流式细胞仪检测细胞体积及RNA／DNA比值
作者：刘栋 刘志红
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：流式细胞仪；细胞体积；RNA/DNA比值
肾脏病与透析肾移植杂志990328
细胞体积和RNA/DNA比值是细胞生物学研究中的两个重要参数。它们可以反映细胞是否肥大，RNA/DNA比值还可以更加精细地区分细胞周期各时相。而如何快速大量地测量细胞体积以及RNA/DNA比值，长期以来一直是困扰我们的一个问题。随着流式细胞仪检测技术的日趋成熟，这个问题逐步得到了解决。在本文中作者应用流式细胞仪前向角散射光(forward side scatter，FSC)强度同细胞大小成正比的特性来检测细胞体积；应用两种荧光染料派若宁Y(Pyronine Y，PY)和7-氨基-放线菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)对RNA、DNA的不同染色特性来检测RNA/DNA比值。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞 取培养的70%融合的人肾小球系膜细胞，洗去培养液后，加0.25%胰酶2ml消化5～8min(37℃)，小牛血清终止消化，吸管小心吹打，过300目尼龙网筛，使其成为单细胞悬液。磷酸盐缓冲液(含5%牛血清白蛋白)洗涤2次，将细胞浓度调至109/L待用。
1.2 试剂 DMEM/F12(GIBCO)培养液[1]。7-AAD，PY及皂素(Saponin)均购自美国Sigma公司。
1.3 仪器 Epics-XL型流式细胞仪(美国Coulter公司)，488nm氩离子激光器。
1.4 细胞体积的检测 细胞在从流式细胞仪喷嘴成单行喷出时，受到激光的照射会发生对光的散射。其中FSC主要与细胞的体积成正比，即细胞体积越大，散射光也越强。
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取上述细胞悬液0.5ml，混匀后上流式细胞仪计数10000个细胞进行检测，同时计算FSC的平均强度[2]。
1.5 RNA/DNA比值的检测 7-AAD可插入DNA的GC碱基对与之结合，经氩离子激光器激发，发射波长为647nm左右的荧光。PY既可以和RNA结合又可以和DNA结合，用7-AAD充分饱和DNA后，再加入PY就只与RNA结合。经氩离子激光器激发后，可发出波长为547 nm左右的荧光。
取上述细胞悬液1ml，离心去上清，10 mmol/L HEPES缓冲液(含0.1%叠氮钠，4%胎牛血清)洗两遍(1000转，3min)，再次弃上清，每管加入1ml磷酸盐枸橼酸缓冲液(含0.15mmol/L氯化纳，5 mmol/L EDTA-2Na+，0.5%牛血清白蛋白，0.02%皂素)室温孵育30min后，再加入25.5μ1 7-AAD染液(浓度为1g/L)，室温下避光放置30min，同上用缓冲液洗涤2次。充分悬浮细胞，冰浴10min后加入50μlPY染液(浓度为100 μmol/L)，再冰浴10min，同上用缓冲液洗涤2次后经流式细胞仪检测[3]。
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2 结果
对体外培养的肾小球系膜细胞FSC平均强度以及7-AAD和PY双染后荧光强度的测定发现，同正常人相比，糖尿病肾病患者肾小球系膜细胞的体积(图1)和RNA/DNA比值(图2)均显著增高(P<0.01)。说明糖尿病患者的系膜细胞肥大不仅表现为细胞体积的增大，还表现为RNA/DNA比值的升高。三次检测结果说明该方法有较好的稳定性和重复性(附表)。
附表 系膜细胞细胞体积和RNA/DNA比值的检测结果
细胞体积*
RNA/DNA**
正常人
DN患者
正常人
, 百拇医药
DN患者
第1次
489.9
569.3
0.17
0.31
第2次
500.7
649.1
0.16
0.35
第3次
467.1
, 百拇医药
582.1
0.19
0.39
均值
485.9
600.2
0.17
0.35
*细胞体积以其FSC的平均强度的道数来表示
**细胞RNA/DNA比值为RNA和DNA的平均荧光强度的道数比
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图1 不同来源系膜细胞体积的比较
Ⅰ正常人；Ⅱ糖尿病肾病患者
图2 系膜细胞RNA、DNA染色的两维散点图
3 讨论
长期以来由于技术原因，一直没有比较精确且能大量测定细胞体积的方法。传统的细胞肥大检测方法为同位素掺入和蛋白含量测定等，上述方法均以检测细胞的总数做为校正因子，人为因素大，重复性较差，加之使用同位素掺入的方法，又常常带来同位素污染和操作不便。本文介绍的细胞体积和RNA/DNA的流式细胞仪测定方法，解决了实际操作中的上述问题，提供了一个快捷、稳定、重复性好的方法。这里尤其要指出的是，以往有人对丫啶橙(Acridine orange，AO)进行细胞RNA/DNA测定，由于AO对机器管道污染极为严重，并且清洗困难，在很大程度上限制了应用流式细胞仪进行细胞RNA/DNA检测的开展。本文所采用的方法不会对机器管道系统造成污染，有较大的推广应用价值。
