内毒素和内皮细胞的结合能力及对α-Catenin的影响
作者：王晓军 罗向东 梁光萍 罗 勤 杨宗城
单位：第三军医大学西南医院烧伤研究所(重庆 400038)
关键词：内毒素；内皮细胞；α-Catenin
重庆医学990402 摘 要 目的：寻找内毒素和培养的内皮细胞直接结合的证据及对胞内连接蛋白α-Catenin的影响，观察内毒素对内皮细胞的损伤特性。方法：(1)荧光标记的内毒素(2μg/ml)和培养的内皮细胞在无血清下共同孵育后用荧光分光光度计进行检测；(2)内毒素(2μg/ml)刺激无血清培养的内皮细胞后用ELISA测定内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的变化。结果：内皮细胞和内毒素孵育10、20、40和60分后荧光强度分别为对照组的1.87、3.97、3.41(P<0.01)和2.02(P<0.05)倍；胞内连接蛋白的表达各时相点和对照组比均明显降低(P<0.05和<0.01)。结论：内毒素在无血清情况下可以和内皮细胞结合，同时可以影响胞内连接蛋白α-Catenin的表达状态，并不依赖是否有血清的存在。
, 百拇医药
Combinative Ability of Endotoxin With Cultured Endothelial Cells and
Effects of Endotoxin on Endothelial Intracellular α-Catenin
Wang Xiaojun,Luo Xiangdong,Liang Guongping,Luo Qin,Yang Zongcheng,Burn Research Institute,Southwestern Hospital,Third Military Medical University,Chogqing 400038
Abstracts:Object:To explore the evidence of the direct combination of endotoxin with cultured endothelial cells and the effects of endotoxin on intracellular α-Catenin,so as to study the features of endotoxic damage to endothelial cells.Methods:(1)After the FITC labeled endotoxin(2μg/ml)was co-incubated with cultured endothelial cells in the absence of serum,the changes of F values on endothelial cells was detected by fluorescent spectrophotometer.(2)Cultured endothelial cclls without serum were stimulatcd by cndotoxin (2μg/ml)and the changes of intracellular α-Catenin expression were measured with ELISA.Results:The F values at 10、20、40 and 60 min after that endothellal cells were incubated with endotoxin were 1.87(P<0.05)、3.97、3.41(P<0.01)and 2.02(P<0.01)times of that of control group respecfively.The expression of intracellular α-Catenin was much lower than that of control group (P<0.05 or P<0.01)at each designed time points.Conclusions:Endotoxin can combine with endothelial cells in the absence of serum,and interfere with the expressive state of intracellular α-Catenin is independent of serum.
, 百拇医药
Key Words:endotoxin endothelial cell α-Catenin
严重烧伤后内毒素对组织脏器的损害是导致多脏器功能衰竭的主要因素之一。早期的病理基础是内皮细胞结构和功能的改变，所以内毒素对内皮细胞损伤机制的研究是非常重要的。本研究就是探讨内毒素和内皮细胞的结合状况及对胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响 ，进一步探讨内毒素对内皮细胞的损伤机制。
1 材料和方法
1.1 试剂 内毒素(L2630)、荧光标记内毒素(F2665)M199培养液、培养瓶和96孔培养板从SIGMA公司购入。人脐静脉内皮细胞(ECV-304)ATCC购入。IgG/HRP(ZB-2301)中山公司购入。
1.2 内毒素浓度的配制用M199培养液(不含血清)将内毒素配成2μg/ml的浓度进行刺激。
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1.3 内毒素和内皮细胞结合试验 将ECV-304细胞用0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化，高密度接种于2.5cm×1.3cm的玻璃片上，待完全融合、附壁和伸展后用无血清培养液培养4小时，用无血清培养液洗三遍，加入浓度为2μg/ml荧光标记的内毒素，10、20、40和60分后，用0.01M的PBS洗三次，去掉残存、未结合的内毒素后用荧光分光光度计检测荧光强度(F值)，激发波长250nm，吸收波长350nm。并设正常对照组。
