糖尿病大鼠血管内皮损伤的实验研究
作者：谌登兵 欧造国
单位：重庆医科大学临床学院内一科(400016)
关键词：血管内皮细胞；循环内皮细胞；血管紧张素转化酶
重庆医学990403 摘 要 内皮损伤研究方兴未艾。为了探讨血管损伤与早发性糖尿病大血管病变之关系，分别随机抽取30只成年健康雌性Wistar大鼠和四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠，测定其循环内皮细胞计数(CEC)和血管紧张素转化酶(ACE)血清活力。结果显示：糖尿病鼠ACE高于对照ACE(980.02±132.18u/560.07±150.03u)，糖尿病鼠CEC(2.52±0.67个/0.9ul)高于健康鼠CEC(0.72±0.21个/0.9ul)，差异有统计学意义(P均小于0.01)。推测糖尿病早期出现的内皮损伤可能在其大血管并发症发生中起到一定作用。
Endothelial Injury in Diabetic Rats
, http://www.100md.com
Cheng Dengbin,Ou Zhaoguo.Department of Endocrinology,The College of Clinical Medicine,Chongqing University of Medical Sciences 400016.
Abstract：To Investigate the relationship betveen endothelial injuiry and diabetic macroangiopathy,30 female diabetic rats induced by alloxan and 30 healthy Wistar rats matched for weight and sex were chosen for the counting of circulating endothelial cell(CEC) and the determination of plasma activities of angiotensin converting enzyme(ACE).The results showed that the counts of CEC and the activities of ACE in diabetic group were significantly higher than those in control group (2.52±0.67cell/0.9ul；980.02±132.18u vs 560.07±150.03u)respecfively.It is concluded that the early occurring endothelial injury may play an important role in the early pathogenesis of diabetic macroangiopathy.
, 百拇医药
Key Words:Vascular endothelial cell Circulating endothelial cell Angiotensin-converting enzyme
糖尿病大血管病变发生较早，发生率高，进展较快，死亡率高，危害极大，其确切发生发展机制，尚不明确。
血管内皮细胞(VEC)衬于血管内壁，参与多种十分重要的生命活动。正因为其处于循环系统，血液系统和组织细胞成分的特殊位置，内皮损伤在多种疾病的发病学地位备受关注。在疾病状态，因VEC结构损伤和功能异常参与发生机制的一组病变被称为“内皮病”(endotheliopathy)。
本研究测定了四氧嘧啶致糖尿病大鼠和正常大鼠血CEC和ACE，旨在探讨内皮损伤在早发性糖尿病大血管病变发生中的可能作用。
1 材料与方法
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1.1 实验动物与分组 给体重165～270g的雌性Wistar大鼠(重庆医科大学实验动物中心提供)腹腔内注射2%四氧嘧啶(200mg/kg)，三日后取尾静脉血测定血糖(邻甲苯胺法)。随机抽取血糖大于13.0mmol/L且于第四周时血糖仍大于此值者共30只大鼠作为糖尿病组(体重251.67±52.3g)。另取健康雌性Wistar大鼠30只，腹腔内注射无菌生理盐水(200mg/kg)作为研究对照组(体重261.35±67.48g)。两组大鼠自由饮水进食。
1.2 方法