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在实际工作中，我们认为还应该注意以下两点：①测量细胞体积最好先用70%冷乙醇固定后再测[4]，以保证不同批次间结果具可比性。②因为PY既可以同RNA结合又可以和DNA结合，所以加入浓度较高的7-AAD染料，是为了充分饱和DNA，使PY加入时只能和RNA结合。所以细胞计数应准确，保证细胞与染料有合适的比例，以免发生7-AAD浓度相对不足，造成结果的偏差。
参考文献
1 杨俊伟，陈朝红，刘 栋等.雷公藤内酯醇通过细胞凋亡阻止T细胞增殖.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6：205
2 Craig TJ，Glenn Y，David M et al.Highresolution cell cycle analysis of defined phenotypic subsets within primitive human hematopoietic cell populations.Exp Hematol，1996，24：1374
, http://www.100md.com
3 Kiyoyuki O，Emi A，Keiko K et al.Cell cycle modulation by hematopoietic growth factors in myelodysplastic syndroms： Analysis by three-color flow cytometry.Exp Hematol，1997，25：8
4 Terry AJ，Gary ES，Mary A et al.Mesangial cell from transgenic mice with progressive glomerulosclerosis exhibit stable，phenotypic changes including undetectable MMP-9 and increase type Ⅳ collagen.Lab Invest，1996，75：791
(1999-04-06收稿), 百拇医药
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：流式细胞仪；细胞体积；RNA/DNA比值
肾脏病与透析肾移植杂志990328
细胞体积和RNA/DNA比值是细胞生物学研究中的两个重要参数。它们可以反映细胞是否肥大，RNA/DNA比值还可以更加精细地区分细胞周期各时相。而如何快速大量地测量细胞体积以及RNA/DNA比值，长期以来一直是困扰我们的一个问题。随着流式细胞仪检测技术的日趋成熟，这个问题逐步得到了解决。在本文中作者应用流式细胞仪前向角散射光(forward side scatter，FSC)强度同细胞大小成正比的特性来检测细胞体积；应用两种荧光染料派若宁Y(Pyronine Y，PY)和7-氨基-放线菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)对RNA、DNA的不同染色特性来检测RNA/DNA比值。
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1 材料和方法
1.1 细胞 取培养的70%融合的人肾小球系膜细胞，洗去培养液后，加0.25%胰酶2ml消化5～8min(37℃)，小牛血清终止消化，吸管小心吹打，过300目尼龙网筛，使其成为单细胞悬液。磷酸盐缓冲液(含5%牛血清白蛋白)洗涤2次，将细胞浓度调至109/L待用。
1.2 试剂 DMEM/F12(GIBCO)培养液[1]。7-AAD，PY及皂素(Saponin)均购自美国Sigma公司。
1.3 仪器 Epics-XL型流式细胞仪(美国Coulter公司)，488nm氩离子激光器。
1.4 细胞体积的检测 细胞在从流式细胞仪喷嘴成单行喷出时，受到激光的照射会发生对光的散射。其中FSC主要与细胞的体积成正比，即细胞体积越大，散射光也越强。
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取上述细胞悬液0.5ml，混匀后上流式细胞仪计数10000个细胞进行检测，同时计算FSC的平均强度[2]。
1.5 RNA/DNA比值的检测 7-AAD可插入DNA的GC碱基对与之结合，经氩离子激光器激发，发射波长为647nm左右的荧光。PY既可以和RNA结合又可以和DNA结合，用7-AAD充分饱和DNA后，再加入PY就只与RNA结合。经氩离子激光器激发后，可发出波长为547 nm左右的荧光。
