胰岛素样生长因子Ⅰ类受体反义核酸对脐血淋巴细胞功能的调节
作者：牛建英 杨毅 郭履赒 苏贻新
单位：200032 上海医科大学儿科医院
关键词：
中华医学杂志/990416 胰岛素样生长因子Ⅰ类受体(insulin-like growth factor I receptor,IGF-IR)是由位于细胞外的两条α链和跨膜的两条β链组成。它广泛分布于各种组织和细胞中，介导IGF-I促进细胞增殖和分化的作用。一些报道和我们以前的研究都已证实淋巴细胞能够表达IGF-IR，但对IGF-IR与淋巴细胞功能关系的研究甚少。为了阐明IGF-IR表达与细胞免疫的关系 以及对免疫发育的影响，我们利用反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotide,ASON) 阻 抑脐血淋巴细胞IGF-IR mRNA的表达，并对该细胞的增殖转化能力，产生细胞因子IL-2和 IFNr的 mRNA水平进行了观察和分析，从而探讨IGF-IR 表达对脐血淋巴细胞功能的调节作用。
, http://www.100md.com
一、对象和方法
1.细胞转染：取足月健康新生儿肝素抗凝脐静脉血，常规分离并培养单个核细胞，同时加 入质量浓度为10 mg/L的PHA(美国Sigma公司产品)，以及脂质体-寡核苷酸复合物，浓度 为5 μmol/L。脂质体-寡核苷酸复合物的制备参考文献[1]。实验以IGF-IR正义寡核苷 酸 (sense oligonucleotide,SON) 为对照组。ASON和SON(北京赛百盛生物工程公司合成)的序列分别为：5′-CCGGAGCCAGACTTC-3′；5′-AAGTTCTGGCTCCGGA-3′。为增强 寡核苷酸的稳定性，分别在5′端、3′端加以硫化修饰，于培养24小时、48小时、72小 时时收集细胞，抽提RNA。
2.淋巴细胞增殖转化试验：同位素掺入法，细胞共培养72小时。于培养结束前16小时 加入3H-TdR(中国上海原子核研究所提供)，结果以每分钟脉冲数(cpm,次/min)表示。
, 百拇医药
3.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：(1) RNA抽提：利用TRIzol RNA提取试剂(美国GI BCO公司产品)对静息和各实验组培养不同时间细胞进行总RNA的提取，方法根据产品推荐。(2) RT-PCR：方法参考文献[2]。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。所使用的引物见表1。(3) RT-PCR产物电泳胶是以凝胶成像分析系统(GDS8000，英国UVP公司产品)扫描，获灰度值。
表1 扩增产物所使用的引物序列 基因
引物序列
产物(bp)
IGF-IR
上游：CAACCACGAGGCTGAGAAGC
447
, 百拇医药
下游：CAGCATAATCACCAACCCTC
IL-2
上游：ACAGCTACAACTGGAGCATT
307
下游：TGCTGTCTCATCAGCATATT
IFNγ
上游：TGCAGGTCATTCAGATGTAG
306
下游：AGCCATCACTTGGATGAGTT
β-actin
上游：GAGGCCCAGAGCAAGAGAGG
, 百拇医药
386
下游：GGCCAGCCAGGTCCAGAC
注：以上全部实验过程至少重复3次，同时以β-肌动蛋白(β-actin)作为质量控制
4.统计学分析：采用配对t检验进行统计学处理。
二、结果
1.反义核酸对脐血淋巴细胞IGF-IR mRNA转录的阻抑作用：脐血淋巴细胞经IGF-IRASON阻抑后，IGF-IR mRNA的表达水平明显降低，其中以24小时降低最显著，与单用PHA刺激 相比降低了50%(t=4.3,P<0.05)。48小时、72小时分别降低了26%和35%。IGF-IR SON对脐血淋巴细胞IGF-IR mRNA的表达的影响无显著意义。
2.IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞增殖的抑制：在IGF-IR ASON作用下，脐血淋巴细胞的增殖 被显著抑制，其cpm值为4.7×104次/min，较单纯PHA刺激下降约50%(t=3.6,P< 0.05)。
, 百拇医药
