地塞米松对感染柯萨奇B-2病毒的人胚心肌细胞保护作用的实验研究
作者：汪建新 余步云 梁慧
单位：广州市第一人民医院 (510180) 汪建新；中山医科大学第三附属医院 余步云 梁慧
关键词：心肌细胞；培养；柯萨奇B-2病毒；地塞米松；乳酸脱氢酶(LDH)；超微结构
中国现代医学杂志990414 该研究拟从细胞水平观察地塞米松对感染CoxB-2病毒的人胚心肌细胞的作用效果。采用培养的人胚心肌细胞接种CoxB-2病毒，观察细胞生长、搏动情况及超微结构，测定心肌细胞释放的LDH(乳酸脱氢酶)活性。发现地塞米松治疗组的心肌细胞搏动较感染组者维持时间长，心肌细胞病变发展亦较缓慢，且LDH值明显低于感染组。说明地塞米松对感染CoxB-2病毒的人胚心肌细胞有明显的保护作用，提示临床上在重症病毒性心肌炎，特别是早期阶段，应用激素治疗能减轻心肌病变，对进一步的抢救病人有重要意义。
分类号 R-33
, 百拇医药
迄今为止，病毒性心肌炎仍无满意的治疗方法，重症病毒性心肌炎，特别是有严重房室传导阻滞及心力衰竭者，仍有较高的死亡率。对于病毒性心肌炎患者应否给予激素治疗，一直存在争论。有报道病毒性心肌炎患者应用激素后能使病情好转，也有报道激素对降低病毒性心肌炎的死亡率无明显影响，还有报道用激素反而使病情迁延[1～5]。本文拟从细胞水平观察人胚心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒(CoxB-2)后应用地塞米松的作用效果。
1 材料与方法
1.1 材料
人胚心脏取自孕16～20周要求引产的健康产妇。地塞米松5mg/ml(广州天心制药厂生产)。柯萨奇B-2病毒(CoxB-2) American Type Culture Collection,ATCC-29。在Hep-2细胞上测其50%组织感染量TCID50为10-5。生长液：1640培养液(Life Technologies.Inc.U.S.A.含20%小牛血清、1%谷氨酰胺、青霉素200u/ml、链霉素100mg/ml)。LDH基质液、去Ca++、Mg++的Hank's液、0.09%胰蛋白酶、PAS糖原染色液、台盼蓝染色液、聚苯乙烯细胞培养板、Hep-2传代细胞。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 人胚心肌细胞培养[6] 在无菌条件下，取出妊娠16～20周的胎儿心脏，置于无Ca++、Mg++的Hank's液中，剪下心室。用培养液洗去心内残留血迹，剪成1mm×1mm×1mm的组织块，移入内置磁性搅动棒的50ml烧瓶中，瓶内加15ml 0.09%胰蛋白酶，以100r/min搅动15min，瓶内温度维持在35～37℃之间，共消化7次。第1次的消化物(上清液)含有血细胞碎屑，弃之。其他6次消化所得细胞悬液分别置于离心管内，以70～100r/min离心5min。将离心所得细胞再悬于生长液中。集中各管的细胞悬液于一较大的培养瓶中。37℃培养箱内孵育5h以去除部分类内皮细胞。根据心肌细胞贴壁生长晚而类内皮细胞贴壁生长早的特点，按Blondcl等的方法可将二者分开，从而获得较高纯度的心肌细胞。分离效果：用PAS糖原染色，心肌细胞呈阳性，心肌细胞纯度高达86%以上。以台盼蓝染色计数，将未贴壁的心肌细胞以10×105的细胞密度，分装于5ml培养瓶内(每瓶2ml)放入37℃培养箱内，在培养第6日由单层心肌细胞组成的细胞族出现同步搏动，搏动频率40～60次/min。
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1.2.2 分组 将上述培养的搏动心肌细胞随机分为两类4组。将10瓶搏动心肌细胞的上清液弃去，各加2ml含100 TCID50的CoxB-2病毒的生长液，此为感染类。将另10瓶搏动心肌细胞的上清液弃去，各加2ml生长液，此为非感染类。以上各瓶于37℃孵育1h后，弃液。从感染类中取5瓶各加地塞米松125μg作为“感染加地塞米松组”，从非感染类中取5瓶各加地塞米松125μg作为“地塞米松对照组”。最后均加生长液至每瓶总量达4ml。分组如下：A 正常对照组;B 感染组;C 感染加地塞米松组;D 地塞米松对照组。以上各组均是5瓶，共20瓶。
1.2.3 每天在倒置显微镜下观察细胞生长搏动情况及细胞病变情况。用电镜观察超微结构。
