蓝藻提取物对两类肝细胞的毒作用研究*
作者：张志勇 梁恒进 沈汉民 王俊南
单位：广西医科大学公共卫生学院 南宁 530021
关键词：蓝藻提取物；原代培养大鼠肝细胞；乳酸脱氢酶
广西医科大学学报990413
摘要 目的：了解蓝藻提取物对原代培养大鼠肝细胞和人类肝细胞系的毒作用，为有效防治这类毒素中毒及明确这两类细胞在体外试验中的价值提供依据。方法：用蓝藻提取物处理上述两类细胞后，观察它们的形态变化及测定乳酸脱氢酶渗出率。结果：在蓝藻提取物作用下，原代大鼠肝细胞形态发生一系列变化，且乳酸脱氢酶渗出率随提取物剂量和处理时间的增加而增加；人类肝细胞系上述两项指标都没有明显改变。结论：蓝藻提取物对两类肝细胞的毒作用有明显差别，这可能与两类细胞上胆酸转运系统的活力不同有关。研究蓝藻对人类肝脏的危害尚需寻找其他更敏感的体外实验对象。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R114
TOXIC EFFECT OF CYANOBACTERIA EXTRACT TO TWO KINDS OF HEPATOCYTES
Zhang Zhiyong,Liang Hengjin,Shen Hanming,et al
(College of Public Health,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:The research was made to understand the toxic effect of cyanobacteria extract (CE) to primary cultured rat hepatocytes (PCRH) and Chang liver cell (CLC) because the cyanobactenria pollution in water body has been a serious health problem around the world.Methods：After two kinds of cells were treated by CE,the morphological changes of cells were observed with microscopy and LDH leakage was detected.Results：Morphological changes were easily detected and LDH leakage increased in a dose-and time-dependent manner in PCRH.But neither morphological changes nor LDH leakage increase was observed in CLC.Conclusions：There was a significant difference between two kinds of cells about toxic effect of CE.More sensitive cells have to be found for research on damage of miorocystins to human liver.
, 百拇医药
Key words cyanobacteria extract;primary cultured rat hepatocytes;LDH
近年来，水体蓝藻污染越来越受到各国学者的重视。某些蓝藻产生的微囊藻毒素(Microcystins,MC)已在世界各地造成许多动物死亡及一些人类中毒事件发生[1]。肝脏是MC最重要的靶器官，已证实MC对离体动物肝细胞有明显的毒性[2]，但对人类肝细胞的影响尚未见报道。我们在广西境内采集蓝藻样品，用其提取物作用于原代培养大鼠肝细胞(Primary cultured rat hepatocytes,PCRH)和一种人类肝细胞系(Chang liver cell，CLC)，以了解它对这两类靶细胞的毒作用，为有效防治这类毒素中毒及明确PCRH及CLC在体外研究中的价值提供依据。
1 材料和方法
1.1 试剂：除小牛血清购自澳大利亚Cytosystens公司外，其它所有试剂均来自美国Sigma公司。
, http://www.100md.com
1.2 蓝藻样品采集及提取物制备：蓝藻样品采自广西境内的一些池塘，藻属以铜绿微囊藻为主(显微镜检)。样品经蒸馏水冲冼后冻干，参照Harada等[3]的方法制备提取物。蓝藻提取物(Cyanobacteria extract,CE)的最后浓度单位为mg/L。制备完毕后，溶液少量用HPLC测定其中MC的含量，其余备用。