1.2.1 CEC计数与鉴定 Percoll试剂：(Sigma，USA)、Ⅷ因子相关抗原兔抗鼠血清(上海生物制品研究所)、羊抗兔IgG抗体(医学科学院微生物流行病研究所)。CEC计数：取鼠心腔血2ml加等体积含Percoll生理盐水充分混匀后置2000rpm离心20分钟，弃上清液；取中层液少许滴于普通血球计数池，计数九个大方格内(0.9ul)CEC；每份标本计数四次，求其均值。CEC鉴定 取备检悬液少许涂于玻片上，甲醇固定，磷酸缓冲液漂洗；后加Ⅷ因子相关抗原兔抗鼠血清，置37℃温育30分钟，加磷酸缓冲液再漂洗；干后加异硫氰酸荧光标记的羊抗兔IgG，置荧光显微镜下观察，呈黄绿色荧光者即为CEC。阴性对照将Ⅷ因子相关抗原兔抗鼠血清改为磷酸缓冲液。
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1.2.2 血清ACE活力测定 试剂：30mmol/L马尿酰甘氨酰底物液、40mmol/L甘氨酰甘氨酸标准液、100g/L钨酸钠溶液、0.33mol/L稀硫酸液、0.1mol/L硼酸缓冲液(pH9.6)、60mmol/L三硝基苯磺酸钠溶液(以上试剂均购自海军总医院生化实验中心)。测定：按化冰等[2]推荐方法进行。酶活力计算公式为：光密度A420(测定管一定白管)×1200u。
1.2.3 统计学处理 所有实验结果均以均数±标准差(χ±s)表示；显著性比较采用两组间t检验；相关分析运用直线回归分析。
2 结 果
2.1 糖尿病组CEC计数为2.52±0.67个/0.9ul；对照组CEC计数为0.72±0.21个/0.9ul。前者较后者显著升高(P<0.01)。
2.2 糖尿病鼠血清ACE活力(980.02±132.18u)较健康大鼠血清ACE活力(560.07±150.03u)显著升高；二者相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。
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2.3 糖尿病组血CEC及ACE升高与其高血糖水平间相关系数分别为0.88和0.98(P均小于0.01)。
3 讨 论
糖尿病大血管并发症发病率、致残率、死亡率高，发生较早，进展迅速，其确切发病机制尚未阐明。
近年来，内皮功能及内皮损伤研究进展日新月异。现认为，血管内皮具有屏障作用、物质转运作用和信号传递作用，它还合成并分泌多种生物活性物质，参与维持血液流变学、血管张力和血管壁细胞成分的自稳态。在病理状态时，VEC的结构损伤与功能异常被认为参与了一组“内皮病”的发病机制，构成多种疾病的发病学基础。这组疾病包括动脉硬化、高血压以及充血性心衰。Ross认为，内皮损伤是动脉硬化(大血管病变)的始动环节[3]。
VEC呈单层被覆于血管内壁，衰老时脱落入血，成为CEC。长期以来，致力于VEC的研究大多是在体外进行的，寻找VEC的体内实验方法进行临床研究，就成为目前面临的重要课题。近年来，国外开展的CEC计数检查，从外周血中检出源于VEC的CEC[4]，为解决这项难题开辟了一个新领域。所谓CEC是指在生理或病理情况下从外周血中获得的内皮细胞，其中包括无核的内皮细胞残骸和有核的可供体外培养的内皮细胞。据文献报道，生理条件下外周血中存在一定数量CEC，而在急性心肌梗塞、重度心绞痛、外周血管疾病以及吸烟时，CEC计数增多，给予免疫抑制剂时，CEC计数减少。
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已有一些研究表明，实验性糖尿病和糖尿病患者存在内皮功能异常或结构损伤[5～7]。我们在四氧嘧啶致糖尿病大鼠体内检出较高的CEC计数和血清ACE活力增高，分别从形态上和功能上反映了大鼠糖尿病存在内皮损伤，与文献结论一致。
运用密度梯度离心法测定糖尿病大鼠血循环中的CEC计数，发现其CEC计数显著高于健康对照。目前尚未见到糖尿病时CEC计数改变的报道。由于CEC是在体内仅有的可作为血管损伤的指示物[8]，其计数升高标志着糖尿病时出现了广泛的血管损伤和内皮功能异常。
ACE主要定位于血管内皮细胞的管腔面，其活性主要位于肺循环。ACE通过血管紧张素-激肽系统发挥调节血液动力学、血管壁张力等多项重要功能[9]。它被当作反映血管损伤的间接指标。
我们的实验表明，四氧嘧啶所致大鼠糖尿病早期(第四周)其血清ACE活力已有显著升高，与文献报道一致[10，11]。ACE血清活力升高表明局部或全身合成增加，意味着血管紧张素-激肽系统平衡失调。通过血管紧张素Ⅱ的多样化生物学作用，促进糖尿病大血管病变的发生。
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近年来的研究，结果显示糖尿病大血管病变发生前已有内皮结构损伤或功能异常。我们的实验显示，大鼠糖尿病第四周时血清ACE活力已见升高，二者是一致的。与CEC计数一样，ACE活力升高亦可作为糖尿病大血管病变发生的预报因子。
Ross认为，内皮损伤是动脉硬化发生的始动环节。据此我们推测，内皮损伤可能是糖尿病大血管病变发生的始动环节。
