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编号:10227628
造血细胞工程——一个新兴的研究与应用领域
http://www.100md.com 《上海医学》 1999年第4期
     作者:裴雪涛

    单位:100850 北京 军事医学科学院放射医学研究所,国家生物医学分析中心

    关键词:

    上海学报Shanghai Medical Journal1999年4月 第22卷 第4期 1999 近年来,造血细胞分选技术、造血生长因子的发现与克隆、各种ex vivo操作技术 的建立与完善,使得造血细胞在数量、性能和功能方面的改造更易于操作与应用,从而产生了一个 新 兴的研究与应用领域,即造血细胞工程。造血细胞工程是利用造血干/ 祖细胞的高度增殖能 力和多向分化潜能,通过细胞工程的技术,在体外模拟或部分模拟体内的造血过程(包括 基质细胞的支持和造血生长因子的调控等),对分离纯化的造血干/ 祖细胞进行体外扩增、 定向诱导分化、功能激活与调控、目的基因转染等,从而在短时间内大量扩增早期造血祖细 胞及各阶段的造血前体细胞,以及定向诱导扩增大量的红细胞、粒/ 巨噬细胞、巨核细胞/ 血小板、树突状细胞( Dendritic cells,DC)、NK细胞、T/ B淋巴细胞等功能血细 胞和免疫 活性细胞,并可对部分细胞的功能进行激活和调控,对缺陷性基因进行靶向性转染,最终将 造血细胞治疗更广泛和有效地应用于干细胞移植、生物免疫治疗、造血支持治疗和基因治疗 等领域。
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    一、造血调控的相关基础研究

    造血系统是体内高度活跃和高度新陈代谢的系统,造血干细胞具有自我更新能力和高度增殖 以及多向分化的潜能,血细胞的生成及其调控依赖于各种造血生长因子、造血基质细胞、细 胞外基质等多种因素的相互作用与平衡,并涉及细胞的增殖、分化、发育、成熟、迁移、定 居、衰老、凋亡、癌变等生命科学中的许多基本问题和研究热点。因此,造血细胞及其生成 的调控研究具有十分重要的理论意义,以此为模型的基础研究可以在细胞、蛋白质分子和基 因水平阐明生命活动中的许多调控机制。造血细胞工程在大量扩增造血祖细胞、定向诱导各 系功能血细胞分化、改造或激活造血细胞功能、靶向性转染目的基因的同时,也为造血调控 的相关基础研究提供了一个十分理想的模型,这己成为细胞生物学、细胞社会学、分子生物 学、遗传学、基因组学和生物信息学、血液学、肿瘤学、免疫学、放射医学、细胞和组织工 程学等领域的研究重点和热点。同时,造血细胞工程所涉及的是一个不均一的细胞群体,在 “空间”上存在粒/ 巨噬细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、T/ B淋巴细胞、NK/ NKT细胞 、树突状细胞等各系血细胞,在“时间”上存在不同分化发育阶段的细胞,如原始的造血干 细胞、幼稚的造血祖细胞、增生活跃的各系前体细胞、成熟的功能细胞和走向衰老、凋亡的 终末细胞,以及处在不同细胞周期的各类细胞。因此,这种“时空”间的差异及其多样性也 为人类基因组计划提供了发现新基因和己知基因新功能的理想模型。
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    二、造血干/ 祖细胞的主要生物学特性及其分离纯化

    造血干细胞除具有自我更新和多向分化的性能特征外,还具有以下特点: ①绝大多数干细 胞处于静止期( Go期);②高度表达 CD34和 CDw90抗原;③缺乏CD33、CD71等系相关抗原 ;④具有人类白细胞抗原 CD45RA高分子量形式;⑤低表达或不表达HLA-DR;⑥ Rhodami ne低吸收率(Rhodull)。其中 CD34抗原是造血干/ 祖细胞分离纯化的主要标志,其 主 要存在于幼稚的造血干/ 祖细胞、部分骨髓基质细胞和少量的内皮细胞表面。

    纯化造血干/ 祖细胞是造血细胞工程的限制性因素,但造血细胞是不均一的细胞群体,在 细胞大小、比重、形状、行为特征、表面标志、细胞周期以及调控机制等方面均存在较大的 差 异。因此,各种血细胞群体的复杂性、不均一性以及造血干/ 祖细胞的稀少使得其分离纯化 难以实现。进入90年代后,随着分子生物学、免疫学、细胞生物学、激光工业、纳米材料 和电子计算机等学科和技术的高速发展,使纯化造血干/ 祖细胞成为现实,也为造血干/ 祖 细胞的体外扩增、定向诱导分化、基因治疗、生物免疫治疗、建库和移植等奠定了基础。
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    造血干/ 祖细胞在增殖分化过程中表面抗原的变化是其分离纯化的标志,而高亲和力单克隆 抗体的制备和相关分离纯化技术的完善则是其基础。利用 CD34、CD38、HLA-DR、CD45RA、 c -kit、CDw90等细胞表面标志,通过不断发展和完善的免疫磁珠、生物素-抗生物素亲和吸 附、流式细胞术、单抗铺展贴壁等细胞分选技术,从而使 CD34+及其亚群细胞(如 CD34 +CD38-、CD34+CD38+、CD34+HLA-DR-、CD34+HLA-DR+、CD34+Thy-1+ Lin-、CD34+ HLA-DR-CD33-等)的分离纯化得以广泛开展。且更深入的研究 还发 展了新的造血干/ 祖细胞分选标志(如 AC133)以及发现了可能是更早期的、能够重建长期造 血和免疫功能的 CD34-造血干细胞( CD341o/-c-kit+Sca-1+Lin-)。
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    三、造血干细胞移植的新资源

