肾移植术前免疫抑制剂敏感性试验及临床应用
作者：孙雯 徐秀红 张玉海 贾宝祥
单位：首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科研究所(北京，100050)
关键词：肾移植；免疫抑制剂；敏感性
肾脏病与透析肾移植杂志990310
摘 要 目的：对肾移植术前免疫抑制剂(CsA，FK506，甲基强的松龙，泼尼松，地塞米松)的药物敏感性进行检测，观察肾移植术后的排斥反应及治疗结果，以便合理使用免疫抑制药物。方法：选取慢性肾功能衰竭(CRF)患者50名及健康志愿者50名，分别检测五种免疫抑制剂，对其外周血淋巴细胞在植物血凝素(PHA)刺激下，抑制淋巴细胞增殖的能力。分别测定五种免疫抑制剂对研究对象淋巴细胞增殖能力抑制50%的浓度(IC50)，以健康人的LogIC50平均值±2个标准差为正常值，根据此标准将CRF患者分成高敏感组、中度敏感组及低敏感组，并观察CRF患者肾移植术后6个月内急性排斥反应的发生率、治疗情况，以及在观察期间内各组移植肾功能的比较。结果：CRF患者的IC50分布范围较健康人明显增宽，其中，泼尼松的分布范围最大。肾移植术后6个月内，高敏感组(11.11%)及中度敏感组(26.67%)的急性排斥反应发生率明显低于低敏感组(57.69%)，并且低敏感组患者耐激素性排斥反应的发生率(34.62%)较高敏感组及中度敏感组(4.17%)明显增高，需用ATG或OKT3加强抗排斥治疗。如果患者对泼尼松及CsA/FK506均耐药，其临床预后最差。在观察期间内，低敏感组SCr水平明显高于高敏感组及中度敏感组。结论：肾移植术前淋巴细胞对免疫抑制药物的敏感性与肾移植术后急性排斥反应的发生率及移植肾功能的恢复密切相关。所以，肾移植术前的免疫抑制药物的敏感性为肾移植术后合理使用免疫抑制剂提供科学的理论根据。并在出现急性排斥反应时提供最佳的抗排斥治疗方案，争取治疗时间。
, 百拇医药
CLINICAL EVALUATION OF IMMUNOSUPPRESSIVE AGENTS SENSITIVITY TESTS IN PRE-OPERATIVE RECIPIENTS OF RENAL GRAFT
Sun Wen，Xu Shouhong，Zhang Yuhai，Jia Baoxiang
(Institute of Urology，Beijing Frendship Hospital，Capital Universtity of Medicine.Beijing 100050)
OBJECTIVE To examine the relationship between the outcome of renal transplantation and preoperative in vitro immunosuppressants(CsA，FK506，Prednisone，Daxamethasone，Methylprednisolone)lymphocyte sensitivities.
, 百拇医药
METHODOLOGY Five immunosuppressants(CsA，FK506，Prednisone，Daxamethasone，Methylprednisolone)were examined for their in vitro suppressive effects on blastogenesis of mitogen-stimulated PBL obtained from 50 chronic renal failure(CRF) candidates for renal transplantation and 50 healthy volunteer.In all subjects，drug concentrations of 50% inhibition of lymphocyte blastogenseis(IC50) were determined for each immunosuppressant.Hypersensitive(HS)，normal sensitive(NS)and undersensitive(US)patients were defined according to their LogIC50 above or in or under that range of LogIC50+2 standard deviations in the controls.Graft outcomes (incidence of acute rejection episodes and the graft survival rate)in 50 kidney transplant recipients treated with CsA or FK506 and Prednisone were compared retrospectively with pretransplantation immunosuppressant IC50 values.
, http://www.100md.com
RESULTS Large individual deviations of each immunosuppressant IC50 was observed among the subjects，especially in the CRF patients.Predinisone IC50 values of the CRF patients showed the largest deviation，ranging form 1.0 to 10000 μg/L.The rate of acute rejection was 11.11% in HS patients to CsA/FK506 and Prednisone，and 26.67% in NS patients，while 57.69 in the US patients during the first 6 months after transplantation.The HS and NS patients had a lower level of serum creatinine than the US patients throughout the period of observation.ATG or OKT3 were required only in 1 of 24(4.17%)in HS or NS patients，while in 9 of 26 patients(34.62%)in US patients.
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CONCLUSION Lymphocyte sensitivity to immunosuppressant before renal transplantation was significantly related to early acute rejections and renal function after transplantation.Under-sensitivity to Prednisone and CsA/FK506 might be associated with acute rejections which required the use of ATG or OKT3 and with a worse prognosis.Pre-transplantation in vitro lymphocyte sensitivity tests are of clinical significance in optimizing the anti-rejection regime in renal graft recipients.
