原发性肝癌对化疗药物敏感性的研究
作者：丁国善 徐冠南 付志仁 李先兴
单位：丁国善 徐冠南 付志仁 上海长征医院普外科(200003)；李先兴 中国科学院细胞生物学研究所(200031)
关键词：肝癌；化疗；药敏
肝胆胰外科杂志990403 摘 要 目的 研究化疗药物对原发性肝癌细胞的敏感性。方法 应用MTT法及流式细胞仪，选择17种化疗药物对20例经手术切除的原发性肝癌标本进行化疗药物敏感性的检测。结果 对原发性肝癌细胞平均抑制率大于50%的化疗药物为异环磷酰胺、氟脲嘧啶、VM-26(威猛)、TAA(泰素)、环磷酰胺及DDP(顺铂)。结论 根据联合化疗的原则，对于原发性肝癌患者建议选用的化疗方案为：以氟脲嘧啶为主、配合顺铂等其他一种或二种敏感的化疗药物。
The sensitivity study of the primary hepatic carcinoma to chemotherapeutic drugs
, 百拇医药
Ding Guoshan,Xu Guannan,Fu Zhireng,et al.
The Department of General Surgery,Chang Zheng Hospital,Shanghai 200003
Abstract Objective To study the sensitivity of the primary hepatic carcinoma to chemotherapeutic drugs.Methods Analyzed by MTT methods and Cytofluorometry,the sensitivity dection of 17 kinds of chemotherapeutic drugs to hepatic tumor cell which derived form 20 cases of patient with liver cancer was performed.Results After the determination,there are 6 chemical drugs,i.e.iCy,5-Fu,VM-26,TAA,Cy and DDP with the suppressionrate higher than 50% to the hepatic tumor cells.Conclusion Based on the chemotherapeutic schemes which consist of 5-Fu combination with another kind of sensitive chemotherapeutic drug such as DDP is of choice.
, 百拇医药
Key word Hepatic carcinoma Chemotherapy Drug sensitivity
早期的原发性肝癌患者通过手术切除肿瘤，配合综合治疗，其疗效目前已大为改观，据上海医科大学肝癌研究所报告[1]，其治疗早期肝癌的5年生存率已达66.3%；但大部分肝癌患者初次就诊时病程已属晚期，或因肝炎后肝硬化，肝功能失代偿等原因，失去了切除肿瘤的机会，其治疗多采用放疗化疗中药扶正等综合治疗，效果不令人满意。传统认为常用的化疗药物对原发性肝癌不敏感。近年来，各种肝癌局部治疗新技术如肝动脉栓塞化疗、门静脉插管灌注化疗等的开展和应用，延长了大部分晚期肝癌患者的生存时间，部分甚至获得“不能切除肝癌缩小后切除”的机会，但目前各家医疗机构在对原发性肝癌行肝动脉或门静脉插管灌注化疗时选用的化疗方案不尽一致[2]。我们利用17种化疗药物对20例经手术切除的肝癌标本进行了化疗药物敏感性的研究，以期为临床合理地选择化疗方案提供科学的依据，从而使化疗个体化。现将有关的研究结果报告如下。
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1 材料和方法
1.1 材料 选择1997年至1998年本院收治手术切除的原发性肝癌患者20例，男18例，女2例，年龄32～64岁，平均43.5岁。肿瘤切除后即切取部分肿瘤标本置于4℃无菌生理盐水中，送中科院上海细胞生物学研究所行化疗药物敏感性检测。