上述分组后的心肌细胞在感染病毒后的第1，2，3，5，7日，4组中各取两瓶，用上清液作乳酸脱氢酶(LDH)测定，用本实验室常规方法。
1.2.4 实验数据以均数±标准差(X±SD)表示，采用总体方差分析及两两比较、秩和检验进行统计学处理。P<0.05为差异有显著性。
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2 结果
2.1 各组细胞搏动及细胞病变观察结果
在整个实验观察期间，对照组(均为未感染CoxB-2病毒者)心肌细胞生长良好，细胞搏动维持在40～60次/min，呈同步搏动，未发现细胞病变。
第1天时，光镜下各组细胞亦未见搏动异常，未出现明显的细胞病变。第2天时，感染组细胞搏动减弱，搏动频率减低，搏动不规则。不同步，并且逐渐出现心肌细胞团缩、折光增强、成堆等细胞病变(Cytopathic Effect,CPE)。至第3天时，在感染组，搏动的心肌细胞很难见到，心肌细胞病变达100%。
感染加地塞米松组自第2天开始亦出现搏动频率及幅度降低，心肌细胞折光增强、变圆，但与感染组相比病变程度较轻。至第3天时，仍可见40%的心肌细胞尚有不同程度的搏动；但第5天时，该组心肌细胞病变与感染组无明显差别，亦很少见到搏动的心肌细胞。
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2.2 LDH在各组中的变化
第1天时各组间的LDH活性无明显差异(P>0.05)，第2，3，5，7天时，感染组的LDH活性高于正常对照组(P<0.01)，而感染加地塞米松组的LDH活性却明显低于感染组(P<0.01)，尤以第2，3天时为最明显，表明此期间地塞米松对感染CoxB-2病毒的人胚心肌细胞有明显的保护作用。
正常对照组、地塞米松对照组在整个实验观察期间其LDH活性均无明显差异(P>0.05)。
附表 地塞米松对感染柯萨奇B-2病毒的人胚心肌细胞LDH释放量的影响(U/L，
±sd)
第1天
第2天
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第3天
第5天
第7天
A：正常对照组
97.9±17.25
95.8±41.16
98.33±20.66
108.33±26.40
97.5±19.94
B：感 染 组
92.5±15.08
367.5±21.621)
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397.5±25.731)
413.33±18.071)
435±22.801)
C：感染加地塞米松组
110.83±19.60
282.5±12.92)
314.17±13.572)
373.33±11.252)
309.83±12.812)
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D：地塞米松对照组
90.83±20.84
105.83±24.98
92.5±20.19
107.5±20.92
94.17±23.54
2) 感染组与其它三组比较 P<0.01
2.3 超微结构改变
感染后第1天，对正常对照组、感染组、感染加地塞米松组的心肌细胞进行透射电镜检查，观察到感染组的心肌细胞线粒体膨胀，内嵴减少、变稀疏，细胞核正常，肌丝排列规则，Z线明显 。而正常对照组、感染加地塞米松组的心肌细胞的超微结构基本正常(肌丝排列规则，Z线明显，线粒体丰富，嵴较多而清晰，细胞核正常)。表明感染组的心肌细胞能量代谢系统已开始受到影响，同时也提示地塞米松在早期对感染CoxB-2病毒的心肌细胞即有保护作用。
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3 讨论
已知地塞米松具有较强的抗炎作用，能稳定细胞溶酶体膜，抑制炎症介质的释放，从而保护细胞免受损伤。Lerner[7]在感染柯萨奇B-2病毒的小鼠体内注射地塞米松后，观察到可促使其体内病毒繁殖，加重病变过程。但杨氏等[8]却观察到在培养的大鼠心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒后加用地塞米松可使心肌病变减轻。本实验结果表明，在培养的人胚心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒后加用地塞米松，产生了对心肌细胞的保护作用，尤以第1～3天为明显；而第5天时，地塞米松由于不能抑制病毒的复制，保护作用减弱至基本消失，以至感染柯萨奇B-2病毒的人胚心肌细胞不能继续存活。提示一方面在病毒性心肌炎患者，特别是一般病情及非早期患者，应用地塞米松可能促使病毒繁殖继而损害心肌细胞；另一方面也提示，在重症病毒性心肌炎，特别是早期阶段，除卧床、支持疗法外，利用地塞米松的抗炎作用，短程、较大剂量使用地塞米松能有效保护心肌细胞不致遭受广泛损害，对进一步的抢救治疗有重要意义。