, 百拇医药
Key words immunosuppressant renal acute rejection
renal transplantation
在环孢霉素A时代，肾移植术后常规的免疫抑制剂用药方案为三联免疫抑制剂联合应用(环孢霉素A+硫唑嘌呤+泼尼松)。目前随着一批新型免疫抑制剂问世，临床医师在用药方面有了较大的选择性。但是如何选择免疫抑制药物以减少排斥反应的发生率和药物的毒性作用是困扰临床医师的一个共同问题。目前，环孢素A(CsA)、硫唑嘌呤(Aza)、激素、FK506等药物均可在肾移植术后长期使用，但如何选择尚无一科学的标准。本项研究中，我们检测了慢性肾功能衰竭(CRF)患者及健康志愿者的外周血淋巴细胞对CsA、FK506、甲基强的松龙、地塞米松、泼尼松五项药物的敏感性，并分析CRF患者术前免疫抑制药物敏感性与肾移植术后的临床关系，现报告如下。
1 对象和方法
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1.1 研究对象 选择CRF 50例(等待肾移植患者，男性28例，女性22例)，平均年龄37.2±10.8(22～58)岁；健康志愿者50名(男性25名，女性25名)，平均年龄30.4±10.2(26～52)岁。健康志愿者与CRF患者之间在年龄及性别上无明显差异。所有CRF患者及健康志愿者在本项研究开始前至少6个月内未服用过免疫抑制制。CRF患者均接受每周2～3次血透析治疗。CRF患者的原发病：慢性肾小球肾炎40例，肾盂肾炎2例，糖尿病性肾病2例，多囊肾2例，原发病病因不明确4例。50例CRF患者于1998年1月～1998年4月接受同种异体肾移植手术。
1.2 实验方法 取CRF患者及健康志愿者的外周血10ml，常规分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1.5×109/L，加入96孔培养板中，每孔100μl，每孔加入植物血凝素(PHA)10μl及五种免疫抑制剂各100μl，CsA和FK506的药物浓度为0.001，0.01，0.1，1，10，100，1000μg/L；泼尼松、地塞米松及甲基强的松龙的药物浓度为0.01，0.1，1，10，100，1000，10000μg/L。同时做1个复孔的对照组。在37℃，5%的CO2培养箱内培养72h。加入20μl浓度为1.85×109Bq/L的3H-Tdr使终浓度为3×107Bq/L，轻轻摇匀后置于37℃条件下培养4h，然后加入SDS 100μl，1h后振荡10min，用酶标仪(德国)选择波长570nm，参考波长630nm，测A值。从药物剂量反应曲线上得出免疫抑制剂抑制淋巴细胞有丝分裂50%的药物浓度(IC50)。
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1.3 肾移植术后基本免疫抑制剂用药方案 肾移植术中甲基强的松龙1000mg或地塞米松80mg、术后第1天及第2天甲基强的松龙500mg或地塞米松40mg静脉冲击治疗，第3天起口服强的松30mg/d，以后每月递减5mg/d，第3个月为20mg/d，第6个月为15mg/d，1年时为12.5mg/d。术后第3天口服Aza 150mg/d，3个月时125mg/d，6个月时100mg/d。术后第2～3天如SCr降到265μmol/L以下，则给予口服CsA，起始量7mg/(kg.d)，以后按血中CsA谷浓度来调整用量。如患者术后服用FK506，则泼尼松的用量酌减。
1.4 急性排斥反应的诊断标准 ①临床症状及体征：移植肾肿大，质地变硬，移植肾区胀痛，尿量减少或无尿，发热，血压升高，SCr及尿素氮明显升高。②超声实像显示：移植肾弥漫性肿大，皮质增厚及与髓质的分界区消失，肾内结构回声减弱。彩色多谱勒超声显示：肾脏血流阻力明显增加。③临床上如不能确诊为急性排斥反应，可行肾穿刺以明确诊断。
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1.5 急性排斥反应的治疗方法 如确诊为急性排斥反应，则给予甲基强的松龙500mg或地塞米松40mg静脉冲击治疗；如为耐激素性排斥反应或肾移植术前已检测出患者淋巴细胞对激素不敏感(耐药)，则给予抗T淋巴细胞球蛋白(ATG)或OKT3。
1.6 统计学方法 测定值以均数±标准差表示，采用配对t检验，两均数t检验和χ2检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。以上数据处理均由国际通用数据统计软件包SYSTAT3.0版完成。
2 结果
2.1 CRF患者及健康志愿人员淋巴细胞对五种免疫抑制药物的敏感性 详见表1。
表1 健康人与CRF患者免疫抑制药物的IC50(μg/L) 免疫抑制药物
健康人
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CRF患者
强的松
1.3～1050(33)
2.3～10000(68)**
地塞米松
1～56(2.5)
0.1～360(5.2)*
甲基强的松龙
0.001～26.5(1.4)
0.01～1000(1.77)**
CSA
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0.2～45.2(4.9)
0.1～368.0(7.4)*
FK506
0.02～0.57(0.21)
0.001～7.60(0.28)*
vs健康人，*P<0.05，**P<0.01，括弧内为均值
从表1中可以看出，五种免疫抑制药物的IC50个体化差异很大，尤其是在CRF患者中，其药物的IC50分布范围比健康人更大，此差异具有统计学意义。