总之，我们的研究结果表明，四氧嘧啶致大鼠糖尿病的早期，其循环CEC计数和血清ACE活力升高标志着血管内皮损伤与功能异常的出现。且二者的升高与血糖水平的升高显著正相关，提示血管内皮损伤与代谢控制不良有关。血管内皮损伤在糖尿病大血管病变的发生中可能起到一定作用。
参考文献
[1] 杨映波，王正国，刘怀琼，等.血循环中内皮细胞数量变化意义的初探.第三军医大学学报，1990,12：209
, http://www.100md.com
[2] 化冰，赵忠，王赋敏，等.血管紧张素Ⅰ转换酶三硝基苯磺酸钠比色测定法，临床检验杂志.1986,4：67
[3] Ross R. N Eng I J Med,1986,314:488
[4] I wata Y,Kuzuya F,Hayakawa,et al.Stroke.1986,17:506
[5] Stehouwer CD,Fischer HR,Van Kuijk AW,et al.Diabetes,1995,44:561
[6] Parving HH,Nielsen FS,Bang LE et al.Diabetologia.1996,39;1590
[7] Clarkson P,Celermajer DS,Powe AJ,et al.Circulation,1997,96:3378
[8] Takanashi H,Harker LA.Thromb Res.1983,31:1
[9] Erdos EG.Hypertension.1990,16:363
[10] Lieberman J,Sastre A.Ann Intern Med ,1980,93:825
[11] Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Diabetes.1994,43;384, http://www.100md.com
单位：重庆医科大学临床学院内一科(400016)
关键词：血管内皮细胞；循环内皮细胞；血管紧张素转化酶
重庆医学990403 摘 要 内皮损伤研究方兴未艾。为了探讨血管损伤与早发性糖尿病大血管病变之关系，分别随机抽取30只成年健康雌性Wistar大鼠和四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠，测定其循环内皮细胞计数(CEC)和血管紧张素转化酶(ACE)血清活力。结果显示：糖尿病鼠ACE高于对照ACE(980.02±132.18u/560.07±150.03u)，糖尿病鼠CEC(2.52±0.67个/0.9ul)高于健康鼠CEC(0.72±0.21个/0.9ul)，差异有统计学意义(P均小于0.01)。推测糖尿病早期出现的内皮损伤可能在其大血管并发症发生中起到一定作用。
Endothelial Injury in Diabetic Rats
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Cheng Dengbin,Ou Zhaoguo.Department of Endocrinology,The College of Clinical Medicine,Chongqing University of Medical Sciences 400016.
Abstract：To Investigate the relationship betveen endothelial injuiry and diabetic macroangiopathy,30 female diabetic rats induced by alloxan and 30 healthy Wistar rats matched for weight and sex were chosen for the counting of circulating endothelial cell(CEC) and the determination of plasma activities of angiotensin converting enzyme(ACE).The results showed that the counts of CEC and the activities of ACE in diabetic group were significantly higher than those in control group (2.52±0.67cell/0.9ul；980.02±132.18u vs 560.07±150.03u)respecfively.It is concluded that the early occurring endothelial injury may play an important role in the early pathogenesis of diabetic macroangiopathy.
