大鼠全脑缺血再灌流后海马CA1区锥体细胞超微结构的改变*
作者：刘红梅 高天明 佟振清
单位：刘红梅 (第一军医大学南方医院超声诊断科，广州，510515)；高天明 佟振清 (第一军医大学生理学教研室，广州，510515)
关键词：脑缺血；海马；超微结构；凋亡
第一军医大学学报990401 摘要：目的 观察大鼠全脑缺血再灌流后，CA1区锥体细胞超微结构的变化。方法 通过四血管闭塞法全脑缺血模型，采用光、电镜观察了全脑缺血15 min再灌流后锥体细胞病理形态学改变及超微结构的变化。结果 全脑缺血再灌流48 h后CA1区发生了迟发性神经元死亡(DND)，锥体细胞超微结构出现了凋亡样改变，同时也观察到部分锥体细胞胞浆出现类似坏死的空泡化现象。结论 提示凋亡与坏死机制可能共同参与全脑缺血再灌流后DND。
中图分类号：R743
, http://www.100md.com
Ultrastructural changes of pyramidal cells in CA1 region of the hippocampus after reperfusion following forebrain ischemia in rats
Liu Hongmei
(Department of Ultrasound，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Gao Tianming,Tong Zhenqing
(Department of Physiology，First Military Medical University，Guangzhou，510515) Abstract：Objective To observe the ultrastructural changes of pyramidal cells of CA1 region in the hippocampus after reperfusion following forebrain ischemia.Methods With four-vessel occlusion model of rats，we investigated the pathologic and ultrastructural changes by light and electron microscopy after reperfusion following 15 min forebrain ischemia.Results By 48 h after reperfusion following forebrain ischemia，delayed neuronal death (DND) was induced in the CA1 region.The ultrastructure of these pyramidal cells showed apoptosis-like changes.The vacuolar phenomenon of necrosis in cytoplasm of some pyramidal cells was also observed.Conclusion Apoptosis and necrosis may be involved in DND after reperfusion following forebrain ischemia.
, 百拇医药
Key words：ischemia;hippocampus;ultrastructure;apoptosis
全脑缺血在临床上很常见，多发生于心肌梗塞、休克、窒息等造成的脑部血液低灌流，缺血范围广泛，海马等缺血损伤敏感区易发生迟发性神经元死亡(Delayed neuronal death，DND)。研究表明，海马与情绪、内脏活动、近期记忆的形成有关。因此，以鼠脑缺血再灌流模型模拟人类脑血管病进行研究，显得尤为重要。以往认为，神经兴奋毒性作用引起神经元细胞内Ca2+超载所致的DND是一种被动的坏死过程[1]。但近年来发现：脑缺血后DND之前，在海马可检测到大量DNA片段；一些细胞凋亡相关基因，如原癌基因bcl-2[2]、抑癌基因p53[3]均发现与脑缺血后神经元的死亡有关。我们通过大鼠全脑缺血模型，以在体神经元观察了脑缺血后锥体细胞超微结构的改变。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物模型的制备及分组 Wistar大鼠，体质量200～250 g，雌雄各半。参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作全脑缺血模型[4]。全脑缺血15 min后解除动脉夹，恢复脑血流。实验分为假手术对照组(sham)，全脑缺血15 min再灌流24、48、72、96 h组。光镜观察每组n=6，电镜观察每组n=2。
1.2 光学显微镜观察 大鼠经主动脉灌注固定后取脑，制作脑部冠状石蜡切片(4μm)，HE染色。光镜下观察CA1区组织病理学变化，并用显微测微尺测量CA1区锥体细胞密度。
1.3 透射电镜观察 大鼠经主动脉灌注固定后取脑，将海马区切成1 mm3大小的组织块，先后经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，丙酮逐级脱水，树脂包埋，LKB型切片机作超薄切片，切片厚度约80 nm，醋酸铀和柠檬酸铅双染色后，JEM1200-EX型透射电镜观察，摄片，加速电压为80kV。
, 百拇医药
1.4 统计方法 实验数据以平均数±标准差(
±s)表示，计量资料间比较确定方差齐性后，采用F检验，P<0.05为显著性界限。
2 结果