1.2 方法 选用荧光标记的流式细胞仪检测法及MTT酶标测定法。在无菌条件下，用眼科剪刀将肿瘤组织块剪成0.5～1mm3碎块，置于三角烧瓶中，注入比细胞多30～50倍的含有0.20%胶原酶-Ⅱ(Sigma)的RPMI1640培养液(Gibico)，于37℃培养箱中，每隔10分钟混匀一次，消化6小时，消化完毕，倒入离心管中，1500r/min离心5分钟后吸除上清液，用1640溶液洗涤两次。沉淀物加一定量培养液，通过200目的尼龙网过滤，移去未被消化的碎块，得单细胞悬液，将等体积的相对密度为1.07和1.055 Ficoll-Hypaquez先后分别置于离心管中，然后将细胞悬液小心置于最上层，作不连续置密度梯度离心，经2000r/min离心20min后，取相对密度1.055层H-P液面上的细胞即为肿瘤细胞，并调整细胞浓度为(1～5)×105个细胞/ml，置于1640培养液中。
, 百拇医药
1.3 MTT检测法 肿瘤细胞接种于96孔板内，每孔100μl，实验包括对照组、实验组，每组设三个复孔。实验组内每孔加不同的化疗药物20μl(最终浓度为各抗肿瘤药物血峰浓度)、对照组内每孔加1640培养液20μl，置37℃，5% CO2培养箱内培养72小时，于培养结束前4小时每孔加MTT(四甲基偶氮唑盐3-(4,5-dimethy 1-2-thiazoly)2,5-dipheny1-2H-tetyazolium bromide) (5mg/ml)20μl，培养4小时后，每孔加酸化异丙醇100μl，用微量震荡器摇震5分钟，使甲结晶完全溶解，在自动酶标读数仪上比色，波长570nm，测出每孔吸光度值，实验同时设不加肿瘤细胞的空白组。结果以高度敏感(抑制率>70%)、中度敏感(抑制率50%～70%)、不敏感(抑制率<50%)。
抗肿瘤药物对肿瘤细胞抑制率=(1-
, 百拇医药
1.4 流式细胞仪药敏检测法 如果所制成的单细胞悬液中细胞浓度达到5×107以上，可进行流式细胞仪药敏检测，即在细胞悬液中加入PI(碘化丙锭Propidium Iodide,Sigma)进行染色，PI可进入细胞膜受损或死细胞内，与DNA特异结合，通过FACS流式细胞仪可检测出死活细胞数，得出细胞的杀伤率，从而计算出化疗药物敏感度。
2 结果
不同的原发性肝癌患者对化疗药物敏感性有明显的差异，体外研究的结果表明大部分原发性肝癌患者对异环磷酰胺、氟脲嘧啶、威猛、泰素、环磷酰胺及顺铂这六种化疗药物有较高的敏感性，见附表。
附表 17种化疗药物对原发性肝癌细胞的平均抑制率 化疗药物
平均抑制率(%)
氟脲嘧啶(5-Fu)
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55.07*
卡铂(CBD)
41.82
顺铂(DDP)
51.27*
丝裂霉素(MMC)
46.26
环磷酰胺(CTX)
51.26*
异环磷酰胺(IFO)
57.02*
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甲氨喋呤(MTX)
41.53
长春新碱(VCR)
39.23
威猛(VM26)
53.31*
平阳霉素(BLM)
47.90
阿糖胞苷(Ara-C)
47.07
泰素(TAL)
52.18*
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特素(PAC)
47.15
足叶乙甙(VP16)
25.45
甲环亚硝脲(MeCCNU)
46.74
阿霉素(ADM)
45.74
*临床以抑制率大于50%时为敏感
3 讨论
近代肿瘤化学治疗(化疗)学始于本世纪四十年代，近年来随着分子生物学、细胞增殖动力学、药物代谢动力学和分子药理学等学科的进展，抗肿瘤化疗药物的生化机理和作用原理已得到了进一步的阐明。目前已有部分恶性肿瘤可经化疗治愈，如急性淋巴细胞白血病、Hodgkin病、睾丸肿瘤等。作为大部分恶性肿瘤手术前后的辅助治疗及晚期肿瘤综合治疗的一部分，化疗为提高肿瘤的治疗效果、改善病人的生活质量及延长生存期等起到了肯定的作用。一般认为传统的全身化疗对原发性肝癌疗效甚微，迄今尚无获得预计大于20%以上有效的报道[3]，但近年来开展的经肝动脉或门静脉插管灌注化疗却收到了一定的疗效，部分不能切除的晚期肝癌患者，经肝动脉或门静脉插管灌注化疗后，获得了Ⅱ期手术切除并长期存活的效果[4]。但肝动脉或门静脉插管灌注化疗的方案目前各家医疗单位不尽统一。
, 百拇医药
建立可靠的抗肿瘤体外检测方法，可以帮助临床医师选择有效的化疗药物，合理的设计治疗方案，提高治疗效果，避免无效药物所致的副作用，从而使化疗个体化。我们主要采用的MTT法，是利用活细胞内线粒体脱氧酶能将MTT转化为蓝紫色衍生物甲(formazan)的原理来检测活细胞数目，产物甲瓒的颜色深浅与细胞数成正比。根据抗肿瘤药物作用后肿瘤细胞数变化，可计算出肿瘤细胞成活率，从而预测患者体内肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感程度；为了提高精度，在细胞量足够的情况下，采用流式细胞仪药敏检测法，具有单细胞计数、精确度高的特点。