1.4 内毒素对内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响[2] 将ECV-304细胞用0.25%胰蛋酶-0.01%EDTA消化，调整细胞密度为2×105个/ml接种于96孔板(200μl/孔)，待细胞完全融合后弃上清，用无血清培养液洗三次后培养4小时，加入浓度为2μg/ml的内毒素，分为正常对照组，1、2、4、6、12、24h七个时相点，皿于37℃二氧化碳培养箱内培养。依次加入下列试剂：0.25%戊二醛固定，3%过氧化氢，0.3%Tniton X-100，3%小牛血清白蛋白，α-Catenin单抗(1∶500，4℃，过夜)，IgG/HRP(1∶3000，37℃，1h)，每孔加入液体量为100μl，每次加液前用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次3min。用磷酸枸橼酸钠缓冲液，0.004%邻苯二胺(OPD)和0.015%过氧化氢显色(37℃，5min)，2mol/L硫酸终止反应。在酶标仪(波长492)上读取光密度(Dλ)值。用PBS代替一抗孵育细胞，测定背景染色，用实验组的Dλ值减去背景值表示内皮细胞内连接蛋白α-Catenin的表达。
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1.5 统计学处理 以x±s，采用t检验。
2 结 果
2.1 内毒素和内皮细胞的结合试验内皮细胞和荧光标记的内毒素孵育10、20、40和60分后荧光强度分别为对照组的1.87、3.97、3.41(P<0.01)和2.02(P<0.05)倍，见表1。
表1 内毒素(2μg/ml)和内皮细胞的结合试验(F，x±s，n=6) Control
Incubated times(min)
10
20
40
60
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385.0±55.1
717.9±255.9*
1527.8±257.1**
1309.0±266.4**
777.3±120.7*
*P<0.05 **P<0.01，V S正常对照组2.2 内毒素对内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响 内毒素对内皮细胞刺激后1小时开始即有差异(P<0.05)，从2小时开始至24小时有非常显著差异(P<0.01)，见表2。表2 内毒素对内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响(D492，x±s，n=10) Control
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Incubated times(h)
1
2
4
6
12
24
1.64±0.34
1.31±0.43*
1.02±0.41**
0.97±0.11**
0.84±0.06**
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0.74±0.12**
0.59±0.10**
*P<0.05 **P<0.01，V S正常对照组
3 讨 论
目前对内毒素损伤内皮细胞的机制有大的争论，主要焦点在于能否构成对内皮细胞的直接损伤，是否需要激活白细胞和血浆中可溶性CD14的参与[2]，以及直接损伤的机制和信号传导通路，本研究就是对此进行探讨。
3.1 内毒素和内皮细胞的直接结合 本实验发现荧光标记的内毒素和内皮细胞作用后10min即有大量的内毒素和内皮细胞结合，为正常对照组的1.87倍，到行60min仍维持在高水平。在本实验中，加入内毒素前已将培养的内皮细胞用无血清培养液清洗并用血清培养液培养4小时，完全排除了血清中可溶性CD14的干扰，说明内毒素和内皮细胞间有某种特定的结合位点，只是目前仍不清楚，所以内毒素和内皮细胞的直接结合和直接参与内皮细胞的损伤是成立的，具体损伤机制尚需进一步研究。
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3.2 内毒素在无血清的参与下能够影响内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin的表达 本所已对内毒素对主要参与内皮细胞间粘附连接成分的VE-钙粘附分子表达的影响进行过研究，发现能影响其表达[3]。本研究主要探讨内毒素对VE-钙粘附分子的胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响，结果发现随孵育时间的延长α-Catenin的表达明显降低。内皮细胞的胞内连接蛋白Catenins分为α、β、γ-Catenin三种，是分别为102kDa、95kDa和82kDa的钙粘附分子胞内连接蛋白，三种的连接方式是β和γ-Catenin相连共同和转膜蛋白VE-钙粘附分子的胞内部分相连，再和α-Catenin相连，α-Catenin再和胞内的骨架蛋白(肌动蛋白丝、微丝、微管等)相连，构成内皮细胞的完整粘附连接和骨架结构，同时Catenin又和信号传导有关[4]，鉴于α-Catenin的结构和功能特性是否可能通过内毒素对此表达的影响寻找参与直接损伤内皮细胞的因素，具体机制需进一步研究。
结论：在无血清的参与下内毒素可以和内皮细胞胞直接结合，可以影响内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin的表达。
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参考文献
[1] 朱世辉，张素贞，苏波，等.内皮素、一氧化氮、烫伤血清大鼠心脏微血管内皮细胞ICAM-I表达的影响，第二军医大学学报，1996,17(增刊)：48
[2] Yang Z,Breider M.A,Carroll R.C,Miller M.S,Bochsler P.M.J Leukoc Biol.1996,58:241
[3] 王晓军，罗向东，梁光萍，等.内毒素和烫伤血清对培养的大鼠心脏微血管内皮细胞间连接的影响，第三军医大学学报1998，20(2)：93
[4] Jill E.Nieset,Ann R.J.Cell Sci.1997，110:1013, http://www.100md.com