3.IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IL-2 mRNA水平的影响：脐血淋巴细胞经PHA刺激后IL-2 mRNA的转录水平明显升高，24小时达静息时的4.89倍,而后随时间的延长增高幅度逐渐减小 。而在加入IGF-IR ASON与PHA共同作用时，脐血淋巴细胞IL-2 mRNA的表达水平与静息时 比较仍有所提高，但与不加IGF-IR ASON ，仅用PHA刺激的各时间点相比，IL-2 mRNA水平 均有明显下降，差异有显著意义(t24h=6.22,t48h=4.08,t 72h=4.41,P<0.05)。而正义寡核苷酸对照组IL-2 mRNA的表达水平，与单用PHA刺 激组比较降低无显著意义(图1)。
图1 IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IL-2 mRNA 转录水平的调节
4.IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IFNr mRNA水平的影响：PHA刺激24小时、48小时、72小时 时，脐血淋巴细胞IFNr mRNA的表达水平分别为静息水平的2.46倍、2.03倍和1.58倍。经IGF -IR ASON阻抑后，IFNr mRNA的表达水平分别降低至1.34倍、1.22倍和1.06倍，与单纯PHA 刺激比较，差异有显著意义(t24h=3.01,t48h=3.46,t72 h=2.96,P<0.05)。IGF-IR SON对脐血淋巴细胞IFNr mRNA表达水平的降低无显著意 义(图2)。
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图2 IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IFNγ mRNA 转录水平的调节
三、讨论
IGF-IR是IGF系统中非常重要的一个成员，许多研究已经证实其主要介导IGF-I的生物学作用[2，3]。本研究观察到，IGF-IR mRNA表达水平下降 后，脐血淋巴细胞的增殖能力也明显减弱。可能是因为IGF-Ⅰ具有促进蛋白质合成，而蛋 白质合成是细胞增殖过程所必需的。IGF-IR表达下降，接受IGF-Ⅰ的信号传递减少，使 IGF-Ⅰ不能很好地发挥促蛋白合成作用。提示IGF-IR mRNA的表达调节脐血淋巴细胞的增殖。有研究认为，在PHA刺激淋巴细胞活化的过程中加入IGF-I能够增强IL-2的产生[4]。我们在基因转录水平观察到的结果与之相似。IL-2具有促进淋巴细胞分化成熟以及 增殖的作用。IGF-IR mRNA表达下降后，脐血淋巴细胞产生IL-2的能力明显减弱。IL-2的减少又能够影响淋巴细胞的增殖分化。提示，淋巴细胞IGF-IR mRNA的转录水平参与其 活化产物细胞因子IL-2的表达。IFNr主要由活化的T淋巴细胞产生，本研究结果表明，IGF -IR mRNA表达被抑制后，脐血淋巴细胞IFNr mRNA的水平也明显下降，提示淋巴细胞IGF-IR mRNA的转录水平也影响IFNr的产生。
, 百拇医药
新生儿时期尽管淋巴细胞的数量与成人相似，但淋巴细胞在功能和发育程度上均较成人幼稚 ，存在生理性的免疫低下。本研究结果不仅证实脐血淋巴细胞表达IGF-IR mRNA，而且显示 其表达水平的高低影响细胞的增殖分化和细胞因子的产生，提示IGF-IR可能在维持新生儿 细胞免疫功能和促进免疫细胞发育成熟方面具有重要的调节作用。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39570279)
参考文献
[1] 王瓞，林其谁.阳离子脂质体介导基因转染的最优化条件.生 命的化学，1997，17：32-33.
[2] Nyman T,Pekonen F. The expression of insulin-like growth fact or and their binding protein in normal human lymphocytes. Acta Endocrinol,1993,128: 168-172.
, 百拇医药
[3] Kozak RW,Haskekll JF,Greestein LA,et al. Type Ⅰ and Ⅱ insu lin-like growth factor receports on human phytohemagglutinin-activated T lym phocytes. Cell Immunol,1987,109: 318-331.
[4] Kooijman R,Rijkers GT,Zeagers BJM. IGF-Ⅰ potentiates inter leukin-2 production in human peripheral T cells. J Endocrinol,1996,149: 351- 356.