1.3 PCRH培养：取200～250 g雄性Fisher大鼠，按Shen等[4]的方法灌注获取肝细胞，以细胞密度为0.5×106/ml William's培养液(含血清)接种到25 cm2培养瓶(Corning，美国)里培养。2 h后用PBS液冲冼，去除未贴壁的死细胞，换成加入不同剂量CE的培养液(不含血清)继续培养。
1.4 CLC培养：CLC由新加坡国立大学生物化学系赠送。先用基础培养液(含血清)把细胞接种到25 cm2培养瓶(Corning，美国)里。两天后，待细胞长到占满培养瓶约一半的空间时，换成加入不同剂量CE的培养液(不含血清)继续培养。
, 百拇医药
1.5 实验剂量和时间：对PCRH，所用CE剂量为10，50和100 mg/L；对CLC，CE剂量分别为100，500和1 000 mg/L。培养时间均为6，12和24 h。
1.6 显微镜观察：各组细胞培养到预定时间后，直接将培养瓶放到倒置显微镜下观察细胞形态的变化。
1.7 乳酸脱氢酶(LDH)渗出率的测定：按Shen等[4]的方法用Abbott VP生化分析仪测定。
1.8 统计分析：测定LDH渗出率剂量和时间反应关系的实验均做3个平行样品，数据用
±s表示，并进行显著性检验(t检验)。
2 结 果
2.1 CE作用后细胞的形态变化
, 百拇医药
2.1.1 PCRH的改变：倒置显微镜下，未经CE处理的PCRH(对照组细胞)形态呈菱形，个大，界限清晰，细胞核圆、清晰，且多位于中心，有些细胞有双核存在。但经100 mg/L CE处理6 h后，一些细胞收缩、变圆，失去正常细胞间的紧密连接。一些细胞脱离培养基质，凝结成团块状。细胞核亦变得模糊不清。随着CE浓度增加和处理时间延长，这种现象变得更加明显，用100 mg/L CE处理细胞24 h后，几乎所有细胞都脱离了培养基质，凝集成块状，一些细胞有明显的胞膜泡(Plasma membrane blebs)形成。
2.1.2 CLC的变化：倒置显微镜下，对照组细胞呈圆形或椭圆形，细胞之间连接紧密，界限清楚；细胞核圆、清晰，有的细胞有多核存在。用100，500和1 000mg/L CE处理 CLC 6～24 h，在高倍镜下细胞形态如同前述，未见改变。
2.2 LDH渗出率的变化
2.2.1 PCRH的LDH渗出率变化，见表1。
, 百拇医药
表1显示，培养24 h后，随着CE剂量增加，LDH渗出率也明显增加；用100 mg/L CE处理细胞，随着培养时间延长，LDH渗出率也随之增加。
2.2.2 CLC的LDH渗出率的变化，见表2。
表1 CE处理后PCRH的LDH渗出率的变化 剂 量
(ρB/mg.L-1)
LDH渗出率(%)
0 h
6 h
12 h
24 h
, 百拇医药
0
8.6±2.0
11.2±1.3
14.8±1.7
20.0±3.2
10
9.2±2.1
18.8±11.2
27.8±7.1*
44.5±12.4*
50
9.1±4.3
, 百拇医药
19.8±10.7
51.3±8.6*
80.3±6.7*
100
8.7±5.6
35.8±14.5*
74.7±17.2*
90.1±7.2*
*与0剂量比较，差异有显著意义(P<0.05)表2 CE处理后CLC的LDH渗出率的变化 剂 量
(ρB/mg.L-1)
, 百拇医药
LDH渗出率(%)
0 h
6 h
12 h
24 h
0
7.2±3.3
10.3±2.4
13.9±4.8
6.6±1.9
100
6.6±1.2
6.1±1.5
, 百拇医药
4.2±2.5
5.3±3.3
500
7.8±2.0
6.6±3.0
7.4±2.3
6.7±2.1
1000
12.4±1.9
8.8±1.2
9.6±2.4
9.6±4.2
, 百拇医药
表2显示，LDH渗出率在任一时间和剂量点上都没有显著变化。 近年来世界各地水体污染不断加重。水中大量无机物质污染加上适宜的气候条件又招致蓝藻水华(Waterbloom)形成。蓝藻属中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻等可产生MC，这是一类短多肽物质，目前已发现近50种。它们具有高度的肝特异毒性，其中MC-LR、MC-RR、MC-YR毒性最强，近还发现这几类MC是强烈的肝肿瘤促进剂[5]，可能和人类的肝癌发生有关。因而了解MC对其靶细胞的毒作用及寻找合适的体外实验对象非常必要。为此我们研究了CE对PCRH和CLC的作用，结果发现二者的反应差异巨大。
MC对PCRH的毒作用已有较多研究。一般来说，很低浓度的MC-LR(0.1 μmol/L)就可引起PCRH收缩、变圆、正常细胞之间的连接消失及出现许多大小不等的胞膜泡[2]，同时，LDH从细胞内大量释放出来[6]。我们用CE处理PCRH，发现细胞形态变化与上述情况相同，随着剂量增加和培养时间延长，形态改变更明显，LDH渗出率亦增加。LDH渗出率主要反映外来物质对细胞膜的损伤情况，是衡量某物质细胞毒作用的较好指标。本组实验结果表明，CE对PCRH的作用与MC-LR的作用极为相似。实际上，HPLC分析表明，实验所用的CE含较高浓度的MC-LR及少量MC-RR和MC-YR。