单位：第三军医大学西南医院烧伤研究所(重庆 400038)
关键词：内毒素；内皮细胞；α-Catenin
重庆医学990402 摘 要 目的：寻找内毒素和培养的内皮细胞直接结合的证据及对胞内连接蛋白α-Catenin的影响，观察内毒素对内皮细胞的损伤特性。方法：(1)荧光标记的内毒素(2μg/ml)和培养的内皮细胞在无血清下共同孵育后用荧光分光光度计进行检测；(2)内毒素(2μg/ml)刺激无血清培养的内皮细胞后用ELISA测定内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的变化。结果：内皮细胞和内毒素孵育10、20、40和60分后荧光强度分别为对照组的1.87、3.97、3.41(P<0.01)和2.02(P<0.05)倍；胞内连接蛋白的表达各时相点和对照组比均明显降低(P<0.05和<0.01)。结论：内毒素在无血清情况下可以和内皮细胞结合，同时可以影响胞内连接蛋白α-Catenin的表达状态，并不依赖是否有血清的存在。
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Combinative Ability of Endotoxin With Cultured Endothelial Cells and
Effects of Endotoxin on Endothelial Intracellular α-Catenin
Wang Xiaojun,Luo Xiangdong,Liang Guongping,Luo Qin,Yang Zongcheng,Burn Research Institute,Southwestern Hospital,Third Military Medical University,Chogqing 400038
Abstracts:Object:To explore the evidence of the direct combination of endotoxin with cultured endothelial cells and the effects of endotoxin on intracellular α-Catenin,so as to study the features of endotoxic damage to endothelial cells.Methods:(1)After the FITC labeled endotoxin(2μg/ml)was co-incubated with cultured endothelial cells in the absence of serum,the changes of F values on endothelial cells was detected by fluorescent spectrophotometer.(2)Cultured endothelial cclls without serum were stimulatcd by cndotoxin (2μg/ml)and the changes of intracellular α-Catenin expression were measured with ELISA.Results:The F values at 10、20、40 and 60 min after that endothellal cells were incubated with endotoxin were 1.87(P<0.05)、3.97、3.41(P<0.01)and 2.02(P<0.01)times of that of control group respecfively.The expression of intracellular α-Catenin was much lower than that of control group (P<0.05 or P<0.01)at each designed time points.Conclusions:Endotoxin can combine with endothelial cells in the absence of serum,and interfere with the expressive state of intracellular α-Catenin is independent of serum.
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Key Words:endotoxin endothelial cell α-Catenin
严重烧伤后内毒素对组织脏器的损害是导致多脏器功能衰竭的主要因素之一。早期的病理基础是内皮细胞结构和功能的改变，所以内毒素对内皮细胞损伤机制的研究是非常重要的。本研究就是探讨内毒素和内皮细胞的结合状况及对胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响 ，进一步探讨内毒素对内皮细胞的损伤机制。
1 材料和方法
1.1 试剂 内毒素(L2630)、荧光标记内毒素(F2665)M199培养液、培养瓶和96孔培养板从SIGMA公司购入。人脐静脉内皮细胞(ECV-304)ATCC购入。IgG/HRP(ZB-2301)中山公司购入。
1.2 内毒素浓度的配制用M199培养液(不含血清)将内毒素配成2μg/ml的浓度进行刺激。
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1.3 内毒素和内皮细胞结合试验 将ECV-304细胞用0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化，高密度接种于2.5cm×1.3cm的玻璃片上，待完全融合、附壁和伸展后用无血清培养液培养4小时，用无血清培养液洗三遍，加入浓度为2μg/ml荧光标记的内毒素，10、20、40和60分后，用0.01M的PBS洗三次，去掉残存、未结合的内毒素后用荧光分光光度计检测荧光强度(F值)，激发波长250nm，吸收波长350nm。并设正常对照组。