(收稿：1998-07-31 修回：1999-01-04), http://www.100md.com
单位：200032 上海医科大学儿科医院
关键词：
中华医学杂志/990416 胰岛素样生长因子Ⅰ类受体(insulin-like growth factor I receptor,IGF-IR)是由位于细胞外的两条α链和跨膜的两条β链组成。它广泛分布于各种组织和细胞中，介导IGF-I促进细胞增殖和分化的作用。一些报道和我们以前的研究都已证实淋巴细胞能够表达IGF-IR，但对IGF-IR与淋巴细胞功能关系的研究甚少。为了阐明IGF-IR表达与细胞免疫的关系 以及对免疫发育的影响，我们利用反义寡核苷酸 (antisense oligonucleotide,ASON) 阻 抑脐血淋巴细胞IGF-IR mRNA的表达，并对该细胞的增殖转化能力，产生细胞因子IL-2和 IFNr的 mRNA水平进行了观察和分析，从而探讨IGF-IR 表达对脐血淋巴细胞功能的调节作用。
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一、对象和方法
1.细胞转染：取足月健康新生儿肝素抗凝脐静脉血，常规分离并培养单个核细胞，同时加 入质量浓度为10 mg/L的PHA(美国Sigma公司产品)，以及脂质体-寡核苷酸复合物，浓度 为5 μmol/L。脂质体-寡核苷酸复合物的制备参考文献[1]。实验以IGF-IR正义寡核苷 酸 (sense oligonucleotide,SON) 为对照组。ASON和SON(北京赛百盛生物工程公司合成)的序列分别为：5′-CCGGAGCCAGACTTC-3′；5′-AAGTTCTGGCTCCGGA-3′。为增强 寡核苷酸的稳定性，分别在5′端、3′端加以硫化修饰，于培养24小时、48小时、72小 时时收集细胞，抽提RNA。
2.淋巴细胞增殖转化试验：同位素掺入法，细胞共培养72小时。于培养结束前16小时 加入3H-TdR(中国上海原子核研究所提供)，结果以每分钟脉冲数(cpm,次/min)表示。
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3.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：(1) RNA抽提：利用TRIzol RNA提取试剂(美国GI BCO公司产品)对静息和各实验组培养不同时间细胞进行总RNA的提取，方法根据产品推荐。(2) RT-PCR：方法参考文献[2]。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。所使用的引物见表1。(3) RT-PCR产物电泳胶是以凝胶成像分析系统(GDS8000，英国UVP公司产品)扫描，获灰度值。
表1 扩增产物所使用的引物序列 基因
引物序列
产物(bp)
IGF-IR
上游：CAACCACGAGGCTGAGAAGC
447
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下游：CAGCATAATCACCAACCCTC
IL-2
上游：ACAGCTACAACTGGAGCATT
307
下游：TGCTGTCTCATCAGCATATT
IFNγ
上游：TGCAGGTCATTCAGATGTAG
306
下游：AGCCATCACTTGGATGAGTT
β-actin
上游：GAGGCCCAGAGCAAGAGAGG
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386
下游：GGCCAGCCAGGTCCAGAC
注：以上全部实验过程至少重复3次，同时以β-肌动蛋白(β-actin)作为质量控制
4.统计学分析：采用配对t检验进行统计学处理。
二、结果
1.反义核酸对脐血淋巴细胞IGF-IR mRNA转录的阻抑作用：脐血淋巴细胞经IGF-IRASON阻抑后，IGF-IR mRNA的表达水平明显降低，其中以24小时降低最显著，与单用PHA刺激 相比降低了50%(t=4.3,P<0.05)。48小时、72小时分别降低了26%和35%。IGF-IR SON对脐血淋巴细胞IGF-IR mRNA的表达的影响无显著意义。
2.IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞增殖的抑制：在IGF-IR ASON作用下，脐血淋巴细胞的增殖 被显著抑制，其cpm值为4.7×104次/min，较单纯PHA刺激下降约50%(t=3.6,P< 0.05)。
