血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞促增生作用的研究
作者：李爱民 何作云 周小波 覃 军
单位：第三军医大学新桥医院心内科(重庆 400037)
关键词：血管紧张素Ⅱ；洛沙坦；平滑肌细胞；血管；增生
重庆医学990401 摘 要 目的：探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞的致增生效应及洛沙坦的拮抗作用。方法：采用贴块法培养幼兔主动脉平滑肌细胞，通过检测细胞甲基-3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入、MTT廓清和细胞数量来评价不同浓度AngⅡ及/或洛沙坦预处理对血管平滑肌细胞增生的影响 。结果：AngⅡ呈剂量依赖性地增加平滑肌细胞的3H-TdR掺入和MTT廓清而对血管平滑肌细胞数量无明显影响；洛沙坦预处理可显著地抑制AngⅡ所诱导的3H-TdR掺入和MTT廓清。结论：AngⅡ可促进血管平滑肌细胞增生，洛沙坦则可拮抗其致增生效应。
, http://www.100md.com
Effects of Losartan on Angiotensin Ⅱ-induced Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells
Li Aimin,He Zuoyun,Zhou Xiaobo et al.
Department of Cardiology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400037
Abstract:Objective:To investigate the effects of losartan on the proliferation of cultured rabbit vascular smooth muscle cells(VSMC) induced by angiotensin Ⅱ(AngⅡ).Methods:Methyl-3H thymidine (3H-TdR)incorporation,MTT cleaning and cell counting were determined on vsmc after stimulation of Ang Ⅱ,or with pretreatment by losartan.Results:AngⅡcaused marked increases of 3 H-TdR incorporation and MTT cleaning in VSMC in a concentration-dependent manner.These proliferative changes induced by AngⅡ were clearly blocked by the pretreatment of losartan.Conclusions:AngⅡstimulated the proliferation of VSMC,and losartan may clearly antagonize its effects.
, 百拇医药
Key words:AngiotensinⅡ Losartan smooth muscle cells,vascular proliferation
血管平滑肌细胞(VSMC)增生与迁移在动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄过程中发挥关键性作用。近期研究显示肾素血管紧张素系统可能参与以上过程[1]。洛沙坦(Losartan,Los)是最先研制并上市的一种非肽类血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)Ⅰ型受体拮抗剂，临床应用显示其对高血压与心力衰竭具有良好的治疗效果且副作用更少，但它在动脉粥样硬化发生与发展过程中的作用尚不清楚。本研究利用AngⅡ刺激体外培养血管平滑肌细胞，探讨洛沙坦对其促增生作用的影响。
1 材料与方法
1.1 血管平滑肌细胞的培养与鉴定 采用贴块法培养[2]。选择体重为0.6～1.0kg的健康雄性长耳白兔，断颈法处死动物，无菌下取出胸主动脉，用RPMI1640培养液(Sigma)洗两次，以除净血液，置于培养皿中，沿纵轴剪开血管腔，迅速撕除外膜弃之，用锋利刀片轻刮内膜面两次以除去内皮。在培养液中将组织块剪成约1mm×1mm的小块，移入50ml培养瓶，加入含20%胎牛血清(FCS，Hyclone)的RPMI1640培养液，置37℃，5%CO2孵箱内静置培养4天后换液，待细胞长满瓶底后用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验采用第3～5代细胞。血管平滑肌细胞鉴定：光镜下细胞呈谷与峰样生长，特异性抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫学染色见胞浆呈阳性染色。实验前48小时换用无血清培养基，以使细胞处于增殖的相对静息期。
, 百拇医药