根据我们的初步研究结果，常用的化疗药物中对原发性肝癌细胞抑制率较高的依次为：异环磷酰胺、氟脲嘧啶、威猛、泰素、环磷酰胺及顺铂。因此，原发性肝癌患者在选择化疗药物时宜首选上述药物。由于原发性肝癌患者绝大部分均有肝硬化，一般状况较差，故在选择化疗药物时需特别注意其对肝脏的毒性，环磷酰胺类虽对原发性肝癌细胞有较高的抑制率，但其有明显的肝毒性，故一般不适用于原发性肝癌患者化疗。目前临床上常用于消化道肿瘤化疗的丝裂霉素，其对原发性肝癌细胞的抑制率不高，且有明显的局部刺激及全身反应，亦应慎用。根据联合化疗的一般原则：①每一种药物单独应用时有效，②所用药物具有不同的药理作用和毒性，③二种药物或数种药物联合应用不致减效或相互拮抗，并力求协同或增效。我们认为对于原发性肝癌患者经肝动脉或门静脉插管灌注化疗的方案应以毒副反应较小而疗效较好的氟脲嘧啶为基础，配合顺铂、威猛及泰素中的一种或二种，当然，每个肝癌患者的病情及一般情况千差万别，化疗药物对每一位患者的作用及毒副反应也不尽一致，若能根据化疗药物对原发性肝癌细胞敏感性的检测结果，做到化疗个体化，相信对提高原发性肝癌患者的综合治疗效果将产生积极的作用。
参考文献
1 汤钊猷主编.现代肿瘤学.上海：上海医科大学出版社，1993.567～569
2 赵体平.肿瘤治疗的现状与前景.肿瘤，1990，10∶281
3 沈康平.中晚期原发性肝癌的治疗.中国普通外科杂志，1999，8(2)∶81
4 汤钊猷，余业勤，刘康达等.不能切除的肝癌综合治疗与二期切除—实验与临床研究.中华肿瘤杂志，1990，12∶2
(收稿：1999-10-18), 百拇医药
单位：丁国善 徐冠南 付志仁 上海长征医院普外科(200003)；李先兴 中国科学院细胞生物学研究所(200031)
关键词：肝癌；化疗；药敏
肝胆胰外科杂志990403 摘 要 目的 研究化疗药物对原发性肝癌细胞的敏感性。方法 应用MTT法及流式细胞仪，选择17种化疗药物对20例经手术切除的原发性肝癌标本进行化疗药物敏感性的检测。结果 对原发性肝癌细胞平均抑制率大于50%的化疗药物为异环磷酰胺、氟脲嘧啶、VM-26(威猛)、TAA(泰素)、环磷酰胺及DDP(顺铂)。结论 根据联合化疗的原则，对于原发性肝癌患者建议选用的化疗方案为：以氟脲嘧啶为主、配合顺铂等其他一种或二种敏感的化疗药物。
The sensitivity study of the primary hepatic carcinoma to chemotherapeutic drugs
, 百拇医药
Ding Guoshan,Xu Guannan,Fu Zhireng,et al.
The Department of General Surgery,Chang Zheng Hospital,Shanghai 200003
Abstract Objective To study the sensitivity of the primary hepatic carcinoma to chemotherapeutic drugs.Methods Analyzed by MTT methods and Cytofluorometry,the sensitivity dection of 17 kinds of chemotherapeutic drugs to hepatic tumor cell which derived form 20 cases of patient with liver cancer was performed.Results After the determination,there are 6 chemical drugs,i.e.iCy,5-Fu,VM-26,TAA,Cy and DDP with the suppressionrate higher than 50% to the hepatic tumor cells.Conclusion Based on the chemotherapeutic schemes which consist of 5-Fu combination with another kind of sensitive chemotherapeutic drug such as DDP is of choice.