, 百拇医药
到目前为止，尚未有人报道过MC对CLC的作用。我们的研究发现，与PCRH对CE极度敏感相反，CLC对CE有很强耐受性，虽然所用的剂量比前者高10倍以上，但无论是显微镜下的大体形态还是LDH渗出率都没有显著性改变。CLC是人类肝细胞系，亦是MC的靶细胞，为什么有如此高的耐受性呢?这可能是因为CLC上缺乏胆酸转运系统(Bile acid carrier system)所致。MC能选择性地作用于肝细胞，是因为它必需通过肝细胞上这个系统的帮助才能进入细胞[7]。刚开始培养的PCRH系统活力较强，因而对MC非常敏感，随着培养时间的延长，系统的能力会逐渐下降，对MC的敏感性亦下降[8]。CLC已传种了几十代，胆酸转运系统的功能已趋于消失，因而对CE耐受性很高。据报道，与原代培养的肝细胞比较起来，其它种类的细胞如成纤维细胞、肾上皮细胞、Hep G2肝肿瘤细胞等，在浓度时间相同的情况下，吸收 MC的量只及前者的1/10弱[8]，与我们的结果基本相符。如果继续增加 CE的剂量，可能会观察到CLC的变化，但需将 CE进一步纯化后才能进行。
, 百拇医药
综上所述，CE对PCRH和CLC两类肝细胞的作用存在很大差别，这可能是因为两类细胞上胆酸转运系统活力不同所致。既然CLC对CE不敏感，要研究MC对人类肝脏的危害尚需寻找更适宜的体外实验对象，如原代培养人类肝细胞等。
参考文献
1 Falconer IR.Effects on human health of some toxic cyanobacteria (blue-green algae) in reservoir,lake and rivers.Toxicity Assess,1989,4:175～184
2 Hooser SB,Beasley VR,Basgall EJ,et al.Microystin-LR induced ultrastructual changes in rats.Vet.Pathol,1990,27:9～15
, http://www.100md.com
3 Harada KI,Suzuki M,Dahlem AM,et al.Improved method for purification of toxin peptides produced by cyanobateria.Toxicon,1998,26:433～439
4 Shen HM,Ong CN,Shi CY.Involvement of reactive oxygen species in aflatoxin B1-induced cell injury in cultured rat hepatocytes.Toxicology,1995,99:115～123
5 Nishiwaki MR,Ohta T,Nishiwaki S,et al.Liver tumor promotion by the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin-LR.J Cancer Res Clin Oncol,1992,118:420～424
, http://www.100md.com
6 Mereish KA,Solow R.Effect of antihepatotoxic against microcystin LR Toxicity in culturerd rat hepatocytes.Pharm Res,1990,7:256～259
7 Hermansky SJ,Markin RS,Fowler EH,et al.Hepatic ultrastructural changes induced by the toxin microcystin-LR(MCLR)in mice.J Environ Pathol Toxicol Oncol,1992,12:101～106
8 Khan SA,Ghosh S,Wickstrom M,et al.Comparative pathology of microcystin-LR in cultured hepatocytes,fibroblastes,and renal epithelial cells.Natural Toxins,1995,3:119～128
收稿日期：1998-12-25, 百拇医药
单位：广西医科大学公共卫生学院 南宁 530021
关键词：蓝藻提取物；原代培养大鼠肝细胞；乳酸脱氢酶
广西医科大学学报990413