1.4 内毒素对内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响[2] 将ECV-304细胞用0.25%胰蛋酶-0.01%EDTA消化，调整细胞密度为2×105个/ml接种于96孔板(200μl/孔)，待细胞完全融合后弃上清，用无血清培养液洗三次后培养4小时，加入浓度为2μg/ml的内毒素，分为正常对照组，1、2、4、6、12、24h七个时相点，皿于37℃二氧化碳培养箱内培养。依次加入下列试剂：0.25%戊二醛固定，3%过氧化氢，0.3%Tniton X-100，3%小牛血清白蛋白，α-Catenin单抗(1∶500，4℃，过夜)，IgG/HRP(1∶3000，37℃，1h)，每孔加入液体量为100μl，每次加液前用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次3min。用磷酸枸橼酸钠缓冲液，0.004%邻苯二胺(OPD)和0.015%过氧化氢显色(37℃，5min)，2mol/L硫酸终止反应。在酶标仪(波长492)上读取光密度(Dλ)值。用PBS代替一抗孵育细胞，测定背景染色，用实验组的Dλ值减去背景值表示内皮细胞内连接蛋白α-Catenin的表达。
, 百拇医药
1.5 统计学处理 以x±s，采用t检验。
2 结 果
2.1 内毒素和内皮细胞的结合试验内皮细胞和荧光标记的内毒素孵育10、20、40和60分后荧光强度分别为对照组的1.87、3.97、3.41(P<0.01)和2.02(P<0.05)倍，见表1。
表1 内毒素(2μg/ml)和内皮细胞的结合试验(F，x±s，n=6) Control
Incubated times(min)
10
20
40
60
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385.0±55.1
717.9±255.9*
1527.8±257.1**
1309.0±266.4**
777.3±120.7*
*P<0.05 **P<0.01，V S正常对照组2.2 内毒素对内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响 内毒素对内皮细胞刺激后1小时开始即有差异(P<0.05)，从2小时开始至24小时有非常显著差异(P<0.01)，见表2。表2 内毒素对内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响(D492，x±s，n=10) Control
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1
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1.64±0.34
1.31±0.43*
1.02±0.41**
0.97±0.11**
0.84±0.06**
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0.74±0.12**
0.59±0.10**
*P<0.05 **P<0.01，V S正常对照组
3 讨 论
目前对内毒素损伤内皮细胞的机制有大的争论，主要焦点在于能否构成对内皮细胞的直接损伤，是否需要激活白细胞和血浆中可溶性CD14的参与[2]，以及直接损伤的机制和信号传导通路，本研究就是对此进行探讨。
3.1 内毒素和内皮细胞的直接结合 本实验发现荧光标记的内毒素和内皮细胞作用后10min即有大量的内毒素和内皮细胞结合，为正常对照组的1.87倍，到行60min仍维持在高水平。在本实验中，加入内毒素前已将培养的内皮细胞用无血清培养液清洗并用血清培养液培养4小时，完全排除了血清中可溶性CD14的干扰，说明内毒素和内皮细胞间有某种特定的结合位点，只是目前仍不清楚，所以内毒素和内皮细胞的直接结合和直接参与内皮细胞的损伤是成立的，具体损伤机制尚需进一步研究。
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3.2 内毒素在无血清的参与下能够影响内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin的表达 本所已对内毒素对主要参与内皮细胞间粘附连接成分的VE-钙粘附分子表达的影响进行过研究，发现能影响其表达[3]。本研究主要探讨内毒素对VE-钙粘附分子的胞内连接蛋白α-Catenin表达的影响，结果发现随孵育时间的延长α-Catenin的表达明显降低。内皮细胞的胞内连接蛋白Catenins分为α、β、γ-Catenin三种，是分别为102kDa、95kDa和82kDa的钙粘附分子胞内连接蛋白，三种的连接方式是β和γ-Catenin相连共同和转膜蛋白VE-钙粘附分子的胞内部分相连，再和α-Catenin相连，α-Catenin再和胞内的骨架蛋白(肌动蛋白丝、微丝、微管等)相连，构成内皮细胞的完整粘附连接和骨架结构，同时Catenin又和信号传导有关[4]，鉴于α-Catenin的结构和功能特性是否可能通过内毒素对此表达的影响寻找参与直接损伤内皮细胞的因素，具体机制需进一步研究。
结论：在无血清的参与下内毒素可以和内皮细胞胞直接结合，可以影响内皮细胞胞内连接蛋白α-Catenin的表达。
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参考文献
[1] 朱世辉，张素贞，苏波，等.内皮素、一氧化氮、烫伤血清大鼠心脏微血管内皮细胞ICAM-I表达的影响，第二军医大学学报，1996,17(增刊)：48
[2] Yang Z,Breider M.A,Carroll R.C,Miller M.S,Bochsler P.M.J Leukoc Biol.1996,58:241
[3] 王晓军，罗向东，梁光萍，等.内毒素和烫伤血清对培养的大鼠心脏微血管内皮细胞间连接的影响，第三军医大学学报1998，20(2)：93
[4] Jill E.Nieset,Ann R.J.Cell Sci.1997，110:1013, http://www.100md.com