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Key Words:Vascular endothelial cell Circulating endothelial cell Angiotensin-converting enzyme
糖尿病大血管病变发生较早，发生率高，进展较快，死亡率高，危害极大，其确切发生发展机制，尚不明确。
血管内皮细胞(VEC)衬于血管内壁，参与多种十分重要的生命活动。正因为其处于循环系统，血液系统和组织细胞成分的特殊位置，内皮损伤在多种疾病的发病学地位备受关注。在疾病状态，因VEC结构损伤和功能异常参与发生机制的一组病变被称为“内皮病”(endotheliopathy)。
本研究测定了四氧嘧啶致糖尿病大鼠和正常大鼠血CEC和ACE，旨在探讨内皮损伤在早发性糖尿病大血管病变发生中的可能作用。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验动物与分组 给体重165～270g的雌性Wistar大鼠(重庆医科大学实验动物中心提供)腹腔内注射2%四氧嘧啶(200mg/kg)，三日后取尾静脉血测定血糖(邻甲苯胺法)。随机抽取血糖大于13.0mmol/L且于第四周时血糖仍大于此值者共30只大鼠作为糖尿病组(体重251.67±52.3g)。另取健康雌性Wistar大鼠30只，腹腔内注射无菌生理盐水(200mg/kg)作为研究对照组(体重261.35±67.48g)。两组大鼠自由饮水进食。
1.2 方法
1.2.1 CEC计数与鉴定 Percoll试剂：(Sigma，USA)、Ⅷ因子相关抗原兔抗鼠血清(上海生物制品研究所)、羊抗兔IgG抗体(医学科学院微生物流行病研究所)。CEC计数：取鼠心腔血2ml加等体积含Percoll生理盐水充分混匀后置2000rpm离心20分钟，弃上清液；取中层液少许滴于普通血球计数池，计数九个大方格内(0.9ul)CEC；每份标本计数四次，求其均值。CEC鉴定 取备检悬液少许涂于玻片上，甲醇固定，磷酸缓冲液漂洗；后加Ⅷ因子相关抗原兔抗鼠血清，置37℃温育30分钟，加磷酸缓冲液再漂洗；干后加异硫氰酸荧光标记的羊抗兔IgG，置荧光显微镜下观察，呈黄绿色荧光者即为CEC。阴性对照将Ⅷ因子相关抗原兔抗鼠血清改为磷酸缓冲液。
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1.2.2 血清ACE活力测定 试剂：30mmol/L马尿酰甘氨酰底物液、40mmol/L甘氨酰甘氨酸标准液、100g/L钨酸钠溶液、0.33mol/L稀硫酸液、0.1mol/L硼酸缓冲液(pH9.6)、60mmol/L三硝基苯磺酸钠溶液(以上试剂均购自海军总医院生化实验中心)。测定：按化冰等[2]推荐方法进行。酶活力计算公式为：光密度A420(测定管一定白管)×1200u。
1.2.3 统计学处理 所有实验结果均以均数±标准差(χ±s)表示；显著性比较采用两组间t检验；相关分析运用直线回归分析。
2 结 果
2.1 糖尿病组CEC计数为2.52±0.67个/0.9ul；对照组CEC计数为0.72±0.21个/0.9ul。前者较后者显著升高(P<0.01)。
2.2 糖尿病鼠血清ACE活力(980.02±132.18u)较健康大鼠血清ACE活力(560.07±150.03u)显著升高；二者相比，差异具有统计学意义(P<0.01)。
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2.3 糖尿病组血CEC及ACE升高与其高血糖水平间相关系数分别为0.88和0.98(P均小于0.01)。
3 讨 论
糖尿病大血管并发症发病率、致残率、死亡率高，发生较早，进展迅速，其确切发病机制尚未阐明。
近年来，内皮功能及内皮损伤研究进展日新月异。现认为，血管内皮具有屏障作用、物质转运作用和信号传递作用，它还合成并分泌多种生物活性物质，参与维持血液流变学、血管张力和血管壁细胞成分的自稳态。在病理状态时，VEC的结构损伤与功能异常被认为参与了一组“内皮病”的发病机制，构成多种疾病的发病学基础。这组疾病包括动脉硬化、高血压以及充血性心衰。Ross认为，内皮损伤是动脉硬化(大血管病变)的始动环节[3]。