2.1 光学显微镜观察 低倍镜下可见海马呈“C”形，分为CA1、CA2、CA3区。假手术对照组CA1区有3至4层锥体细胞，排列整齐，高倍镜下可见锥体细胞核大而圆、透明、有1～2个明显的核仁(图1)。全脑缺血15 min再灌流后24 h，CA1区锥体细胞层结构基本正常，少数锥体细胞出现异常变化，细胞体积缩小，核不规则，呈三角形，深染。再灌流后48 h，CA1区失去正常结构，细胞排列散乱，锥体细胞大量变性，变性的锥体细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红。再灌流后72h(图2)或96 h，CA1区锥体细胞明显减少(表1)，损伤严重。
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图1 假手术组CA1区锥体细胞形态
Fig.1 The appearance of pyramidal cell in sham-operated group (HE×200)
图2 全脑缺血再灌流后72 h，大部分锥体细胞核固缩，胞浆嗜伊红
Fig.2 Pyramidal cells showing pyknotic and dark nucleis and eosinophilic cytoplasm 72 h after reperfusion following forebrain ischemia (HE×200)
表1 全脑缺血后不同时间CA1区锥体细胞密度
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Tab.1 Density of pyramidal cells in CA1 region post-fore-brain ischemia(the number of pyramidal cells/mm) Group
Density of pyramidal cells
Decrease degree vs sham group(%)
Sham
219.48± 6.82
24 h
207.61±15.95
5.41
48 h
, 百拇医药
176.95±11.93★☆
19.38
72 h
49.25± 7.95★☆⊙
77.56
96 h
26.57± 5.43★☆⊙◎
87.89
n=6 in each group; F test，★ P<0.01，compared with sham group；
☆P<0.01，compared with 24 h group；⊙ P<0.01，compared with 48 h；◎ P<0.01，compared with 72 h
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2.2 电镜观察 假手术组CA1区锥体细胞内质网、线粒体、高尔基体等细胞器丰富，核大而圆，直径约10 μm，染色质密度均一，核仁明显。全脑缺血再灌流24 h，锥体细胞变化不明显。48 h或72 h后，锥体细胞的超微结构有明显改变，胞浆浓缩，粗面内质网增生，在核周边呈平行层状排列，部分出现扩张和脱颗粒现象；游离核糖体密度增高，数量增加；扁平囊型高尔基体扩张呈泡状；溶酶体部分呈板层结构；核不规则固缩，染色质向核膜凝集成块状(图3)，有核仁裂解现象；核膜、细胞器膜、细胞膜均完整。小胶质细胞吞噬变性的髓鞘和邻近细胞形成凋亡小体(图4)。以上结果表明，全脑缺血后CA1区锥体细胞发生了凋亡。同时也观察到部分胞浆空泡化，线粒体肿胀，嵴断裂或消失。
图3 全脑缺血再灌流后72 h，CA1区锥体细胞核固缩，染色质凝集，核膜完整
Fig.3 The pyramidal cell showing karyopyknosis，chromatin aggrutination and intact membrane in CAI region 72 h after reperfusion following forebrain ischemia (EM×13000)
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图4 全脑缺血再灌流后72 h，CA1区小胶质细胞吞噬邻近细胞形成凋亡小体
Fig.4 Formation of apoptotic bodies were induced from microglia phagocytosing adjacent cells in CAI reagion 72 h after reperfusion following forebrain ischemia (EM×15000)
3 讨论
大鼠全脑缺血15 min再灌流后，CA1区锥体细胞发生DND，即缺血24 h后，CA1区才出现广泛、不可逆的锥体细胞变性死亡。这与以往学者观察到的脑缺血后CA1区神经元死亡具有一致性、迟发性的特点相符[5,6]。再灌流后48～72 h，其超微结构显示了凋亡改变：胞浆浓缩，核固缩，细胞膜、细胞器、核膜均完整。并见到小胶质细胞吞噬邻近细胞形成的凋亡小体和变性的髓鞘。另外，锥体细胞内粗面内质网呈层状增生，表明细胞内蛋白质合成功能亢进，需主动合成大量蛋白质以满足自身某种需要，可能与凋亡有关。结果显示在凋亡锥体细胞内出现板层状溶酶体，而在正常细胞极不易观察到。说明在凋亡细胞中存在着活跃的自噬活动，与凋亡细胞的自身清除功能有密切关系。
, 百拇医药
以往研究证明，全脑缺血后，锥体细胞膜上的谷氨酸受体通过神经兴奋毒性作用介导Ca2+大量内流，胞浆Ca2+浓度明显升高。我们推测是由于线粒体受损后影响其对Ca2+的摄取及调节，胞浆内Ca2+蓄积，引起水的内流或激活依赖Ca2+蛋白酶，使胞浆出现类似于坏死的空泡化现象。有资料表明，给予谷氨酸受体拮抗剂MK-801[7]或Ca2+拮抗剂尼莫地平[8]均对脑缺血后海马DND有保护作用。
以上提示，凋亡与坏死机制可能共同参与脑缺血后CA1区锥体细胞DND。但是凋亡与坏死之间关系如何，目前还不清楚，尚需进一步研究。