, 百拇医药
Key word Hepatic carcinoma Chemotherapy Drug sensitivity
早期的原发性肝癌患者通过手术切除肿瘤，配合综合治疗，其疗效目前已大为改观，据上海医科大学肝癌研究所报告[1]，其治疗早期肝癌的5年生存率已达66.3%；但大部分肝癌患者初次就诊时病程已属晚期，或因肝炎后肝硬化，肝功能失代偿等原因，失去了切除肿瘤的机会，其治疗多采用放疗化疗中药扶正等综合治疗，效果不令人满意。传统认为常用的化疗药物对原发性肝癌不敏感。近年来，各种肝癌局部治疗新技术如肝动脉栓塞化疗、门静脉插管灌注化疗等的开展和应用，延长了大部分晚期肝癌患者的生存时间，部分甚至获得“不能切除肝癌缩小后切除”的机会，但目前各家医疗机构在对原发性肝癌行肝动脉或门静脉插管灌注化疗时选用的化疗方案不尽一致[2]。我们利用17种化疗药物对20例经手术切除的肝癌标本进行了化疗药物敏感性的研究，以期为临床合理地选择化疗方案提供科学的依据，从而使化疗个体化。现将有关的研究结果报告如下。
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1 材料和方法
1.1 材料 选择1997年至1998年本院收治手术切除的原发性肝癌患者20例，男18例，女2例，年龄32～64岁，平均43.5岁。肿瘤切除后即切取部分肿瘤标本置于4℃无菌生理盐水中，送中科院上海细胞生物学研究所行化疗药物敏感性检测。
1.2 方法 选用荧光标记的流式细胞仪检测法及MTT酶标测定法。在无菌条件下，用眼科剪刀将肿瘤组织块剪成0.5～1mm3碎块，置于三角烧瓶中，注入比细胞多30～50倍的含有0.20%胶原酶-Ⅱ(Sigma)的RPMI1640培养液(Gibico)，于37℃培养箱中，每隔10分钟混匀一次，消化6小时，消化完毕，倒入离心管中，1500r/min离心5分钟后吸除上清液，用1640溶液洗涤两次。沉淀物加一定量培养液，通过200目的尼龙网过滤，移去未被消化的碎块，得单细胞悬液，将等体积的相对密度为1.07和1.055 Ficoll-Hypaquez先后分别置于离心管中，然后将细胞悬液小心置于最上层，作不连续置密度梯度离心，经2000r/min离心20min后，取相对密度1.055层H-P液面上的细胞即为肿瘤细胞，并调整细胞浓度为(1～5)×105个细胞/ml，置于1640培养液中。
, 百拇医药
1.3 MTT检测法 肿瘤细胞接种于96孔板内，每孔100μl，实验包括对照组、实验组，每组设三个复孔。实验组内每孔加不同的化疗药物20μl(最终浓度为各抗肿瘤药物血峰浓度)、对照组内每孔加1640培养液20μl，置37℃，5% CO2培养箱内培养72小时，于培养结束前4小时每孔加MTT(四甲基偶氮唑盐3-(4,5-dimethy 1-2-thiazoly)2,5-dipheny1-2H-tetyazolium bromide) (5mg/ml)20μl，培养4小时后，每孔加酸化异丙醇100μl，用微量震荡器摇震5分钟，使甲结晶完全溶解，在自动酶标读数仪上比色，波长570nm，测出每孔吸光度值，实验同时设不加肿瘤细胞的空白组。结果以高度敏感(抑制率>70%)、中度敏感(抑制率50%～70%)、不敏感(抑制率<50%)。
抗肿瘤药物对肿瘤细胞抑制率=(1-
, 百拇医药
1.4 流式细胞仪药敏检测法 如果所制成的单细胞悬液中细胞浓度达到5×107以上，可进行流式细胞仪药敏检测，即在细胞悬液中加入PI(碘化丙锭Propidium Iodide,Sigma)进行染色，PI可进入细胞膜受损或死细胞内，与DNA特异结合，通过FACS流式细胞仪可检测出死活细胞数，得出细胞的杀伤率，从而计算出化疗药物敏感度。
2 结果
不同的原发性肝癌患者对化疗药物敏感性有明显的差异，体外研究的结果表明大部分原发性肝癌患者对异环磷酰胺、氟脲嘧啶、威猛、泰素、环磷酰胺及顺铂这六种化疗药物有较高的敏感性，见附表。
附表 17种化疗药物对原发性肝癌细胞的平均抑制率 化疗药物