通过计算健康人的LogIC50的平均值±2S计算出CsA、FK506、泼尼松、地塞米松、甲基强的松龙的标准正常值，CsA为0.8～58.8 μg/L，FK506为0.04～0.85 μg/L，泼尼松为322～381μg/L，甲基强的松龙为21～32 μg/L，地塞米松为2～13 μg/L。如果CRF患者其药物的IC50值高于标准正常值的上限，则确定该患者对此药物低敏感，如患者其药物的IC50值低于标准正常值的下限，则确定该患者对此药物高敏感。如患者其IC50值在标准正常值范围内，则表明该患者 对此药物反应中度敏感。本项研究中的50例CRF患者，其中40例肾移植术后采用CsA+Aza+泼尼松，10例采用FK506+Aza+泼尼松三联免疫抑制剂用药方案。根据患者的CsA(FK506)和泼尼松的IC50值将患者分为3组：高敏感组(指对CsA或FK506及泼尼松均为高敏感的患者)9例(CsA组8例，FK506组1例)；中度敏感组(指对CsA或FK506及泼尼松均为中度敏感的患者)15例(CsA组10例，FK506组5例)；低敏感组(指对CsA或FK506或泼尼松为低敏感的患者)26例(CsA组22例，FK506组4例)。在低敏感组中有2例患者对CsA及泼尼松均呈低敏感性，1例同时对FK506及泼尼松均呈低敏感性；另1例仅对CsA低敏感而对泼尼松为中度敏感，而22例患者仅对泼尼松低敏感而对CsA或FK506为中度敏感。高敏感组、中度敏感组与低敏感组之间在年龄、性别、原发病、HLA-A、B、DR、DQ位点错配数目、移植肾冷、热缺血时间等方面无明显差异。
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2.2 免疫抑制药物的敏感性与肾移植术后急性排斥反应的关系 肾移植术后6个月内，免疫抑制药物敏感性与急性排斥反应的关系详见表2。
表2 免疫抑制药物敏感性与肾移植术后急性排斥反应的关系[n(%)]
n
排斥反应
移植肾切除
高敏感组
9
1(11.11)
0**
中度敏感组
15
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4(26.67)
1(6.67)*
低敏感组
26
15(57.69)
4(15.38)
vs低敏感组 *P<0.05，**P<0.01
肾移植术后6个月内，服用CsA的40例患者中，高敏感组仅1例患者出现急性排斥反应(12.5%)，经甲基强的松龙冲击治疗后逆转；中度敏感组中有3例出现急性排斥反应(30%)，仅有1例为不可逆性排斥反应而切除移植肾；低敏感组中有13例患者出现急性排斥反应(59.05%)，有3例为不可逆性排斥反应而切除移植肾，其中有2例对CsA及泼尼松均低敏感。
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肾移植术后6个月内，服用FK506的10例患者中，高敏感组未出现急性排斥反应。中度敏感组中有1例(20%)出现急性排斥反应，低敏感组中有2例出现急性排斥反应(50%)。
2.3 ATG或OKT3的使用 在本项研究中，我们同时对50例CRF患者进行地塞米松、甲基强的松龙及泼尼松的药物敏感实验。其中对泼尼松低敏感者25例(50%)，对泼尼松及地塞米松低敏感者21例(42%)，对甲基强的松龙、地塞米松及泼尼松均呈低敏感者15例(30%)，此15例患者中，有8例出现急性排斥反应，其中4例在出现急性排斥反应后即给予ATG或OKT3抗排斥治疗，此4例患者的急性排斥反应均逆转，而另4例在出现急性排斥反应后先给予甲基强的松龙冲击治疗，排斥反应未能逆转，其中3例再给予ATG或OKT3加强抗排斥治疗，2例排斥反应逆转，1例切除移植肾，而因经济原因未采用ATG或OKT3治疗的1例患者切除移植肾。对甲基强的松龙反应为中度敏感而对泼尼松及地塞米松低敏感者6例，有4例出现急性排斥反应，经甲基强的松龙冲击治疗后，仅有1例患者排斥反应未恢复，给予ATG后排斥反应逆转。
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2.4 各组移植肾的肾功能 详见表3。
表3 免疫抑制药物敏感性与肾移植术后血肌酐的关系(
+s，μmol/L)
血肌酐
术后1个月
术后6个月
高敏感组
123.8±30.9
114.9±24.8**
中度敏感组
145.9±35.4
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141.4±20.3*
低敏感组
213.0±70.7
206.9±49.5
vs低敏感组 *P<0.05，**P<0.01
3 讨论
随着配型技术的不断发展及新型免疫抑制剂应用于临床，肾移植存活率不断提高。但肾移植术后较高的急性排斥反应发生率仍是引起移植肾丧失的主要原因之一。目前临床医师主要是根据自己的临床经验选择免疫抑制剂，尚无一科学的选择标准。本项研究的目的在于建立一科学的方法选择安全有效的免疫抑制剂，能产生更加有效的免疫抑制治疗作用，同时还能减少免疫抑制剂的用量，减少副作用的发生。
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随着对免疫抑制药物的药代动力学及药效动力学研究的不断深入，已有研究发现CRF患者肾移植术前对糖皮质激素的药物敏感性与肾移植术后急性排斥反应的发生率及移植肾的存活率有关[1～4]。Takeuchi等报道[5]，CRF患者肾移植术前对CsA的药物敏感性，与肾移植术后的急性排斥反应发生率及移植肾存活率有关。本研究综合分析CRF患者肾移植术前对多种免疫抑制剂的药物敏感性，并对其与肾移植术后的临床关系进行研究。我们对五种免疫抑制剂(CsA，FK506，泼尼松，地塞米松，甲基强的松龙)抑制CRF患者与健康人淋巴细胞增殖50%的药物浓度(IC50)的分布范围进行比较，发现有相当多的CRF患者的IC50值远远超出正常范围的上限，这说明有相当多的CRF患者对此五种免疫抑制药物不敏感。同时我们还发现，如果CRF患者对某一种激素不敏感，有可能对另几种激素亦不敏感。目前对于CRF患者淋巴细胞对免疫抑制药物不敏感的确切机制尚不完全清楚，但Toshihiko Hirano等[6]发现，CRF患者的原发病对糖皮质激素的IC50没有明显的影响，这说明CRF本身对糖皮质激素的敏感性影响很少，而糖皮质激素受体功能的损害及受体数目的减少可能是对糖皮质激素不敏感的原因之一。Toshihiko Hirano等认为，CRF患者血浆中存在一种能促进淋巴细胞有丝分裂的刺激因子，此因子有可能造成T淋巴细胞的功能损害，而导致免疫系统的功能失调，因此有可能造成CRF患者淋巴细胞对免疫抑制药物产生不敏感。Pukhalsky[7]与Erichson[8]等报道，某些HLA抗原与免疫抑制药物不敏感性有关。