1.2 平滑肌细胞增生的MTT法检测[3] 实验分成对照组，AngⅡ刺激组和Losartan干预组。将平滑肌细胞密度调整为1×105个/ml，以每孔100μl加入96孔培养板中，另补加100μl含2%胎牛血清的无酚红F-12HAM培养基(Sigma)，同时按分组分别加入AngⅡ(Sigma)和Losartan(默沙东公司惠赠)。分组：2%FCS组、AngⅡ刺激组(10-6、10-8和-1-10mol/L)、Losartan干预组(10-4、10-5和10-6mol/L Losartan，30分钟后再加入10-7mol/L AngⅡ)及单纯Losartan组(10-4mol/L)。置培养箱内48小时，每孔加入1%MTT(二甲基噻唑二苯基溴化四唑，Fluka)20μl，再培养5小时后吸出培养液，PBS洗两次，每孔加入二甲亚砜200μl，振荡培养板使沉淀完全溶解，用DG-3022A型酶联免疫检测仪于570nm波长下检测各孔吸光度(OD值)。每个浓度取12孔的均值作为每个浓度的OD值。
, 百拇医药
1.3 3H-TdR掺入[4] 实验分组同2。将细胞密度调为1×105个/ml，以每孔1ml加入24孔板中，按分组分别加入AngⅡ和Losartan，置37℃孵箱培养30小时。于收获细胞前6小时加入3H-TdR(上海原子能研究院，1mCi/ml)，使其终浓度为2μCi/ml。弃培养液，用冷PBS洗5次，0.25%胰蛋白酶消化收获细胞，离心洗涤细胞3次，弃洗液。以100μl蒸馏水溶解细胞沉淀，取20μl滴于微孔滤膜上，吹干后行液闪测定。每组取4孔细胞的均值。
1.4 VSMC计数 采用血球计数板法。将细胞密度调为2×104个/ml，以每孔1ml加入24孔板中，置37℃，5%CO2条件下培养4天后行细胞计数。分组：(1)2%FCS组；(2)2%FCS+10-6mol/L AngⅡ组；(3)2%FCS+10-4mol/L Losartan+10-6mol/l AngⅡ组；(4)2%FCS+10-4mol/L Losartan组；(5)20%FCS组；(6)20%FCS+10-4mol/L Losartan组。每组实验重复5次。
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1.5 统计学处理 数据以均数±标准差表示，组间显著性比较用方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 VSMC增生的MTT法检测结果酶标仪光密度测定显示，AngⅡ呈剂量依赖性地促进VSMC对MTT的摄取与代谢，以10-6mol/L AngⅡ的作用最显著，10-8mol/L AngⅡ的作用次之(P均<0.01)，而10-10mol/L AngⅡ促增生作用不明显(P>0.05)。Losartan预处理可明显地抑制VSMC对MTT的摄取与代谢，以10-5mol/L时的作用最强(P<0.01)，单纯Losartan干预对MTT的摄取与代谢无明显影响。
2.2 3H-TdR掺入结果 见表1。
, http://www.100md.com 表1 Losartan对VSMC内3H-TdR掺入的影响 分 组
3 H-TdR掺入值(CPM)
掺入率
(%)
2%FCS
1883±162
100
2%FCS+10-6mol/L AngⅡ
4086±215*
223
, 百拇医药 2%FCS+10-8mol/L AngⅡ
2858±193*
152
2%FCS+10-10mol/L AngⅡ
1967±172
105
2%FCS+10-4mol/L Los
1816±158
-4
2%FCS+10-4mol/L Los+10-7mol/L AngⅡ
, 百拇医药
1912±181
102
2%FCS+10-5mol/L Los+10-7mol/L AngⅡ
2085±191
111
2%FCS+10-5mol/L Los+10-7mol/L AngⅡ
2252±185
120
*：与2%FCS组比较，P<0.01
2.3 VSMC计数结果 见表2。表2 VSMC对不同物质增殖的反应
, 百拇医药
VSMC计数(1×104/ml)
P值
2%FCS
3.97±0.90
2%FCS+AngⅡ
4.24±0.92
>0.05
2%FCS+Los+AngⅡ
3.99±0.80
>0.05
2%FCS+Los
, 百拇医药 3.94±0.83
>0.05
2%FCS
9.43±1.18
<0.01
2%FCS+Los
9.42±1.19
<0.01
3 讨 论
AngⅡ是一种作用强大的促有丝分裂剂，既往研究表明AngⅡ可促进离体培养VSMC的增殖与肥大[5]。本研究显示，在低浓度血清条件下，AngⅡ呈剂量依赖性地增加VSMC内3H-TdR掺入和对MTT的摄取与代谢。AngⅡ促进VSMC增生的过程可能通过蛋白激酶C(PKC)与丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)来介导[6]，因为PKC与MAPK是细胞外信号向核内传递的共同通路与中心环节。MAPK的活化可激活一系列核蛋白，如核因子-kB和活化蛋白-1(AP-1)，从而进一步诱导其它与增生有关基因的表达，导致VSMC增殖与肥大[7]。在低浓度血清存在时，AngⅡ对VSMC的数量无明显影响，这与其他学者报道的AngⅡ仅刺激SHR平滑肌细胞增殖而对WKY平滑肌细胞增殖无明显影响的结果相似[8]，提示AngⅡ对于不同生长状态的细胞具有不同的作用，对于异常的VSMC，AngⅡ可同时促进其DNA与蛋白质合成，导致细胞分裂与肥大，而对于正常生长状态下的VSMC，AngⅡ虽可增加其细胞内DNA合成，但不足以促成细胞的有丝分裂。本研究及其他学者的研究也证实，高浓度血清本身具有显著促分裂效应，使VSMC数量增加1倍以上。
