的繁殖有抑制作用[3，4]。为了深入探讨高山红景天及其复方制剂对病毒性心肌炎的治疗机理，我们利用BALB/c小鼠建立了病毒性心肌炎动物模型，并对其免疫治疗病毒性心肌炎的实验机制进行了研究，目的在于全面阐明高山红景天复方制剂的药理作用机制。
材料与方法
1 材料
1.1 细胞 非洲绿猴肾细胞(Vero)，本室保存。
1.2 病毒株 柯萨奇B3病毒(Nancy)株(Coxsackie B virus)，本室保存。
, 百拇医药
1.3 动物 雄性BALB/c纯系小鼠，平均体重14g，购于白求恩医科大学实验动物中心。
1.4 试剂 3H-TdR，中国科学院原子能研究所；IFN-γ试剂盒，北京中山试剂公司；Con-A、SOD均为Sigma公司产品；RPMI-1640培养液，美国Gibco公司；小牛血清(FSC)大连生化试剂厂产品。
1.5 受试药物 高山红景天、人参、黄芪、麦冬、五味子和苦参共6味中草药，均购于市医药公司。复方制剂的制备参照文献[4]进行。
2 实验方法
2.1 实验分组及动物模型的建立 实验设正常对照组，每日用0.2ml生理盐水灌胃；病毒对照组，实验前一周由腹腔注射100TCID50柯萨奇B3病毒液0.1ml，连续3d，实验开始后，每日用0.2ml生理盐水灌胃；实验组，病毒模型制造同病毒对照组，每日用制备好的高山红景天复方制剂灌胃，剂量为0.1g/kg，相当于临床使用剂量的4倍。实验期为30d。
, 百拇医药
2.2 IFN-γ检测 兔抗IFN-γ抗体(IgG)100μl/孔，置37℃温育2h，洗涤；分别加入IFN-γ标准品和实验样品100μ1/孔，37℃温育1h，洗涤；加生物素化单抗100μ1/孔37℃温育45min，洗涤；终止反应，测定492nm的OD值，计算各组含量。
2.3 淋巴细胞增殖试验 制备4×106/ml小鼠脾脏淋巴细胞悬液，用10%FCS-RPMI1640培养液于96孔培养板2×106/ml培养，加入终浓度10μg/ml Con-A，37℃、5%CO2培养48h，终止反应前6h，加入3H-TdR10μ Ci/ml 25μl，部分细胞收集器收集细胞，洗涤，用液闪仪测定CPM。刺激指数(SI)=实验组CPM/对照组CPM。
2.4 脾脏NK细胞活性检测 靶细胞为Yac-1淋巴细胞瘤，10%FCS-RPMI1640饲养，调整细胞浓度为1×106/ml，加入10-3mol3H-TdR，终浓度为5μCi/ml/孔。置37℃、5%CO2培养4h，备用。效应细胞采用小鼠脾脏细胞，去除红细胞。效靶细胞的比较为200：1，培养18h，同时设自发释放管。最后用γ-射线计数仪测定各管的放射强度，计算细胞毒指数(%)[5]。
, http://www.100md.com
2.5 抗氧化酶活性和LP0含量检测 SOD活性测定采用肾上腺素自氧化法[6]；GSH-Px活性测定按文献[7]进行；LP0含量测定采用荧光分光光度法，激发波长为350nm，发射波长为460nm。
结果
1 高山红景天复方制剂对体外培养细胞和小鼠心肌炎模型IFN-γ水平的影响 实验表明(见表1)，高山红景天复方制剂不仅对体外培养的Vero细胞具有提高IFN-γ水平的作用，对利用BALB/c小鼠制做的心肌炎模型中IFN-γ的含量提高同样具有促进作用。在培养细胞中，复方制剂加药组比正常对照组高32.1%；比病毒对照组高170.5%。在小鼠心肌炎模型中，复方制剂治疗组与正常对照组差异不明显，但比病毒对照组提高了208.7%，差异极显著(P<0.001)。
2 高山红景天复方制剂对小鼠心肌炎模型NK细胞活性的影响 测定结果表明(见表1)，复方制剂治疗组NK细胞活性显著高于病毒对照组，为病毒对照组的3.4倍，与正常对照组未见明显差异。
, 百拇医药
表1 高山红景天复方制剂对心肌炎模型小鼠部分免疫指标的影响 Groups
Cell IFN-γ
(ng/ml)
Heart IFN-γ
(ng/g/wet wight)
SI
NK cell activity
(%)
Control
4.3±0.56
9.82±0.63
, http://www.100md.com
3.1±0.34
13.46±1.33
CoxB3V
2.10±0.34
3.10±0.34
0.8±0.06
4.51±0.74
CoxB3V+制剂
5.68±0.49**
9.57±0.66**
3.71±0.25**
, http://www.100md.com
15.37±1.87**
**同病毒对照组比较P<0.001 3 高山红景天复方制剂对小鼠心肌炎模型淋巴细胞增殖活性的影响 经高山红景天复方制剂治疗一定时间之后，模型淋巴细胞增殖活性明显增强，表现为刺激指数增高，与病毒对照组比较，差异极显著(P<0.001)。而复方制剂治疗组与正常对照组之间，淋巴细胞增殖活性差异不明显。
表2 高山红景天复方制剂对小鼠部分生化指标的影响 Groups
Heart SOD activity
(U/g/wet wight)
Heart GSH-Px activity
(U/g/wet wight)
, http://www.100md.com
Serum LDH activity
(IU/L)
Serum LP0 content
(mmol/L)
Control
0.43±0.011
5.77±1.21
432±45
20.21±0.43
CoxB3V
0.145±0.03