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本研究中，低敏感组的急性排斥反应发生率为57.69%(15/26)，而中度敏感组及高敏感组的急性排斥反应发生率分别为26.67%(4/15)及11.11%(1/9)，由此可以看出CRF患者肾移植术前淋巴细胞对免疫抑制药物不敏感，肾移植术后即有较高的急性排斥反应发生率，与Dumble[9]和Langhoff等[3]的研究结果基本相似。由于肾移植术后急性排斥反应的发生率一般在35%～50%[9]，本研究中，肾移植术后急性排斥反应的发生率为40%(20/50)，而CRF患者淋巴细胞对CsA及FK506的不敏感率一般在4%以下(本项研究CsA为6%，FK506为4%)，明显低于急性排斥反应发生率，因此可以看出淋巴细胞对激素的敏感程度是引起急性排斥反应发生的高危因素，而淋巴细胞对CsA或FK506的敏感程度对急性排斥反应的影响较小。在本研究中，有2例患者同时对CsA及泼尼松均呈低敏感性，肾移植术后由于出现不可逆性排斥反应而切除移植肾。可以看出如患者对泼尼松及CsA或FK506同时不敏感，其临床预后比仅对一种免疫抑制药物不敏感要差得多。本研究中，高敏感组及中度敏感组的24例患者中，仅有1例(4.17%)需要ATG或OKT3抗排斥治疗，而在低敏感组的26例患者中，有9例(34.62%)需用ATG或OKT3。可以看出在低敏感组中，由于患者对CsA或FK506或泼尼松耐药，导致急性排斥反应的发生率升高，并且耐激素性排斥反应的出现率升高，需要ATG或OKT3加强抗排斥治疗。如果患者肾移植术前已检测出对激素类药物(泼尼松、地塞米松、甲基强的松龙)均不敏感，肾移植术后出现急性排斥反应，应立即给予ATG或OKT3抗排斥治疗以争取时间。但在本研究中，我们发现CRF患者对甲基强的松龙不敏感的比例(30%)比泼尼松(50%)和地塞米松(42%)要低，如果对泼尼松及地塞米松不敏感而对甲基强的松龙反应正常的患者出现急性排斥反应，采用甲基强的松龙抗排斥治疗可获得良好的效果，并大大地降低治疗费用。
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本研究中，我们发现在CRF患者中，对CsA敏感性与对FK506敏感性之间有密切的关系。但仍有一些患者并不是对CsA及FK506同时不敏感。我们已知此两种药物都与免疫亲合素结合形成复合物，最主要的作用部位是Calcineurin，Calcineurin被抑制后，可防止活性T细胞的胞浆核因子(NF-TAC)的去磷酸化，使其不能进入细胞核，进而影响细胞因子的转录，如IL-2基因[10]。但CsA和FK506的免疫亲合素的结合部位并不一样[10，11]。CsA与环孢亲合素结合，FK506与FKBPS结合。因此我们认为在某一患者，两种免疫亲合素的数量或结合能力并不相同，则此两种药物的敏感性有可能不相同。如果肾移植术前患者的CsA及FK506的药物敏感性不同，肾移植术后应尽量选择敏感性相对高的药物。
通过本项研究，我们认为肾移植术前检测淋巴细胞对免疫抑制药物的敏感性十分重要，可以预测肾移植术后的临床疗效。通过体外的淋巴细胞敏感试验，可以针对每一患者提供科学的免疫抑制剂治疗方案。并在出现急性排斥反应时提供最佳的抗排斥治疗方案，争取治疗时间。同时由于对免疫抑制药物不敏感的患者肾移植术后易出现急性排斥反应，因此此类患者肾移植术后应采用ATG、OKT3或直接作用于IL-2受体的抗体(如Simulect等)预防排斥反应的出现，提高移植肾的存活率。但由于本项研究随访时间较短，尚须进一步观察淋巴细胞对免疫抑制剂的敏感性与移植肾长期存活率的关系。
, 百拇医药
参考文献
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2 Gambertoglio JG，Amend WJ，BEnet LZ.Pharmcokinetics and bioavailability of prenisone and prednisolone in healthy volunteers and patients： a review.J Pharmcokinet Biopharm，1980，8：1
3 Langhoff E，Ladefoged J，Jakobsen BK et al.Recipients lymphocyte sensitivity to methylprednisolone affects cadaver kidney grafte survival.Lancet，1986，ii：1296
, http://www.100md.com
4 Walker KB，Potter JM，House AK.Interleukin 2 synthesis in the presence of steroid，a model of steroid resistance.Clin Exe Immuno，1987，68：162
5 Takeuchi H，Hirano T，Oka K et al.Lymphocyt sensitivity to Cyclosporine and Tacrolimus in chronic renal failure patients and clinical significance in renal transplantation.Transplant Proc，1998，30：36
6 Toshihiko Hirano，Yasuhara Toyohima，Kitaro Oka et al.Promotion of lymphocyte blastogrnesis by hemodialysate of chronic renal failure.Nephron，1992，61：45