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Losartan特异性地与细胞膜上的AngⅡⅠ型受体结合，从而拮抗AngⅡ的生物学效应。有研究报道血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体拮抗剂UP269-3可抑制由AngⅡ诱导的培养正常血压与自发性高血压大鼠VSMC的增殖与肥大，体内试验则显著抑制气囊损伤后大鼠颈动脉内膜的增生反应[9]。本研究显示用Losartan预处理培养VSMC可显著地抑制AngⅡ所诱导的3H-TdR掺入和MTT摄取与代谢，但它对高浓度血清所致的VSMC增殖无明显抑制作用。这提示高浓度血清是通过非AngⅡ受体途径来介导VSMC的增生，有报道显示某些生长因子可能参与了VSMC的这一增殖过程[10]，这可能是高浓度FCS促进培养VSMC增生的机制之一，因为FCS中含有多种生长因子。总之，AngⅡ可促进体外培养VSMC内DNA合成，而Losartan可拮抗其促增生效应，可能在防治早期动脉粥样硬化过程中发挥一定作用。
参考文献
[1] Song KF,Shiota N,Takai S,et al.Atherosclerosis, 1998,138:171
, 百拇医药
[2] Champbell J,Champbell G,Ross R.Physical Rev, 1979,59:211
[3] 宋良文，崔雪梅，王德文.中华病理学杂志，1997,26：352
[4] 胡静，温进坤，魏素珍.等.中华物理医学杂志，1994,16:211
[5] Takeuchik K,Nakamura N,Cook NS,et al.Biochem Biophys Res Commun, 1990,72:1189
[6] Davis RJ.J Biol Chem 1993,268:14553
[7] 赵彦来，孙开来.中国循环杂志，1998，13：372
[8] Stiouffer GA,Owens GK.Circ Res 1992,70:820
[9] Ito, H,Mukoyama M,Prott RE,et al. J Clin Invest,1993,91:2268
[10] Virone Oddos A,Deangle V,Provost D,et al.Br J Pharmacol, 1997,120:488
, 百拇医药
单位：第三军医大学新桥医院心内科(重庆 400037)
关键词：血管紧张素Ⅱ；洛沙坦；平滑肌细胞；血管；增生
重庆医学990401 摘 要 目的：探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对血管平滑肌细胞的致增生效应及洛沙坦的拮抗作用。方法：采用贴块法培养幼兔主动脉平滑肌细胞，通过检测细胞甲基-3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入、MTT廓清和细胞数量来评价不同浓度AngⅡ及/或洛沙坦预处理对血管平滑肌细胞增生的影响 。结果：AngⅡ呈剂量依赖性地增加平滑肌细胞的3H-TdR掺入和MTT廓清而对血管平滑肌细胞数量无明显影响；洛沙坦预处理可显著地抑制AngⅡ所诱导的3H-TdR掺入和MTT廓清。结论：AngⅡ可促进血管平滑肌细胞增生，洛沙坦则可拮抗其致增生效应。
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Effects of Losartan on Angiotensin Ⅱ-induced Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells
Li Aimin,He Zuoyun,Zhou Xiaobo et al.
Department of Cardiology,Xinqiao Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400037
Abstract:Objective:To investigate the effects of losartan on the proliferation of cultured rabbit vascular smooth muscle cells(VSMC) induced by angiotensin Ⅱ(AngⅡ).Methods:Methyl-3H thymidine (3H-TdR)incorporation,MTT cleaning and cell counting were determined on vsmc after stimulation of Ang Ⅱ,or with pretreatment by losartan.Results:AngⅡcaused marked increases of 3 H-TdR incorporation and MTT cleaning in VSMC in a concentration-dependent manner.These proliferative changes induced by AngⅡ were clearly blocked by the pretreatment of losartan.Conclusions:AngⅡstimulated the proliferation of VSMC,and losartan may clearly antagonize its effects.