摘要 目的：了解蓝藻提取物对原代培养大鼠肝细胞和人类肝细胞系的毒作用，为有效防治这类毒素中毒及明确这两类细胞在体外试验中的价值提供依据。方法：用蓝藻提取物处理上述两类细胞后，观察它们的形态变化及测定乳酸脱氢酶渗出率。结果：在蓝藻提取物作用下，原代大鼠肝细胞形态发生一系列变化，且乳酸脱氢酶渗出率随提取物剂量和处理时间的增加而增加；人类肝细胞系上述两项指标都没有明显改变。结论：蓝藻提取物对两类肝细胞的毒作用有明显差别，这可能与两类细胞上胆酸转运系统的活力不同有关。研究蓝藻对人类肝脏的危害尚需寻找其他更敏感的体外实验对象。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R114
TOXIC EFFECT OF CYANOBACTERIA EXTRACT TO TWO KINDS OF HEPATOCYTES
Zhang Zhiyong,Liang Hengjin,Shen Hanming,et al
(College of Public Health,Guangxi Medical University,Nanning 530021)
Abstract Objective:The research was made to understand the toxic effect of cyanobacteria extract (CE) to primary cultured rat hepatocytes (PCRH) and Chang liver cell (CLC) because the cyanobactenria pollution in water body has been a serious health problem around the world.Methods：After two kinds of cells were treated by CE,the morphological changes of cells were observed with microscopy and LDH leakage was detected.Results：Morphological changes were easily detected and LDH leakage increased in a dose-and time-dependent manner in PCRH.But neither morphological changes nor LDH leakage increase was observed in CLC.Conclusions：There was a significant difference between two kinds of cells about toxic effect of CE.More sensitive cells have to be found for research on damage of miorocystins to human liver.
, 百拇医药
Key words cyanobacteria extract;primary cultured rat hepatocytes;LDH
近年来，水体蓝藻污染越来越受到各国学者的重视。某些蓝藻产生的微囊藻毒素(Microcystins,MC)已在世界各地造成许多动物死亡及一些人类中毒事件发生[1]。肝脏是MC最重要的靶器官，已证实MC对离体动物肝细胞有明显的毒性[2]，但对人类肝细胞的影响尚未见报道。我们在广西境内采集蓝藻样品，用其提取物作用于原代培养大鼠肝细胞(Primary cultured rat hepatocytes,PCRH)和一种人类肝细胞系(Chang liver cell，CLC)，以了解它对这两类靶细胞的毒作用，为有效防治这类毒素中毒及明确PCRH及CLC在体外研究中的价值提供依据。
1 材料和方法
1.1 试剂：除小牛血清购自澳大利亚Cytosystens公司外，其它所有试剂均来自美国Sigma公司。
, http://www.100md.com
1.2 蓝藻样品采集及提取物制备：蓝藻样品采自广西境内的一些池塘，藻属以铜绿微囊藻为主(显微镜检)。样品经蒸馏水冲冼后冻干，参照Harada等[3]的方法制备提取物。蓝藻提取物(Cyanobacteria extract,CE)的最后浓度单位为mg/L。制备完毕后，溶液少量用HPLC测定其中MC的含量，其余备用。
1.3 PCRH培养：取200～250 g雄性Fisher大鼠，按Shen等[4]的方法灌注获取肝细胞，以细胞密度为0.5×106/ml William's培养液(含血清)接种到25 cm2培养瓶(Corning，美国)里培养。2 h后用PBS液冲冼，去除未贴壁的死细胞，换成加入不同剂量CE的培养液(不含血清)继续培养。
1.4 CLC培养：CLC由新加坡国立大学生物化学系赠送。先用基础培养液(含血清)把细胞接种到25 cm2培养瓶(Corning，美国)里。两天后，待细胞长到占满培养瓶约一半的空间时，换成加入不同剂量CE的培养液(不含血清)继续培养。