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参考文献
1 Levi G.Coxsackie virus heart disease:15 years after.Eur Heart J,1988;9:1303
2 Kipshidze NH.Immunological characteristics of viral myocarditis.Ter ArRH,1988;60:136
3 广野晓(日).迁延的活动性心肌炎及类固醇脉冲疗法奏效的一例.心脏，1995；27：739
4 Morishima Ⅰ.抢救急性心肌炎一例报告.长期经皮心肺支持，Jan Circ J,1994;58:433
5 小岛昌治(日).急性心包心肌炎的急救及初期治疗.救急医学，1995；19：565
, 百拇医药
6 Thompson A.Growth of dissociated beating human heart cells in culture.J Mol Cell Cardiol,1977;9:945
7 Lerner AM.Virus myopercarditis.Ann Inter Med,1968;69:1068
8 杨英珍.地塞米松对培养大鼠搏动心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒的作用.中国药理学报，1989；10：346
1998-10-15收稿
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单位：广州市第一人民医院 (510180) 汪建新；中山医科大学第三附属医院 余步云 梁慧
关键词：心肌细胞；培养；柯萨奇B-2病毒；地塞米松；乳酸脱氢酶(LDH)；超微结构
中国现代医学杂志990414 该研究拟从细胞水平观察地塞米松对感染CoxB-2病毒的人胚心肌细胞的作用效果。采用培养的人胚心肌细胞接种CoxB-2病毒，观察细胞生长、搏动情况及超微结构，测定心肌细胞释放的LDH(乳酸脱氢酶)活性。发现地塞米松治疗组的心肌细胞搏动较感染组者维持时间长，心肌细胞病变发展亦较缓慢，且LDH值明显低于感染组。说明地塞米松对感染CoxB-2病毒的人胚心肌细胞有明显的保护作用，提示临床上在重症病毒性心肌炎，特别是早期阶段，应用激素治疗能减轻心肌病变，对进一步的抢救病人有重要意义。
分类号 R-33
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迄今为止，病毒性心肌炎仍无满意的治疗方法，重症病毒性心肌炎，特别是有严重房室传导阻滞及心力衰竭者，仍有较高的死亡率。对于病毒性心肌炎患者应否给予激素治疗，一直存在争论。有报道病毒性心肌炎患者应用激素后能使病情好转，也有报道激素对降低病毒性心肌炎的死亡率无明显影响，还有报道用激素反而使病情迁延[1～5]。本文拟从细胞水平观察人胚心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒(CoxB-2)后应用地塞米松的作用效果。
1 材料与方法
1.1 材料
人胚心脏取自孕16～20周要求引产的健康产妇。地塞米松5mg/ml(广州天心制药厂生产)。柯萨奇B-2病毒(CoxB-2) American Type Culture Collection,ATCC-29。在Hep-2细胞上测其50%组织感染量TCID50为10-5。生长液：1640培养液(Life Technologies.Inc.U.S.A.含20%小牛血清、1%谷氨酰胺、青霉素200u/ml、链霉素100mg/ml)。LDH基质液、去Ca++、Mg++的Hank's液、0.09%胰蛋白酶、PAS糖原染色液、台盼蓝染色液、聚苯乙烯细胞培养板、Hep-2传代细胞。