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7 Pukhalshy AL，Kalashnikors EA，Cyashko VN et al.Inhibition of phytohemagglutinin-induced lymphocyte proliferation by dexamthasone：mechanism of individual susceptibility.Int J Immunopharmocol，1991，12：657
8 Erickson RP，Heidel L，Kapur JJ et al.HLA antigens，phytohemagglutinin stimulation，and corticosteroid resistance.Am J Hum Genet，1985，68：162
9 Dumble IJ，Macdonald IM，Kincaid Smith P et al.Correlation between ADCC resistance to in vitro steroid and renal allograft failure.Transplant Proc，1981，13：1569
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10 First MR.Update on new immunosuppressive drugs undergoing preclinical trials：potential applications in organ transplantation.Am J Kidney Dis，1997，2：303
11 Van Duyne GD，Standaert RF，Karplus PA et al.Atomic structure of FKBP-FK506，an immunophilin-immunosuppresant complex.Science，1991，252：839
(1999-02-01收稿，1999-03-15修回), 百拇医药
单位：首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科研究所(北京，100050)
关键词：肾移植；免疫抑制剂；敏感性
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OBJECTIVE To examine the relationship between the outcome of renal transplantation and preoperative in vitro immunosuppressants(CsA，FK506，Prednisone，Daxamethasone，Methylprednisolone)lymphocyte sensitivities.
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RESULTS Large individual deviations of each immunosuppressant IC50 was observed among the subjects，especially in the CRF patients.Predinisone IC50 values of the CRF patients showed the largest deviation，ranging form 1.0 to 10000 μg/L.The rate of acute rejection was 11.11% in HS patients to CsA/FK506 and Prednisone，and 26.67% in NS patients，while 57.69 in the US patients during the first 6 months after transplantation.The HS and NS patients had a lower level of serum creatinine than the US patients throughout the period of observation.ATG or OKT3 were required only in 1 of 24(4.17%)in HS or NS patients，while in 9 of 26 patients(34.62%)in US patients.
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CONCLUSION Lymphocyte sensitivity to immunosuppressant before renal transplantation was significantly related to early acute rejections and renal function after transplantation.Under-sensitivity to Prednisone and CsA/FK506 might be associated with acute rejections which required the use of ATG or OKT3 and with a worse prognosis.Pre-transplantation in vitro lymphocyte sensitivity tests are of clinical significance in optimizing the anti-rejection regime in renal graft recipients.