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Key words:AngiotensinⅡ Losartan smooth muscle cells,vascular proliferation
血管平滑肌细胞(VSMC)增生与迁移在动脉粥样硬化及血管成形术后再狭窄过程中发挥关键性作用。近期研究显示肾素血管紧张素系统可能参与以上过程[1]。洛沙坦(Losartan,Los)是最先研制并上市的一种非肽类血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)Ⅰ型受体拮抗剂，临床应用显示其对高血压与心力衰竭具有良好的治疗效果且副作用更少，但它在动脉粥样硬化发生与发展过程中的作用尚不清楚。本研究利用AngⅡ刺激体外培养血管平滑肌细胞，探讨洛沙坦对其促增生作用的影响。
1 材料与方法
1.1 血管平滑肌细胞的培养与鉴定 采用贴块法培养[2]。选择体重为0.6～1.0kg的健康雄性长耳白兔，断颈法处死动物，无菌下取出胸主动脉，用RPMI1640培养液(Sigma)洗两次，以除净血液，置于培养皿中，沿纵轴剪开血管腔，迅速撕除外膜弃之，用锋利刀片轻刮内膜面两次以除去内皮。在培养液中将组织块剪成约1mm×1mm的小块，移入50ml培养瓶，加入含20%胎牛血清(FCS，Hyclone)的RPMI1640培养液，置37℃，5%CO2孵箱内静置培养4天后换液，待细胞长满瓶底后用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验采用第3～5代细胞。血管平滑肌细胞鉴定：光镜下细胞呈谷与峰样生长，特异性抗平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫学染色见胞浆呈阳性染色。实验前48小时换用无血清培养基，以使细胞处于增殖的相对静息期。
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1.2 平滑肌细胞增生的MTT法检测[3] 实验分成对照组，AngⅡ刺激组和Losartan干预组。将平滑肌细胞密度调整为1×105个/ml，以每孔100μl加入96孔培养板中，另补加100μl含2%胎牛血清的无酚红F-12HAM培养基(Sigma)，同时按分组分别加入AngⅡ(Sigma)和Losartan(默沙东公司惠赠)。分组：2%FCS组、AngⅡ刺激组(10-6、10-8和-1-10mol/L)、Losartan干预组(10-4、10-5和10-6mol/L Losartan，30分钟后再加入10-7mol/L AngⅡ)及单纯Losartan组(10-4mol/L)。置培养箱内48小时，每孔加入1%MTT(二甲基噻唑二苯基溴化四唑，Fluka)20μl，再培养5小时后吸出培养液，PBS洗两次，每孔加入二甲亚砜200μl，振荡培养板使沉淀完全溶解，用DG-3022A型酶联免疫检测仪于570nm波长下检测各孔吸光度(OD值)。每个浓度取12孔的均值作为每个浓度的OD值。
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1.3 3H-TdR掺入[4] 实验分组同2。将细胞密度调为1×105个/ml，以每孔1ml加入24孔板中，按分组分别加入AngⅡ和Losartan，置37℃孵箱培养30小时。于收获细胞前6小时加入3H-TdR(上海原子能研究院，1mCi/ml)，使其终浓度为2μCi/ml。弃培养液，用冷PBS洗5次，0.25%胰蛋白酶消化收获细胞，离心洗涤细胞3次，弃洗液。以100μl蒸馏水溶解细胞沉淀，取20μl滴于微孔滤膜上，吹干后行液闪测定。每组取4孔细胞的均值。
1.4 VSMC计数 采用血球计数板法。将细胞密度调为2×104个/ml，以每孔1ml加入24孔板中，置37℃，5%CO2条件下培养4天后行细胞计数。分组：(1)2%FCS组；(2)2%FCS+10-6mol/L AngⅡ组；(3)2%FCS+10-4mol/L Losartan+10-6mol/l AngⅡ组；(4)2%FCS+10-4mol/L Losartan组；(5)20%FCS组；(6)20%FCS+10-4mol/L Losartan组。每组实验重复5次。
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1.5 统计学处理 数据以均数±标准差表示，组间显著性比较用方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 VSMC增生的MTT法检测结果酶标仪光密度测定显示，AngⅡ呈剂量依赖性地促进VSMC对MTT的摄取与代谢，以10-6mol/L AngⅡ的作用最显著，10-8mol/L AngⅡ的作用次之(P均<0.01)，而10-10mol/L AngⅡ促增生作用不明显(P>0.05)。Losartan预处理可明显地抑制VSMC对MTT的摄取与代谢，以10-5mol/L时的作用最强(P<0.01)，单纯Losartan干预对MTT的摄取与代谢无明显影响。
2.2 3H-TdR掺入结果 见表1。
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3 H-TdR掺入值(CPM)