*国家自然科学基金(39570263)和广东省自然科学基金(950537)
作者简介：刘红梅,女,1971年出生;1998年毕业于第一军医大学:硕士,医师,助教;电话8514200
, 百拇医药
参考文献
1 Choi DW.Excitotoxic cell death.J Neurobiol,1992,23(9):1261
2 Chen J,Graham SH,Nakayama M et al.Apoptosis repressor genes bcl-2 and bcl-x-long are expressed in the rat brain following global ischemia.J Cereb Blood Flow Metab，1997,17(1):2
3 Didenko VV，Wang X,Yang L et al.Expression of p21 (WAF1/CIP1/ SDI1) and p53 in apoptotic cells in the adrenal cortex and induction by ischemia/ reperfusion injury.J Clin Invest ,1996,97(7):1723
, 百拇医药
4 Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke,1979,10(3):267
5 Pulsinelli WA.Selective neuronal vulnerability: morphological and molecular characteristics.Prog Brain Res,1992,581:168
6 Kirino T.Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia.Brain Res，1982,239:57
7 Park CK，Nehls DG，Graham DI et al.The glutamate antagonist MK-801 (dizocilipine) in hypoglycemic brain damage.J Cereb Blood Flow Metab，1990,10:270
8 尹翠芬,李麟仙,王子灿.沙土鼠短暂性脑缺血后海马迟发性神经元死亡机理的研究.中国病理生理杂志,1991,7(6):605
(收稿日期：1998-05-04), 百拇医药
单位：刘红梅 (第一军医大学南方医院超声诊断科，广州，510515)；高天明 佟振清 (第一军医大学生理学教研室，广州，510515)
关键词：脑缺血；海马；超微结构；凋亡
第一军医大学学报990401 摘要：目的 观察大鼠全脑缺血再灌流后，CA1区锥体细胞超微结构的变化。方法 通过四血管闭塞法全脑缺血模型，采用光、电镜观察了全脑缺血15 min再灌流后锥体细胞病理形态学改变及超微结构的变化。结果 全脑缺血再灌流48 h后CA1区发生了迟发性神经元死亡(DND)，锥体细胞超微结构出现了凋亡样改变，同时也观察到部分锥体细胞胞浆出现类似坏死的空泡化现象。结论 提示凋亡与坏死机制可能共同参与全脑缺血再灌流后DND。
中图分类号：R743
, http://www.100md.com
Ultrastructural changes of pyramidal cells in CA1 region of the hippocampus after reperfusion following forebrain ischemia in rats
Liu Hongmei
(Department of Ultrasound，First Military Medical University，Guangzhou，510515)
Gao Tianming,Tong Zhenqing
(Department of Physiology，First Military Medical University，Guangzhou，510515) Abstract：Objective To observe the ultrastructural changes of pyramidal cells of CA1 region in the hippocampus after reperfusion following forebrain ischemia.Methods With four-vessel occlusion model of rats，we investigated the pathologic and ultrastructural changes by light and electron microscopy after reperfusion following 15 min forebrain ischemia.Results By 48 h after reperfusion following forebrain ischemia，delayed neuronal death (DND) was induced in the CA1 region.The ultrastructure of these pyramidal cells showed apoptosis-like changes.The vacuolar phenomenon of necrosis in cytoplasm of some pyramidal cells was also observed.Conclusion Apoptosis and necrosis may be involved in DND after reperfusion following forebrain ischemia.