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renal transplantation
在环孢霉素A时代，肾移植术后常规的免疫抑制剂用药方案为三联免疫抑制剂联合应用(环孢霉素A+硫唑嘌呤+泼尼松)。目前随着一批新型免疫抑制剂问世，临床医师在用药方面有了较大的选择性。但是如何选择免疫抑制药物以减少排斥反应的发生率和药物的毒性作用是困扰临床医师的一个共同问题。目前，环孢素A(CsA)、硫唑嘌呤(Aza)、激素、FK506等药物均可在肾移植术后长期使用，但如何选择尚无一科学的标准。本项研究中，我们检测了慢性肾功能衰竭(CRF)患者及健康志愿者的外周血淋巴细胞对CsA、FK506、甲基强的松龙、地塞米松、泼尼松五项药物的敏感性，并分析CRF患者术前免疫抑制药物敏感性与肾移植术后的临床关系，现报告如下。
1 对象和方法
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1.1 研究对象 选择CRF 50例(等待肾移植患者，男性28例，女性22例)，平均年龄37.2±10.8(22～58)岁；健康志愿者50名(男性25名，女性25名)，平均年龄30.4±10.2(26～52)岁。健康志愿者与CRF患者之间在年龄及性别上无明显差异。所有CRF患者及健康志愿者在本项研究开始前至少6个月内未服用过免疫抑制制。CRF患者均接受每周2～3次血透析治疗。CRF患者的原发病：慢性肾小球肾炎40例，肾盂肾炎2例，糖尿病性肾病2例，多囊肾2例，原发病病因不明确4例。50例CRF患者于1998年1月～1998年4月接受同种异体肾移植手术。
1.2 实验方法 取CRF患者及健康志愿者的外周血10ml，常规分离淋巴细胞，调整细胞浓度为1.5×109/L，加入96孔培养板中，每孔100μl，每孔加入植物血凝素(PHA)10μl及五种免疫抑制剂各100μl，CsA和FK506的药物浓度为0.001，0.01，0.1，1，10，100，1000μg/L；泼尼松、地塞米松及甲基强的松龙的药物浓度为0.01，0.1，1，10，100，1000，10000μg/L。同时做1个复孔的对照组。在37℃，5%的CO2培养箱内培养72h。加入20μl浓度为1.85×109Bq/L的3H-Tdr使终浓度为3×107Bq/L，轻轻摇匀后置于37℃条件下培养4h，然后加入SDS 100μl，1h后振荡10min，用酶标仪(德国)选择波长570nm，参考波长630nm，测A值。从药物剂量反应曲线上得出免疫抑制剂抑制淋巴细胞有丝分裂50%的药物浓度(IC50)。
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1.3 肾移植术后基本免疫抑制剂用药方案 肾移植术中甲基强的松龙1000mg或地塞米松80mg、术后第1天及第2天甲基强的松龙500mg或地塞米松40mg静脉冲击治疗，第3天起口服强的松30mg/d，以后每月递减5mg/d，第3个月为20mg/d，第6个月为15mg/d，1年时为12.5mg/d。术后第3天口服Aza 150mg/d，3个月时125mg/d，6个月时100mg/d。术后第2～3天如SCr降到265μmol/L以下，则给予口服CsA，起始量7mg/(kg.d)，以后按血中CsA谷浓度来调整用量。如患者术后服用FK506，则泼尼松的用量酌减。
1.4 急性排斥反应的诊断标准 ①临床症状及体征：移植肾肿大，质地变硬，移植肾区胀痛，尿量减少或无尿，发热，血压升高，SCr及尿素氮明显升高。②超声实像显示：移植肾弥漫性肿大，皮质增厚及与髓质的分界区消失，肾内结构回声减弱。彩色多谱勒超声显示：肾脏血流阻力明显增加。③临床上如不能确诊为急性排斥反应，可行肾穿刺以明确诊断。
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1.5 急性排斥反应的治疗方法 如确诊为急性排斥反应，则给予甲基强的松龙500mg或地塞米松40mg静脉冲击治疗；如为耐激素性排斥反应或肾移植术前已检测出患者淋巴细胞对激素不敏感(耐药)，则给予抗T淋巴细胞球蛋白(ATG)或OKT3。
1.6 统计学方法 测定值以均数±标准差表示，采用配对t检验，两均数t检验和χ2检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。以上数据处理均由国际通用数据统计软件包SYSTAT3.0版完成。
2 结果
2.1 CRF患者及健康志愿人员淋巴细胞对五种免疫抑制药物的敏感性 详见表1。
表1 健康人与CRF患者免疫抑制药物的IC50(μg/L) 免疫抑制药物
健康人
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CRF患者
强的松
1.3～1050(33)
2.3～10000(68)**
地塞米松
1～56(2.5)
0.1～360(5.2)*
甲基强的松龙
0.001～26.5(1.4)
0.01～1000(1.77)**
CSA
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0.2～45.2(4.9)
0.1～368.0(7.4)*
FK506
0.02～0.57(0.21)
0.001～7.60(0.28)*
vs健康人，*P<0.05，**P<0.01，括弧内为均值