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1.2 实验方法
1.2.1 人胚心肌细胞培养[6] 在无菌条件下，取出妊娠16～20周的胎儿心脏，置于无Ca++、Mg++的Hank's液中，剪下心室。用培养液洗去心内残留血迹，剪成1mm×1mm×1mm的组织块，移入内置磁性搅动棒的50ml烧瓶中，瓶内加15ml 0.09%胰蛋白酶，以100r/min搅动15min，瓶内温度维持在35～37℃之间，共消化7次。第1次的消化物(上清液)含有血细胞碎屑，弃之。其他6次消化所得细胞悬液分别置于离心管内，以70～100r/min离心5min。将离心所得细胞再悬于生长液中。集中各管的细胞悬液于一较大的培养瓶中。37℃培养箱内孵育5h以去除部分类内皮细胞。根据心肌细胞贴壁生长晚而类内皮细胞贴壁生长早的特点，按Blondcl等的方法可将二者分开，从而获得较高纯度的心肌细胞。分离效果：用PAS糖原染色，心肌细胞呈阳性，心肌细胞纯度高达86%以上。以台盼蓝染色计数，将未贴壁的心肌细胞以10×105的细胞密度，分装于5ml培养瓶内(每瓶2ml)放入37℃培养箱内，在培养第6日由单层心肌细胞组成的细胞族出现同步搏动，搏动频率40～60次/min。
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1.2.2 分组 将上述培养的搏动心肌细胞随机分为两类4组。将10瓶搏动心肌细胞的上清液弃去，各加2ml含100 TCID50的CoxB-2病毒的生长液，此为感染类。将另10瓶搏动心肌细胞的上清液弃去，各加2ml生长液，此为非感染类。以上各瓶于37℃孵育1h后，弃液。从感染类中取5瓶各加地塞米松125μg作为“感染加地塞米松组”，从非感染类中取5瓶各加地塞米松125μg作为“地塞米松对照组”。最后均加生长液至每瓶总量达4ml。分组如下：A 正常对照组;B 感染组;C 感染加地塞米松组;D 地塞米松对照组。以上各组均是5瓶，共20瓶。
1.2.3 每天在倒置显微镜下观察细胞生长搏动情况及细胞病变情况。用电镜观察超微结构。
上述分组后的心肌细胞在感染病毒后的第1，2，3，5，7日，4组中各取两瓶，用上清液作乳酸脱氢酶(LDH)测定，用本实验室常规方法。
1.2.4 实验数据以均数±标准差(X±SD)表示，采用总体方差分析及两两比较、秩和检验进行统计学处理。P<0.05为差异有显著性。
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2 结果
2.1 各组细胞搏动及细胞病变观察结果
在整个实验观察期间，对照组(均为未感染CoxB-2病毒者)心肌细胞生长良好，细胞搏动维持在40～60次/min，呈同步搏动，未发现细胞病变。
第1天时，光镜下各组细胞亦未见搏动异常，未出现明显的细胞病变。第2天时，感染组细胞搏动减弱，搏动频率减低，搏动不规则。不同步，并且逐渐出现心肌细胞团缩、折光增强、成堆等细胞病变(Cytopathic Effect,CPE)。至第3天时，在感染组，搏动的心肌细胞很难见到，心肌细胞病变达100%。
感染加地塞米松组自第2天开始亦出现搏动频率及幅度降低，心肌细胞折光增强、变圆，但与感染组相比病变程度较轻。至第3天时，仍可见40%的心肌细胞尚有不同程度的搏动；但第5天时，该组心肌细胞病变与感染组无明显差别，亦很少见到搏动的心肌细胞。
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2.2 LDH在各组中的变化
第1天时各组间的LDH活性无明显差异(P>0.05)，第2，3，5，7天时，感染组的LDH活性高于正常对照组(P<0.01)，而感染加地塞米松组的LDH活性却明显低于感染组(P<0.01)，尤以第2，3天时为最明显，表明此期间地塞米松对感染CoxB-2病毒的人胚心肌细胞有明显的保护作用。
正常对照组、地塞米松对照组在整个实验观察期间其LDH活性均无明显差异(P>0.05)。
附表 地塞米松对感染柯萨奇B-2病毒的人胚心肌细胞LDH释放量的影响(U/L，
±sd)第1天
第2天
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第3天
第5天
第7天
A：正常对照组
97.9±17.25