平均抑制率(%)
氟脲嘧啶(5-Fu)
, http://www.100md.com
55.07*
卡铂(CBD)
41.82
顺铂(DDP)
51.27*
丝裂霉素(MMC)
46.26
环磷酰胺(CTX)
51.26*
异环磷酰胺(IFO)
57.02*
, http://www.100md.com
甲氨喋呤(MTX)
41.53
长春新碱(VCR)
39.23
威猛(VM26)
53.31*
平阳霉素(BLM)
47.90
阿糖胞苷(Ara-C)
47.07
泰素(TAL)
52.18*
, http://www.100md.com
特素(PAC)
47.15
足叶乙甙(VP16)
25.45
甲环亚硝脲(MeCCNU)
46.74
阿霉素(ADM)
45.74
*临床以抑制率大于50%时为敏感
3 讨论
近代肿瘤化学治疗(化疗)学始于本世纪四十年代，近年来随着分子生物学、细胞增殖动力学、药物代谢动力学和分子药理学等学科的进展，抗肿瘤化疗药物的生化机理和作用原理已得到了进一步的阐明。目前已有部分恶性肿瘤可经化疗治愈，如急性淋巴细胞白血病、Hodgkin病、睾丸肿瘤等。作为大部分恶性肿瘤手术前后的辅助治疗及晚期肿瘤综合治疗的一部分，化疗为提高肿瘤的治疗效果、改善病人的生活质量及延长生存期等起到了肯定的作用。一般认为传统的全身化疗对原发性肝癌疗效甚微，迄今尚无获得预计大于20%以上有效的报道[3]，但近年来开展的经肝动脉或门静脉插管灌注化疗却收到了一定的疗效，部分不能切除的晚期肝癌患者，经肝动脉或门静脉插管灌注化疗后，获得了Ⅱ期手术切除并长期存活的效果[4]。但肝动脉或门静脉插管灌注化疗的方案目前各家医疗单位不尽统一。
, 百拇医药
建立可靠的抗肿瘤体外检测方法，可以帮助临床医师选择有效的化疗药物，合理的设计治疗方案，提高治疗效果，避免无效药物所致的副作用，从而使化疗个体化。我们主要采用的MTT法，是利用活细胞内线粒体脱氧酶能将MTT转化为蓝紫色衍生物甲(formazan)的原理来检测活细胞数目，产物甲瓒的颜色深浅与细胞数成正比。根据抗肿瘤药物作用后肿瘤细胞数变化，可计算出肿瘤细胞成活率，从而预测患者体内肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感程度；为了提高精度，在细胞量足够的情况下，采用流式细胞仪药敏检测法，具有单细胞计数、精确度高的特点。
根据我们的初步研究结果，常用的化疗药物中对原发性肝癌细胞抑制率较高的依次为：异环磷酰胺、氟脲嘧啶、威猛、泰素、环磷酰胺及顺铂。因此，原发性肝癌患者在选择化疗药物时宜首选上述药物。由于原发性肝癌患者绝大部分均有肝硬化，一般状况较差，故在选择化疗药物时需特别注意其对肝脏的毒性，环磷酰胺类虽对原发性肝癌细胞有较高的抑制率，但其有明显的肝毒性，故一般不适用于原发性肝癌患者化疗。目前临床上常用于消化道肿瘤化疗的丝裂霉素，其对原发性肝癌细胞的抑制率不高，且有明显的局部刺激及全身反应，亦应慎用。根据联合化疗的一般原则：①每一种药物单独应用时有效，②所用药物具有不同的药理作用和毒性，③二种药物或数种药物联合应用不致减效或相互拮抗，并力求协同或增效。我们认为对于原发性肝癌患者经肝动脉或门静脉插管灌注化疗的方案应以毒副反应较小而疗效较好的氟脲嘧啶为基础，配合顺铂、威猛及泰素中的一种或二种，当然，每个肝癌患者的病情及一般情况千差万别，化疗药物对每一位患者的作用及毒副反应也不尽一致，若能根据化疗药物对原发性肝癌细胞敏感性的检测结果，做到化疗个体化，相信对提高原发性肝癌患者的综合治疗效果将产生积极的作用。
参考文献
1 汤钊猷主编.现代肿瘤学.上海：上海医科大学出版社，1993.567～569
2 赵体平.肿瘤治疗的现状与前景.肿瘤，1990，10∶281
3 沈康平.中晚期原发性肝癌的治疗.中国普通外科杂志，1999，8(2)∶81
4 汤钊猷，余业勤，刘康达等.不能切除的肝癌综合治疗与二期切除—实验与临床研究.中华肿瘤杂志，1990，12∶2
(收稿：1999-10-18), 百拇医药