, 百拇医药
Key words：ischemia;hippocampus;ultrastructure;apoptosis
全脑缺血在临床上很常见，多发生于心肌梗塞、休克、窒息等造成的脑部血液低灌流，缺血范围广泛，海马等缺血损伤敏感区易发生迟发性神经元死亡(Delayed neuronal death，DND)。研究表明，海马与情绪、内脏活动、近期记忆的形成有关。因此，以鼠脑缺血再灌流模型模拟人类脑血管病进行研究，显得尤为重要。以往认为，神经兴奋毒性作用引起神经元细胞内Ca2+超载所致的DND是一种被动的坏死过程[1]。但近年来发现：脑缺血后DND之前，在海马可检测到大量DNA片段；一些细胞凋亡相关基因，如原癌基因bcl-2[2]、抑癌基因p53[3]均发现与脑缺血后神经元的死亡有关。我们通过大鼠全脑缺血模型，以在体神经元观察了脑缺血后锥体细胞超微结构的改变。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 实验动物模型的制备及分组 Wistar大鼠，体质量200～250 g，雌雄各半。参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作全脑缺血模型[4]。全脑缺血15 min后解除动脉夹，恢复脑血流。实验分为假手术对照组(sham)，全脑缺血15 min再灌流24、48、72、96 h组。光镜观察每组n=6，电镜观察每组n=2。
1.2 光学显微镜观察 大鼠经主动脉灌注固定后取脑，制作脑部冠状石蜡切片(4μm)，HE染色。光镜下观察CA1区组织病理学变化，并用显微测微尺测量CA1区锥体细胞密度。
1.3 透射电镜观察 大鼠经主动脉灌注固定后取脑，将海马区切成1 mm3大小的组织块，先后经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，丙酮逐级脱水，树脂包埋，LKB型切片机作超薄切片，切片厚度约80 nm，醋酸铀和柠檬酸铅双染色后，JEM1200-EX型透射电镜观察，摄片，加速电压为80kV。
, 百拇医药
1.4 统计方法 实验数据以平均数±标准差(
±s)表示，计量资料间比较确定方差齐性后，采用F检验，P<0.05为显著性界限。2 结果
2.1 光学显微镜观察 低倍镜下可见海马呈“C”形，分为CA1、CA2、CA3区。假手术对照组CA1区有3至4层锥体细胞，排列整齐，高倍镜下可见锥体细胞核大而圆、透明、有1～2个明显的核仁(图1)。全脑缺血15 min再灌流后24 h，CA1区锥体细胞层结构基本正常，少数锥体细胞出现异常变化，细胞体积缩小，核不规则，呈三角形，深染。再灌流后48 h，CA1区失去正常结构，细胞排列散乱，锥体细胞大量变性，变性的锥体细胞核固缩深染，胞浆嗜伊红。再灌流后72h(图2)或96 h，CA1区锥体细胞明显减少(表1)，损伤严重。
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图1 假手术组CA1区锥体细胞形态
Fig.1 The appearance of pyramidal cell in sham-operated group (HE×200)
图2 全脑缺血再灌流后72 h，大部分锥体细胞核固缩，胞浆嗜伊红
Fig.2 Pyramidal cells showing pyknotic and dark nucleis and eosinophilic cytoplasm 72 h after reperfusion following forebrain ischemia (HE×200)
表1 全脑缺血后不同时间CA1区锥体细胞密度
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Tab.1 Density of pyramidal cells in CA1 region post-fore-brain ischemia(the number of pyramidal cells/mm) Group
Density of pyramidal cells
Decrease degree vs sham group(%)
Sham
219.48± 6.82
24 h
207.61±15.95
5.41
48 h
, 百拇医药
176.95±11.93★☆
19.38
72 h
49.25± 7.95★☆⊙
77.56
96 h
26.57± 5.43★☆⊙◎
87.89
n=6 in each group; F test，★ P<0.01，compared with sham group；
☆P<0.01，compared with 24 h group；⊙ P<0.01，compared with 48 h；◎ P<0.01，compared with 72 h
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2.2 电镜观察 假手术组CA1区锥体细胞内质网、线粒体、高尔基体等细胞器丰富，核大而圆，直径约10 μm，染色质密度均一，核仁明显。全脑缺血再灌流24 h，锥体细胞变化不明显。48 h或72 h后，锥体细胞的超微结构有明显改变，胞浆浓缩，粗面内质网增生，在核周边呈平行层状排列，部分出现扩张和脱颗粒现象；游离核糖体密度增高，数量增加；扁平囊型高尔基体扩张呈泡状；溶酶体部分呈板层结构；核不规则固缩，染色质向核膜凝集成块状(图3)，有核仁裂解现象；核膜、细胞器膜、细胞膜均完整。小胶质细胞吞噬变性的髓鞘和邻近细胞形成凋亡小体(图4)。以上结果表明，全脑缺血后CA1区锥体细胞发生了凋亡。同时也观察到部分胞浆空泡化，线粒体肿胀，嵴断裂或消失。