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3.IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IL-2 mRNA水平的影响：脐血淋巴细胞经PHA刺激后IL-2 mRNA的转录水平明显升高，24小时达静息时的4.89倍,而后随时间的延长增高幅度逐渐减小 。而在加入IGF-IR ASON与PHA共同作用时，脐血淋巴细胞IL-2 mRNA的表达水平与静息时 比较仍有所提高，但与不加IGF-IR ASON ，仅用PHA刺激的各时间点相比，IL-2 mRNA水平 均有明显下降，差异有显著意义(t24h=6.22,t48h=4.08,t 72h=4.41,P<0.05)。而正义寡核苷酸对照组IL-2 mRNA的表达水平，与单用PHA刺 激组比较降低无显著意义(图1)。
图1 IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IL-2 mRNA 转录水平的调节
4.IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IFNr mRNA水平的影响：PHA刺激24小时、48小时、72小时 时，脐血淋巴细胞IFNr mRNA的表达水平分别为静息水平的2.46倍、2.03倍和1.58倍。经IGF -IR ASON阻抑后，IFNr mRNA的表达水平分别降低至1.34倍、1.22倍和1.06倍，与单纯PHA 刺激比较，差异有显著意义(t24h=3.01,t48h=3.46,t72 h=2.96,P<0.05)。IGF-IR SON对脐血淋巴细胞IFNr mRNA表达水平的降低无显著意 义(图2)。
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图2 IGF-IR ASON对脐血淋巴细胞IFNγ mRNA 转录水平的调节
三、讨论
IGF-IR是IGF系统中非常重要的一个成员，许多研究已经证实其主要介导IGF-I的生物学作用[2，3]。本研究观察到，IGF-IR mRNA表达水平下降 后，脐血淋巴细胞的增殖能力也明显减弱。可能是因为IGF-Ⅰ具有促进蛋白质合成，而蛋 白质合成是细胞增殖过程所必需的。IGF-IR表达下降，接受IGF-Ⅰ的信号传递减少，使 IGF-Ⅰ不能很好地发挥促蛋白合成作用。提示IGF-IR mRNA的表达调节脐血淋巴细胞的增殖。有研究认为，在PHA刺激淋巴细胞活化的过程中加入IGF-I能够增强IL-2的产生[4]。我们在基因转录水平观察到的结果与之相似。IL-2具有促进淋巴细胞分化成熟以及 增殖的作用。IGF-IR mRNA表达下降后，脐血淋巴细胞产生IL-2的能力明显减弱。IL-2的减少又能够影响淋巴细胞的增殖分化。提示，淋巴细胞IGF-IR mRNA的转录水平参与其 活化产物细胞因子IL-2的表达。IFNr主要由活化的T淋巴细胞产生，本研究结果表明，IGF -IR mRNA表达被抑制后，脐血淋巴细胞IFNr mRNA的水平也明显下降，提示淋巴细胞IGF-IR mRNA的转录水平也影响IFNr的产生。
, 百拇医药
新生儿时期尽管淋巴细胞的数量与成人相似，但淋巴细胞在功能和发育程度上均较成人幼稚 ，存在生理性的免疫低下。本研究结果不仅证实脐血淋巴细胞表达IGF-IR mRNA，而且显示 其表达水平的高低影响细胞的增殖分化和细胞因子的产生，提示IGF-IR可能在维持新生儿 细胞免疫功能和促进免疫细胞发育成熟方面具有重要的调节作用。
本课题为国家自然科学基金资助项目(39570279)
参考文献
[1] 王瓞，林其谁.阳离子脂质体介导基因转染的最优化条件.生 命的化学，1997，17：32-33.
[2] Nyman T,Pekonen F. The expression of insulin-like growth fact or and their binding protein in normal human lymphocytes. Acta Endocrinol,1993,128: 168-172.
, 百拇医药
[3] Kozak RW,Haskekll JF,Greestein LA,et al. Type Ⅰ and Ⅱ insu lin-like growth factor receports on human phytohemagglutinin-activated T lym phocytes. Cell Immunol,1987,109: 318-331.
[4] Kooijman R,Rijkers GT,Zeagers BJM. IGF-Ⅰ potentiates inter leukin-2 production in human peripheral T cells. J Endocrinol,1996,149: 351- 356.
(收稿：1998-07-31 修回：1999-01-04), http://www.100md.com