取上述细胞悬液1ml，离心去上清，10 mmol/L HEPES缓冲液(含0.1%叠氮钠，4%胎牛血清)洗两遍(1000转，3min)，再次弃上清，每管加入1ml磷酸盐枸橼酸缓冲液(含0.15mmol/L氯化纳，5 mmol/L EDTA-2Na+，0.5%牛血清白蛋白，0.02%皂素)室温孵育30min后，再加入25.5μ1 7-AAD染液(浓度为1g/L)，室温下避光放置30min，同上用缓冲液洗涤2次。充分悬浮细胞，冰浴10min后加入50μlPY染液(浓度为100 μmol/L)，再冰浴10min，同上用缓冲液洗涤2次后经流式细胞仪检测[3]。
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2 结果
对体外培养的肾小球系膜细胞FSC平均强度以及7-AAD和PY双染后荧光强度的测定发现，同正常人相比，糖尿病肾病患者肾小球系膜细胞的体积(图1)和RNA/DNA比值(图2)均显著增高(P<0.01)。说明糖尿病患者的系膜细胞肥大不仅表现为细胞体积的增大，还表现为RNA/DNA比值的升高。三次检测结果说明该方法有较好的稳定性和重复性(附表)。
附表 系膜细胞细胞体积和RNA/DNA比值的检测结果
细胞体积*
RNA/DNA**
正常人
DN患者
正常人
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DN患者
第1次
489.9
569.3
0.17
0.31
第2次
500.7
649.1
0.16
0.35
第3次
467.1
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582.1
0.19
0.39
均值
485.9
600.2
0.17
0.35
*细胞体积以其FSC的平均强度的道数来表示
**细胞RNA/DNA比值为RNA和DNA的平均荧光强度的道数比
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图1 不同来源系膜细胞体积的比较
Ⅰ正常人；Ⅱ糖尿病肾病患者
图2 系膜细胞RNA、DNA染色的两维散点图
3 讨论
长期以来由于技术原因，一直没有比较精确且能大量测定细胞体积的方法。传统的细胞肥大检测方法为同位素掺入和蛋白含量测定等，上述方法均以检测细胞的总数做为校正因子，人为因素大，重复性较差，加之使用同位素掺入的方法，又常常带来同位素污染和操作不便。本文介绍的细胞体积和RNA/DNA的流式细胞仪测定方法，解决了实际操作中的上述问题，提供了一个快捷、稳定、重复性好的方法。这里尤其要指出的是，以往有人对丫啶橙(Acridine orange，AO)进行细胞RNA/DNA测定，由于AO对机器管道污染极为严重，并且清洗困难，在很大程度上限制了应用流式细胞仪进行细胞RNA/DNA检测的开展。本文所采用的方法不会对机器管道系统造成污染，有较大的推广应用价值。
, http://www.100md.com
在实际工作中，我们认为还应该注意以下两点：①测量细胞体积最好先用70%冷乙醇固定后再测[4]，以保证不同批次间结果具可比性。②因为PY既可以同RNA结合又可以和DNA结合，所以加入浓度较高的7-AAD染料，是为了充分饱和DNA，使PY加入时只能和RNA结合。所以细胞计数应准确，保证细胞与染料有合适的比例，以免发生7-AAD浓度相对不足，造成结果的偏差。
参考文献
1 杨俊伟，陈朝红，刘 栋等.雷公藤内酯醇通过细胞凋亡阻止T细胞增殖.肾脏病与透析肾移植杂志，1997，6：205
2 Craig TJ，Glenn Y，David M et al.Highresolution cell cycle analysis of defined phenotypic subsets within primitive human hematopoietic cell populations.Exp Hematol，1996，24：1374
, http://www.100md.com
3 Kiyoyuki O，Emi A，Keiko K et al.Cell cycle modulation by hematopoietic growth factors in myelodysplastic syndroms： Analysis by three-color flow cytometry.Exp Hematol，1997，25：8
4 Terry AJ，Gary ES，Mary A et al.Mesangial cell from transgenic mice with progressive glomerulosclerosis exhibit stable，phenotypic changes including undetectable MMP-9 and increase type Ⅳ collagen.Lab Invest，1996，75：791
(1999-04-06收稿), 百拇医药