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1.5 实验剂量和时间：对PCRH，所用CE剂量为10，50和100 mg/L；对CLC，CE剂量分别为100，500和1 000 mg/L。培养时间均为6，12和24 h。
1.6 显微镜观察：各组细胞培养到预定时间后，直接将培养瓶放到倒置显微镜下观察细胞形态的变化。
1.7 乳酸脱氢酶(LDH)渗出率的测定：按Shen等[4]的方法用Abbott VP生化分析仪测定。
1.8 统计分析：测定LDH渗出率剂量和时间反应关系的实验均做3个平行样品，数据用
±s表示，并进行显著性检验(t检验)。2 结 果
2.1 CE作用后细胞的形态变化
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2.1.1 PCRH的改变：倒置显微镜下，未经CE处理的PCRH(对照组细胞)形态呈菱形，个大，界限清晰，细胞核圆、清晰，且多位于中心，有些细胞有双核存在。但经100 mg/L CE处理6 h后，一些细胞收缩、变圆，失去正常细胞间的紧密连接。一些细胞脱离培养基质，凝结成团块状。细胞核亦变得模糊不清。随着CE浓度增加和处理时间延长，这种现象变得更加明显，用100 mg/L CE处理细胞24 h后，几乎所有细胞都脱离了培养基质，凝集成块状，一些细胞有明显的胞膜泡(Plasma membrane blebs)形成。
2.1.2 CLC的变化：倒置显微镜下，对照组细胞呈圆形或椭圆形，细胞之间连接紧密，界限清楚；细胞核圆、清晰，有的细胞有多核存在。用100，500和1 000mg/L CE处理 CLC 6～24 h，在高倍镜下细胞形态如同前述，未见改变。
2.2 LDH渗出率的变化
2.2.1 PCRH的LDH渗出率变化，见表1。
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表1显示，培养24 h后，随着CE剂量增加，LDH渗出率也明显增加；用100 mg/L CE处理细胞，随着培养时间延长，LDH渗出率也随之增加。
2.2.2 CLC的LDH渗出率的变化，见表2。
表1 CE处理后PCRH的LDH渗出率的变化 剂 量
(ρB/mg.L-1)
LDH渗出率(%)
0 h
6 h
12 h
24 h
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0
8.6±2.0
11.2±1.3
14.8±1.7
20.0±3.2
10
9.2±2.1
18.8±11.2
27.8±7.1*
44.5±12.4*
50
9.1±4.3
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19.8±10.7
51.3±8.6*
80.3±6.7*
100
8.7±5.6
35.8±14.5*
74.7±17.2*
90.1±7.2*
*与0剂量比较，差异有显著意义(P<0.05)表2 CE处理后CLC的LDH渗出率的变化 剂 量
(ρB/mg.L-1)
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LDH渗出率(%)
0 h
6 h
12 h
24 h
0
7.2±3.3
10.3±2.4
13.9±4.8
6.6±1.9
100
6.6±1.2
6.1±1.5
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4.2±2.5
5.3±3.3
500
7.8±2.0
6.6±3.0
7.4±2.3
6.7±2.1
1000
12.4±1.9
8.8±1.2
9.6±2.4
9.6±4.2
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表2显示，LDH渗出率在任一时间和剂量点上都没有显著变化。 近年来世界各地水体污染不断加重。水中大量无机物质污染加上适宜的气候条件又招致蓝藻水华(Waterbloom)形成。蓝藻属中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻等可产生MC，这是一类短多肽物质，目前已发现近50种。它们具有高度的肝特异毒性，其中MC-LR、MC-RR、MC-YR毒性最强，近还发现这几类MC是强烈的肝肿瘤促进剂[5]，可能和人类的肝癌发生有关。因而了解MC对其靶细胞的毒作用及寻找合适的体外实验对象非常必要。为此我们研究了CE对PCRH和CLC的作用，结果发现二者的反应差异巨大。