VEC呈单层被覆于血管内壁，衰老时脱落入血，成为CEC。长期以来，致力于VEC的研究大多是在体外进行的，寻找VEC的体内实验方法进行临床研究，就成为目前面临的重要课题。近年来，国外开展的CEC计数检查，从外周血中检出源于VEC的CEC[4]，为解决这项难题开辟了一个新领域。所谓CEC是指在生理或病理情况下从外周血中获得的内皮细胞，其中包括无核的内皮细胞残骸和有核的可供体外培养的内皮细胞。据文献报道，生理条件下外周血中存在一定数量CEC，而在急性心肌梗塞、重度心绞痛、外周血管疾病以及吸烟时，CEC计数增多，给予免疫抑制剂时，CEC计数减少。
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已有一些研究表明，实验性糖尿病和糖尿病患者存在内皮功能异常或结构损伤[5～7]。我们在四氧嘧啶致糖尿病大鼠体内检出较高的CEC计数和血清ACE活力增高，分别从形态上和功能上反映了大鼠糖尿病存在内皮损伤，与文献结论一致。
运用密度梯度离心法测定糖尿病大鼠血循环中的CEC计数，发现其CEC计数显著高于健康对照。目前尚未见到糖尿病时CEC计数改变的报道。由于CEC是在体内仅有的可作为血管损伤的指示物[8]，其计数升高标志着糖尿病时出现了广泛的血管损伤和内皮功能异常。
ACE主要定位于血管内皮细胞的管腔面，其活性主要位于肺循环。ACE通过血管紧张素-激肽系统发挥调节血液动力学、血管壁张力等多项重要功能[9]。它被当作反映血管损伤的间接指标。
我们的实验表明，四氧嘧啶所致大鼠糖尿病早期(第四周)其血清ACE活力已有显著升高，与文献报道一致[10，11]。ACE血清活力升高表明局部或全身合成增加，意味着血管紧张素-激肽系统平衡失调。通过血管紧张素Ⅱ的多样化生物学作用，促进糖尿病大血管病变的发生。
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近年来的研究，结果显示糖尿病大血管病变发生前已有内皮结构损伤或功能异常。我们的实验显示，大鼠糖尿病第四周时血清ACE活力已见升高，二者是一致的。与CEC计数一样，ACE活力升高亦可作为糖尿病大血管病变发生的预报因子。
Ross认为，内皮损伤是动脉硬化发生的始动环节。据此我们推测，内皮损伤可能是糖尿病大血管病变发生的始动环节。
总之，我们的研究结果表明，四氧嘧啶致大鼠糖尿病的早期，其循环CEC计数和血清ACE活力升高标志着血管内皮损伤与功能异常的出现。且二者的升高与血糖水平的升高显著正相关，提示血管内皮损伤与代谢控制不良有关。血管内皮损伤在糖尿病大血管病变的发生中可能起到一定作用。
参考文献
[1] 杨映波，王正国，刘怀琼，等.血循环中内皮细胞数量变化意义的初探.第三军医大学学报，1990,12：209
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[2] 化冰，赵忠，王赋敏，等.血管紧张素Ⅰ转换酶三硝基苯磺酸钠比色测定法，临床检验杂志.1986,4：67
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[6] Parving HH,Nielsen FS,Bang LE et al.Diabetologia.1996,39;1590
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[8] Takanashi H,Harker LA.Thromb Res.1983,31:1
[9] Erdos EG.Hypertension.1990,16:363
[10] Lieberman J,Sastre A.Ann Intern Med ,1980,93:825
[11] Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Diabetes.1994,43;384, http://www.100md.com