从表1中可以看出，五种免疫抑制药物的IC50个体化差异很大，尤其是在CRF患者中，其药物的IC50分布范围比健康人更大，此差异具有统计学意义。
通过计算健康人的LogIC50的平均值±2S计算出CsA、FK506、泼尼松、地塞米松、甲基强的松龙的标准正常值，CsA为0.8～58.8 μg/L，FK506为0.04～0.85 μg/L，泼尼松为322～381μg/L，甲基强的松龙为21～32 μg/L，地塞米松为2～13 μg/L。如果CRF患者其药物的IC50值高于标准正常值的上限，则确定该患者对此药物低敏感，如患者其药物的IC50值低于标准正常值的下限，则确定该患者对此药物高敏感。如患者其IC50值在标准正常值范围内，则表明该患者 对此药物反应中度敏感。本项研究中的50例CRF患者，其中40例肾移植术后采用CsA+Aza+泼尼松，10例采用FK506+Aza+泼尼松三联免疫抑制剂用药方案。根据患者的CsA(FK506)和泼尼松的IC50值将患者分为3组：高敏感组(指对CsA或FK506及泼尼松均为高敏感的患者)9例(CsA组8例，FK506组1例)；中度敏感组(指对CsA或FK506及泼尼松均为中度敏感的患者)15例(CsA组10例，FK506组5例)；低敏感组(指对CsA或FK506或泼尼松为低敏感的患者)26例(CsA组22例，FK506组4例)。在低敏感组中有2例患者对CsA及泼尼松均呈低敏感性，1例同时对FK506及泼尼松均呈低敏感性；另1例仅对CsA低敏感而对泼尼松为中度敏感，而22例患者仅对泼尼松低敏感而对CsA或FK506为中度敏感。高敏感组、中度敏感组与低敏感组之间在年龄、性别、原发病、HLA-A、B、DR、DQ位点错配数目、移植肾冷、热缺血时间等方面无明显差异。
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2.2 免疫抑制药物的敏感性与肾移植术后急性排斥反应的关系 肾移植术后6个月内，免疫抑制药物敏感性与急性排斥反应的关系详见表2。
表2 免疫抑制药物敏感性与肾移植术后急性排斥反应的关系[n(%)]
n
排斥反应
移植肾切除
高敏感组
9
1(11.11)
0**
中度敏感组
15
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4(26.67)
1(6.67)*
低敏感组
26
15(57.69)
4(15.38)
vs低敏感组 *P<0.05，**P<0.01
肾移植术后6个月内，服用CsA的40例患者中，高敏感组仅1例患者出现急性排斥反应(12.5%)，经甲基强的松龙冲击治疗后逆转；中度敏感组中有3例出现急性排斥反应(30%)，仅有1例为不可逆性排斥反应而切除移植肾；低敏感组中有13例患者出现急性排斥反应(59.05%)，有3例为不可逆性排斥反应而切除移植肾，其中有2例对CsA及泼尼松均低敏感。
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肾移植术后6个月内，服用FK506的10例患者中，高敏感组未出现急性排斥反应。中度敏感组中有1例(20%)出现急性排斥反应，低敏感组中有2例出现急性排斥反应(50%)。
2.3 ATG或OKT3的使用 在本项研究中，我们同时对50例CRF患者进行地塞米松、甲基强的松龙及泼尼松的药物敏感实验。其中对泼尼松低敏感者25例(50%)，对泼尼松及地塞米松低敏感者21例(42%)，对甲基强的松龙、地塞米松及泼尼松均呈低敏感者15例(30%)，此15例患者中，有8例出现急性排斥反应，其中4例在出现急性排斥反应后即给予ATG或OKT3抗排斥治疗，此4例患者的急性排斥反应均逆转，而另4例在出现急性排斥反应后先给予甲基强的松龙冲击治疗，排斥反应未能逆转，其中3例再给予ATG或OKT3加强抗排斥治疗，2例排斥反应逆转，1例切除移植肾，而因经济原因未采用ATG或OKT3治疗的1例患者切除移植肾。对甲基强的松龙反应为中度敏感而对泼尼松及地塞米松低敏感者6例，有4例出现急性排斥反应，经甲基强的松龙冲击治疗后，仅有1例患者排斥反应未恢复，给予ATG后排斥反应逆转。
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2.4 各组移植肾的肾功能 详见表3。
表3 免疫抑制药物敏感性与肾移植术后血肌酐的关系(
+s，μmol/L)血肌酐
术后1个月
术后6个月
高敏感组
123.8±30.9
114.9±24.8**
中度敏感组
145.9±35.4
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141.4±20.3*
低敏感组
213.0±70.7
206.9±49.5
vs低敏感组 *P<0.05，**P<0.01
3 讨论
随着配型技术的不断发展及新型免疫抑制剂应用于临床，肾移植存活率不断提高。但肾移植术后较高的急性排斥反应发生率仍是引起移植肾丧失的主要原因之一。目前临床医师主要是根据自己的临床经验选择免疫抑制剂，尚无一科学的选择标准。本项研究的目的在于建立一科学的方法选择安全有效的免疫抑制剂，能产生更加有效的免疫抑制治疗作用，同时还能减少免疫抑制剂的用量，减少副作用的发生。