95.8±41.16
98.33±20.66
108.33±26.40
97.5±19.94
B：感 染 组
92.5±15.08
367.5±21.621)
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397.5±25.731)
413.33±18.071)
435±22.801)
C：感染加地塞米松组
110.83±19.60
282.5±12.92)
314.17±13.572)
373.33±11.252)
309.83±12.812)
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D：地塞米松对照组
90.83±20.84
105.83±24.98
92.5±20.19
107.5±20.92
94.17±23.54
2) 感染组与其它三组比较 P<0.01
2.3 超微结构改变
感染后第1天，对正常对照组、感染组、感染加地塞米松组的心肌细胞进行透射电镜检查，观察到感染组的心肌细胞线粒体膨胀，内嵴减少、变稀疏，细胞核正常，肌丝排列规则，Z线明显 。而正常对照组、感染加地塞米松组的心肌细胞的超微结构基本正常(肌丝排列规则，Z线明显，线粒体丰富，嵴较多而清晰，细胞核正常)。表明感染组的心肌细胞能量代谢系统已开始受到影响，同时也提示地塞米松在早期对感染CoxB-2病毒的心肌细胞即有保护作用。
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3 讨论
已知地塞米松具有较强的抗炎作用，能稳定细胞溶酶体膜，抑制炎症介质的释放，从而保护细胞免受损伤。Lerner[7]在感染柯萨奇B-2病毒的小鼠体内注射地塞米松后，观察到可促使其体内病毒繁殖，加重病变过程。但杨氏等[8]却观察到在培养的大鼠心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒后加用地塞米松可使心肌病变减轻。本实验结果表明，在培养的人胚心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒后加用地塞米松，产生了对心肌细胞的保护作用，尤以第1～3天为明显；而第5天时，地塞米松由于不能抑制病毒的复制，保护作用减弱至基本消失，以至感染柯萨奇B-2病毒的人胚心肌细胞不能继续存活。提示一方面在病毒性心肌炎患者，特别是一般病情及非早期患者，应用地塞米松可能促使病毒繁殖继而损害心肌细胞；另一方面也提示，在重症病毒性心肌炎，特别是早期阶段，除卧床、支持疗法外，利用地塞米松的抗炎作用，短程、较大剂量使用地塞米松能有效保护心肌细胞不致遭受广泛损害，对进一步的抢救治疗有重要意义。
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1 Levi G.Coxsackie virus heart disease:15 years after.Eur Heart J,1988;9:1303
2 Kipshidze NH.Immunological characteristics of viral myocarditis.Ter ArRH,1988;60:136
3 广野晓(日).迁延的活动性心肌炎及类固醇脉冲疗法奏效的一例.心脏，1995；27：739
4 Morishima Ⅰ.抢救急性心肌炎一例报告.长期经皮心肺支持，Jan Circ J,1994;58:433
5 小岛昌治(日).急性心包心肌炎的急救及初期治疗.救急医学，1995；19：565
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6 Thompson A.Growth of dissociated beating human heart cells in culture.J Mol Cell Cardiol,1977;9:945
7 Lerner AM.Virus myopercarditis.Ann Inter Med,1968;69:1068
8 杨英珍.地塞米松对培养大鼠搏动心肌细胞感染柯萨奇B-2病毒的作用.中国药理学报，1989；10：346
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