, 百拇医药
1.36±0.12
887±203
25.38±0.55
CoxB3V+制剂
0.51±0.015**
6.81±1.37**
487±91**
17.96±0.37**
**同病毒对照组比较：P<0.001
4 高山红景天复方制剂对小鼠心肌炎模型抗氧化酶活性的影响 病毒性心肌炎小鼠模型服用高山红景天复方制剂后，心肌细胞中的SOD和GSH-Px活性明显升高，模型小鼠血清中的LDH活性下降，血清LP0含量降低。与正常对照组比较，抗氧化酶活性变化不明显。
, http://www.100md.com
讨论
目前，对病毒性心肌炎的临床应用药物研究已经受到普遍重视，有一些研究报道，但都未应用于临床。而国内在中草药治疗药物研究方面也取得了一定研究进展。我们通过大量的实验组成了以高山红景天为君药的，用于治疗病毒性心肌炎的复方制剂。该复方制剂具有抑制柯萨奇B组病毒在宿主细胞中繁殖的作用。本实验中利用免疫学方法研究证明，高山红景天复方制剂对实验动物模型多种免疫功能均具有正向调节作用。
IFN-γ是一种广谱性抗病毒细胞因子。实验证明，IFN-γ使由柯萨奇B组病毒引发的病毒性心肌炎早期症状可以得到缓解[8]。所以，高山红景天复方制剂促进宿主细胞内IFN-γ含量的提高对机体心肌组织抵抗柯萨奇B组病毒感染及早期病毒性心肌炎的治愈是致关重要的。这一实验结果为高山红景天复方制剂对病毒性心肌炎的临床应用提供了有力的证据。
高山红景天复方制剂可以促进小鼠病毒性心肌炎模型淋巴细胞增殖。这种调节作用将增强模型淋巴细胞对抗原的免疫反应，从而显著提高病毒性心肌炎小鼠自身抗病毒感染的能力。近几年来的研究表明，在病毒性心肌炎的免疫治疗过程中，调节NK细胞活性是其最终治疗途径，许多细胞因子对病毒性心肌炎的治疗都是通过这一途径来完成的[9]。我们在实验中也发现，脾脏NK细胞的活性，特别是药物治疗组模型中，NK细胞活性明显升高，说明这一机制是存在的。
, http://www.100md.com
在炎症治愈过程中，自由基的消除将起到相当重要的作用。而自由基的消除主要依赖生物体内抗氧化酶系的作用。细胞毒性T细胞可以促进巨噬细胞积聚，从而对心肌纤维起到损伤作用，产生T细胞介导的免疫致心肌损害。在这一过程中，大量的超氧自由基离子在心肌细胞及其周围组织中积累，最终的结果是造成心肌细胞的直接损伤。而病毒性心肌炎模型小鼠体内发生的自身免疫现象，同样会产生大量的超氧自由基离子的积累。高山红景天复方制剂可以调节模型小鼠心肌细胞内的SOD和GSH-Px活性增强。结果对细胞内膜系统起到了有效的保护作用，使其过氧化损伤过程受到抑制。进一步阻止了自由基的协同损伤作用。小鼠血清中的LDH活性下降、LPO含量的降低，都证明这一机制的存在。
总之，高山红景天复方制剂治疗病毒性心肌炎的作用途径是多方面的，而免疫抗病毒作用机制在对病毒性心肌炎的治疗过程中，是重要的途径之一。
参考文献
[1] Maisch B.，Herzum M.,Hufnnagel G.et al.Immunsuppressiuer and Immunomodu Latory treatement for myocarditis.curr opin Cardio,1996 May;11(3)310—324
, http://www.100md.com
[2] 涂秀华，徐风琴，等.芪冬口服液治疗病毒性心肌炎的临床实验.中药新药与临床药理，1996，7(4)：6
[3] 孙非，于起福，孙寒，等.高山红景天多糖对病毒感染大鼠心肌细胞的抑制作用.中国药理学通报，1997，13(6)：525～8
[4] 孙非，于起福，张淑芹，等.中药复方制剂抗柯萨奇B组病毒的实验研究.中国中医基础医学杂志，1997，3(6)：30～2
[5] 龚守良.实用基础医学实验技术.长春：吉林科学技术出版社，1990：198～9
[6] 魏重琴，张菊娥，艾建芳，等.大鼠组织中铜锌及锰超氧化物岐化酶活性的比较.生物化学与生物物理进展，1993，20(2)：154～6
[7] 夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987,16(4):29～33
, 百拇医药
[8] Hiraoka Y;Kishimoto C;Takada H et al.Colony stimulating factors and coxsackie B3 myocarditis in mice:macrophage colony-stimulating factor supresses acute myocarditis with increasing interferon-alpha.Am.Heart J,1995 Dec,130(6):1259
[9] Kishimoto C;Kuroki K;Hiraoka Y et al.Cytokine and murine coxsackie virus B3 myocarditis.interleukin -2 supresses myocarditis in the acute stage but enhanced the condition in the swbsequent.Circulation,1994 Jun,89(6):2836
(收稿日期 1998—07—29 修回日期 1998—11—29), http://www.100md.com