掺入率
(%)
2%FCS
1883±162
100
2%FCS+10-6mol/L AngⅡ
4086±215*
223
, 百拇医药 2%FCS+10-8mol/L AngⅡ
2858±193*
152
2%FCS+10-10mol/L AngⅡ
1967±172
105
2%FCS+10-4mol/L Los
1816±158
-4
2%FCS+10-4mol/L Los+10-7mol/L AngⅡ
, 百拇医药
1912±181
102
2%FCS+10-5mol/L Los+10-7mol/L AngⅡ
2085±191
111
2%FCS+10-5mol/L Los+10-7mol/L AngⅡ
2252±185
120
*：与2%FCS组比较，P<0.01
2.3 VSMC计数结果 见表2。表2 VSMC对不同物质增殖的反应
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VSMC计数(1×104/ml)
P值
2%FCS
3.97±0.90
2%FCS+AngⅡ
4.24±0.92
>0.05
2%FCS+Los+AngⅡ
3.99±0.80
>0.05
2%FCS+Los
, 百拇医药 3.94±0.83
>0.05
2%FCS
9.43±1.18
<0.01
2%FCS+Los
9.42±1.19
<0.01
3 讨 论
AngⅡ是一种作用强大的促有丝分裂剂，既往研究表明AngⅡ可促进离体培养VSMC的增殖与肥大[5]。本研究显示，在低浓度血清条件下，AngⅡ呈剂量依赖性地增加VSMC内3H-TdR掺入和对MTT的摄取与代谢。AngⅡ促进VSMC增生的过程可能通过蛋白激酶C(PKC)与丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)来介导[6]，因为PKC与MAPK是细胞外信号向核内传递的共同通路与中心环节。MAPK的活化可激活一系列核蛋白，如核因子-kB和活化蛋白-1(AP-1)，从而进一步诱导其它与增生有关基因的表达，导致VSMC增殖与肥大[7]。在低浓度血清存在时，AngⅡ对VSMC的数量无明显影响，这与其他学者报道的AngⅡ仅刺激SHR平滑肌细胞增殖而对WKY平滑肌细胞增殖无明显影响的结果相似[8]，提示AngⅡ对于不同生长状态的细胞具有不同的作用，对于异常的VSMC，AngⅡ可同时促进其DNA与蛋白质合成，导致细胞分裂与肥大，而对于正常生长状态下的VSMC，AngⅡ虽可增加其细胞内DNA合成，但不足以促成细胞的有丝分裂。本研究及其他学者的研究也证实，高浓度血清本身具有显著促分裂效应，使VSMC数量增加1倍以上。
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Losartan特异性地与细胞膜上的AngⅡⅠ型受体结合，从而拮抗AngⅡ的生物学效应。有研究报道血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体拮抗剂UP269-3可抑制由AngⅡ诱导的培养正常血压与自发性高血压大鼠VSMC的增殖与肥大，体内试验则显著抑制气囊损伤后大鼠颈动脉内膜的增生反应[9]。本研究显示用Losartan预处理培养VSMC可显著地抑制AngⅡ所诱导的3H-TdR掺入和MTT摄取与代谢，但它对高浓度血清所致的VSMC增殖无明显抑制作用。这提示高浓度血清是通过非AngⅡ受体途径来介导VSMC的增生，有报道显示某些生长因子可能参与了VSMC的这一增殖过程[10]，这可能是高浓度FCS促进培养VSMC增生的机制之一，因为FCS中含有多种生长因子。总之，AngⅡ可促进体外培养VSMC内DNA合成，而Losartan可拮抗其促增生效应，可能在防治早期动脉粥样硬化过程中发挥一定作用。
参考文献
[1] Song KF,Shiota N,Takai S,et al.Atherosclerosis, 1998,138:171
, 百拇医药
[2] Champbell J,Champbell G,Ross R.Physical Rev, 1979,59:211
[3] 宋良文，崔雪梅，王德文.中华病理学杂志，1997,26：352
[4] 胡静，温进坤，魏素珍.等.中华物理医学杂志，1994,16:211
[5] Takeuchik K,Nakamura N,Cook NS,et al.Biochem Biophys Res Commun, 1990,72:1189
[6] Davis RJ.J Biol Chem 1993,268:14553
[7] 赵彦来，孙开来.中国循环杂志，1998，13：372
[8] Stiouffer GA,Owens GK.Circ Res 1992,70:820
[9] Ito, H,Mukoyama M,Prott RE,et al. J Clin Invest,1993,91:2268
[10] Virone Oddos A,Deangle V,Provost D,et al.Br J Pharmacol, 1997,120:488
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