图3 全脑缺血再灌流后72 h，CA1区锥体细胞核固缩，染色质凝集，核膜完整
Fig.3 The pyramidal cell showing karyopyknosis，chromatin aggrutination and intact membrane in CAI region 72 h after reperfusion following forebrain ischemia (EM×13000)
, http://www.100md.com
图4 全脑缺血再灌流后72 h，CA1区小胶质细胞吞噬邻近细胞形成凋亡小体
Fig.4 Formation of apoptotic bodies were induced from microglia phagocytosing adjacent cells in CAI reagion 72 h after reperfusion following forebrain ischemia (EM×15000)
3 讨论
大鼠全脑缺血15 min再灌流后，CA1区锥体细胞发生DND，即缺血24 h后，CA1区才出现广泛、不可逆的锥体细胞变性死亡。这与以往学者观察到的脑缺血后CA1区神经元死亡具有一致性、迟发性的特点相符[5,6]。再灌流后48～72 h，其超微结构显示了凋亡改变：胞浆浓缩，核固缩，细胞膜、细胞器、核膜均完整。并见到小胶质细胞吞噬邻近细胞形成的凋亡小体和变性的髓鞘。另外，锥体细胞内粗面内质网呈层状增生，表明细胞内蛋白质合成功能亢进，需主动合成大量蛋白质以满足自身某种需要，可能与凋亡有关。结果显示在凋亡锥体细胞内出现板层状溶酶体，而在正常细胞极不易观察到。说明在凋亡细胞中存在着活跃的自噬活动，与凋亡细胞的自身清除功能有密切关系。
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以往研究证明，全脑缺血后，锥体细胞膜上的谷氨酸受体通过神经兴奋毒性作用介导Ca2+大量内流，胞浆Ca2+浓度明显升高。我们推测是由于线粒体受损后影响其对Ca2+的摄取及调节，胞浆内Ca2+蓄积，引起水的内流或激活依赖Ca2+蛋白酶，使胞浆出现类似于坏死的空泡化现象。有资料表明，给予谷氨酸受体拮抗剂MK-801[7]或Ca2+拮抗剂尼莫地平[8]均对脑缺血后海马DND有保护作用。
以上提示，凋亡与坏死机制可能共同参与脑缺血后CA1区锥体细胞DND。但是凋亡与坏死之间关系如何，目前还不清楚，尚需进一步研究。
*国家自然科学基金(39570263)和广东省自然科学基金(950537)
作者简介：刘红梅,女,1971年出生;1998年毕业于第一军医大学:硕士,医师,助教;电话8514200
, 百拇医药
参考文献
1 Choi DW.Excitotoxic cell death.J Neurobiol,1992,23(9):1261
2 Chen J,Graham SH,Nakayama M et al.Apoptosis repressor genes bcl-2 and bcl-x-long are expressed in the rat brain following global ischemia.J Cereb Blood Flow Metab，1997,17(1):2
3 Didenko VV，Wang X,Yang L et al.Expression of p21 (WAF1/CIP1/ SDI1) and p53 in apoptotic cells in the adrenal cortex and induction by ischemia/ reperfusion injury.J Clin Invest ,1996,97(7):1723
, 百拇医药
4 Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke,1979,10(3):267
5 Pulsinelli WA.Selective neuronal vulnerability: morphological and molecular characteristics.Prog Brain Res,1992,581:168
6 Kirino T.Delayed neuronal death in the gerbil hippocampus following ischemia.Brain Res，1982,239:57
7 Park CK，Nehls DG，Graham DI et al.The glutamate antagonist MK-801 (dizocilipine) in hypoglycemic brain damage.J Cereb Blood Flow Metab，1990,10:270
8 尹翠芬,李麟仙,王子灿.沙土鼠短暂性脑缺血后海马迟发性神经元死亡机理的研究.中国病理生理杂志,1991,7(6):605
(收稿日期：1998-05-04), 百拇医药