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随着对免疫抑制药物的药代动力学及药效动力学研究的不断深入，已有研究发现CRF患者肾移植术前对糖皮质激素的药物敏感性与肾移植术后急性排斥反应的发生率及移植肾的存活率有关[1～4]。Takeuchi等报道[5]，CRF患者肾移植术前对CsA的药物敏感性，与肾移植术后的急性排斥反应发生率及移植肾存活率有关。本研究综合分析CRF患者肾移植术前对多种免疫抑制剂的药物敏感性，并对其与肾移植术后的临床关系进行研究。我们对五种免疫抑制剂(CsA，FK506，泼尼松，地塞米松，甲基强的松龙)抑制CRF患者与健康人淋巴细胞增殖50%的药物浓度(IC50)的分布范围进行比较，发现有相当多的CRF患者的IC50值远远超出正常范围的上限，这说明有相当多的CRF患者对此五种免疫抑制药物不敏感。同时我们还发现，如果CRF患者对某一种激素不敏感，有可能对另几种激素亦不敏感。目前对于CRF患者淋巴细胞对免疫抑制药物不敏感的确切机制尚不完全清楚，但Toshihiko Hirano等[6]发现，CRF患者的原发病对糖皮质激素的IC50没有明显的影响，这说明CRF本身对糖皮质激素的敏感性影响很少，而糖皮质激素受体功能的损害及受体数目的减少可能是对糖皮质激素不敏感的原因之一。Toshihiko Hirano等认为，CRF患者血浆中存在一种能促进淋巴细胞有丝分裂的刺激因子，此因子有可能造成T淋巴细胞的功能损害，而导致免疫系统的功能失调，因此有可能造成CRF患者淋巴细胞对免疫抑制药物产生不敏感。Pukhalsky[7]与Erichson[8]等报道，某些HLA抗原与免疫抑制药物不敏感性有关。
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本研究中，低敏感组的急性排斥反应发生率为57.69%(15/26)，而中度敏感组及高敏感组的急性排斥反应发生率分别为26.67%(4/15)及11.11%(1/9)，由此可以看出CRF患者肾移植术前淋巴细胞对免疫抑制药物不敏感，肾移植术后即有较高的急性排斥反应发生率，与Dumble[9]和Langhoff等[3]的研究结果基本相似。由于肾移植术后急性排斥反应的发生率一般在35%～50%[9]，本研究中，肾移植术后急性排斥反应的发生率为40%(20/50)，而CRF患者淋巴细胞对CsA及FK506的不敏感率一般在4%以下(本项研究CsA为6%，FK506为4%)，明显低于急性排斥反应发生率，因此可以看出淋巴细胞对激素的敏感程度是引起急性排斥反应发生的高危因素，而淋巴细胞对CsA或FK506的敏感程度对急性排斥反应的影响较小。在本研究中，有2例患者同时对CsA及泼尼松均呈低敏感性，肾移植术后由于出现不可逆性排斥反应而切除移植肾。可以看出如患者对泼尼松及CsA或FK506同时不敏感，其临床预后比仅对一种免疫抑制药物不敏感要差得多。本研究中，高敏感组及中度敏感组的24例患者中，仅有1例(4.17%)需要ATG或OKT3抗排斥治疗，而在低敏感组的26例患者中，有9例(34.62%)需用ATG或OKT3。可以看出在低敏感组中，由于患者对CsA或FK506或泼尼松耐药，导致急性排斥反应的发生率升高，并且耐激素性排斥反应的出现率升高，需要ATG或OKT3加强抗排斥治疗。如果患者肾移植术前已检测出对激素类药物(泼尼松、地塞米松、甲基强的松龙)均不敏感，肾移植术后出现急性排斥反应，应立即给予ATG或OKT3抗排斥治疗以争取时间。但在本研究中，我们发现CRF患者对甲基强的松龙不敏感的比例(30%)比泼尼松(50%)和地塞米松(42%)要低，如果对泼尼松及地塞米松不敏感而对甲基强的松龙反应正常的患者出现急性排斥反应，采用甲基强的松龙抗排斥治疗可获得良好的效果，并大大地降低治疗费用。
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本研究中，我们发现在CRF患者中，对CsA敏感性与对FK506敏感性之间有密切的关系。但仍有一些患者并不是对CsA及FK506同时不敏感。我们已知此两种药物都与免疫亲合素结合形成复合物，最主要的作用部位是Calcineurin，Calcineurin被抑制后，可防止活性T细胞的胞浆核因子(NF-TAC)的去磷酸化，使其不能进入细胞核，进而影响细胞因子的转录，如IL-2基因[10]。但CsA和FK506的免疫亲合素的结合部位并不一样[10，11]。CsA与环孢亲合素结合，FK506与FKBPS结合。因此我们认为在某一患者，两种免疫亲合素的数量或结合能力并不相同，则此两种药物的敏感性有可能不相同。如果肾移植术前患者的CsA及FK506的药物敏感性不同，肾移植术后应尽量选择敏感性相对高的药物。
通过本项研究，我们认为肾移植术前检测淋巴细胞对免疫抑制药物的敏感性十分重要，可以预测肾移植术后的临床疗效。通过体外的淋巴细胞敏感试验，可以针对每一患者提供科学的免疫抑制剂治疗方案。并在出现急性排斥反应时提供最佳的抗排斥治疗方案，争取治疗时间。同时由于对免疫抑制药物不敏感的患者肾移植术后易出现急性排斥反应，因此此类患者肾移植术后应采用ATG、OKT3或直接作用于IL-2受体的抗体(如Simulect等)预防排斥反应的出现，提高移植肾的存活率。但由于本项研究随访时间较短，尚须进一步观察淋巴细胞对免疫抑制剂的敏感性与移植肾长期存活率的关系。
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(1999-02-01收稿，1999-03-15修回), 百拇医药