MC对PCRH的毒作用已有较多研究。一般来说，很低浓度的MC-LR(0.1 μmol/L)就可引起PCRH收缩、变圆、正常细胞之间的连接消失及出现许多大小不等的胞膜泡[2]，同时，LDH从细胞内大量释放出来[6]。我们用CE处理PCRH，发现细胞形态变化与上述情况相同，随着剂量增加和培养时间延长，形态改变更明显，LDH渗出率亦增加。LDH渗出率主要反映外来物质对细胞膜的损伤情况，是衡量某物质细胞毒作用的较好指标。本组实验结果表明，CE对PCRH的作用与MC-LR的作用极为相似。实际上，HPLC分析表明，实验所用的CE含较高浓度的MC-LR及少量MC-RR和MC-YR。
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到目前为止，尚未有人报道过MC对CLC的作用。我们的研究发现，与PCRH对CE极度敏感相反，CLC对CE有很强耐受性，虽然所用的剂量比前者高10倍以上，但无论是显微镜下的大体形态还是LDH渗出率都没有显著性改变。CLC是人类肝细胞系，亦是MC的靶细胞，为什么有如此高的耐受性呢?这可能是因为CLC上缺乏胆酸转运系统(Bile acid carrier system)所致。MC能选择性地作用于肝细胞，是因为它必需通过肝细胞上这个系统的帮助才能进入细胞[7]。刚开始培养的PCRH系统活力较强，因而对MC非常敏感，随着培养时间的延长，系统的能力会逐渐下降，对MC的敏感性亦下降[8]。CLC已传种了几十代，胆酸转运系统的功能已趋于消失，因而对CE耐受性很高。据报道，与原代培养的肝细胞比较起来，其它种类的细胞如成纤维细胞、肾上皮细胞、Hep G2肝肿瘤细胞等，在浓度时间相同的情况下，吸收 MC的量只及前者的1/10弱[8]，与我们的结果基本相符。如果继续增加 CE的剂量，可能会观察到CLC的变化，但需将 CE进一步纯化后才能进行。
, 百拇医药
综上所述，CE对PCRH和CLC两类肝细胞的作用存在很大差别，这可能是因为两类细胞上胆酸转运系统活力不同所致。既然CLC对CE不敏感，要研究MC对人类肝脏的危害尚需寻找更适宜的体外实验对象，如原代培养人类肝细胞等。
参考文献
1 Falconer IR.Effects on human health of some toxic cyanobacteria (blue-green algae) in reservoir,lake and rivers.Toxicity Assess,1989,4:175～184
2 Hooser SB,Beasley VR,Basgall EJ,et al.Microystin-LR induced ultrastructual changes in rats.Vet.Pathol,1990,27:9～15
, http://www.100md.com
3 Harada KI,Suzuki M,Dahlem AM,et al.Improved method for purification of toxin peptides produced by cyanobateria.Toxicon,1998,26:433～439
4 Shen HM,Ong CN,Shi CY.Involvement of reactive oxygen species in aflatoxin B1-induced cell injury in cultured rat hepatocytes.Toxicology,1995,99:115～123
5 Nishiwaki MR,Ohta T,Nishiwaki S,et al.Liver tumor promotion by the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin-LR.J Cancer Res Clin Oncol,1992,118:420～424
, http://www.100md.com
6 Mereish KA,Solow R.Effect of antihepatotoxic against microcystin LR Toxicity in culturerd rat hepatocytes.Pharm Res,1990,7:256～259
7 Hermansky SJ,Markin RS,Fowler EH,et al.Hepatic ultrastructural changes induced by the toxin microcystin-LR(MCLR)in mice.J Environ Pathol Toxicol Oncol,1992,12:101～106
8 Khan SA,Ghosh S,Wickstrom M,et al.Comparative pathology of microcystin-LR in cultured hepatocytes,fibroblastes,and renal epithelial cells.Natural Toxins,1995,3:119～128
收稿日期：1998-12-25, 百拇医药