    自80年代起,造血干细胞移植己成为癌症、造血系统疾病、自身免疫性疾病和部分遗传性疾 病的重要治疗手段。但在过去相当长的一段时期内,造血干细胞移植,尤其是异基因移植的 干细胞来源只有骨髓。近年来的研究和临床试验则表明化疗+细胞因子( G-CSF、GM-CSF 等)可使更多的干细胞进入外周血,从而可以采集到足够的造血干/ 祖细胞用于移植, 并使 其移植后的粒细胞和血小板恢复速度明显快于骨髓移植。目前,自体外周血干细胞移植的数 量己超过了自体骨髓移植,异基因外周血干细胞移植也己被广泛采用。因此,外周血干细胞 移植己成为造血干细胞移植的主要干细胞来源。目前的研究则更多地关注于 VLA-、LFA- l、LFA-3、VLA-5、c-kit、CD44、CD18等细胞粘附分子(CAM)所参与的干细胞动员机制, 以及 G-CSF、GM-CSF、SCF、FL、TPO、IL-8、EPO、IL-3、PIXY321、IL-6、IL-l、 MIP-1α等细胞因子及其组合的动员效率和动员细胞的表型、性能、长期造血重建能力等 ,此方面的研究将会使外周血干细胞移植的应用更加广泛、高效和快捷。
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    脐带血含有丰富的造血干/ 祖细胞,其免疫细胞的抗原性较弱,CTL祖细胞较少,移植相关 GvHD的发生相对骨髓和外周血少而轻,采集保存容易,对供者无任何伤害,因此被认为是极 具潜力的新的造血干细胞来源。1989年首例脐带血移植治疗Fanconi贫血获得成功后,更是 引起全球的关注,对脐带血造血干/ 祖细胞的生物学性能、免疫学特征、移植潜能等方面的 研究己成为热点,且在许多国家均建立了规模不等的脐带血库。纽约血液中心自1992年开始 启动其胎盘/ 脐带血计划,至今所保存的胎盘/ 脐带血己超过 8 000份,并为700余例 患者提供了脐带血干细胞用于移植,对其移植后随访超过100天的562例患者进行分析,表明脐带血移植可以顺利重建患者的长期造血,其植入时间与细胞剂量、患者年龄、疾病种类和HLA相合程度等均明显相关,移植患者中54%有2~3个位点不相合,但其发生的急性 GvHD较易控制,仅少数患者出现慢性GvHD。因此,大规模的脐带血库将成为新的、有效的干细胞来 源。

    造血干细胞移植的另一个新资源来自于CD34+细胞的分离纯化,依据上述CD34+细胞分 选的原理,获得 FDA批准的 CellPro亲和吸附分选系统和欧共体(EC)批准的 CliniMACS磁性 分选系统均己进入临床应用,纯化 CD34+细胞可净化移植物中污染的肿瘤细胞和异基因移植时的T淋巴细胞,从而降低移植后的复发率,控制移植相关的严重GvHD和移植物对肿瘤细 胞的免疫反应,因此被广泛应用于恶性肿瘤和自身免疫性疾病治疗时的异基因和自体干细胞 移植,同时,纯化的CD34+细胞还使应用相关供者的超剂量干细胞进行半相合移植成为可 能。此外,纯化的CD34+细胞也是造血细胞扩增和基因转染的前提条件。
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    四、造血干/ 祖细胞体外扩增与定向诱导分化

    利用造血干/ 祖细胞的高度增殖能力和多向分化潜能,以及各种造血生长因子和造血基质细 胞的调控作用,可使来自于骨髓、动员外周血和脐带血的CD34+细胞在 SCF、IL-l、IL-3、IL-6、GM-CSF、G-CSF、EPO和PIXY321等细胞因子的不同组合刺激下得以大量扩增 ,经8~14天即可扩增细胞总数30~1000余倍,造血祖细胞(包括CFU-GM、BFU-E、CFU-GE MM)也可被扩增41~190倍。但上述细胞因子在扩增造血细胞的同时,对 CD34+ CD38-早期造血祖细胞的扩增作用不明显,且明显地加速了早期造血祖细胞的分化,从而导致重建长期造血能力的耗竭。因此,如何在扩增造血细胞、加快短期造血恢复的同时,又保留造血 干细胞及扩增早期造血祖细胞,保证长期造血重建,这种“鱼”和“熊掌”兼得的理想境 地将成为造血细胞工程研究的重点和难点。近年来,Flt3/ Flk2配基(FL)、TPO等新的细胞因子被克隆,并证明其可以协同刺激早期造血祖细胞,且对细胞分化的压力相对较小,我们的研究结果表明,FL、TPO加上部分传统的细胞因子组合,可以大大提高造血细胞的扩增效率 ,短时间内可使造血细胞总数增加数千倍,且可使早期造血祖细胞扩增近50倍,这远远高于 传统细胞因子组合的扩增效果;利用 CD34+ CD38-细胞亚群进行扩增也可以明显增加早 期造血祖细胞的扩增而减缓其分化成熟,且其扩增细胞的再植能力也明显高于 CD34+ CD3 8+亚群扩增的细胞;基质细胞的支持也是扩增早期造血祖细胞的重要手段,有基质存在的 情况下,CD34+ CD38-细胞经 FL、SCF、IL-3等细胞因子的刺激,10~14天 LTC-IC即 可被扩增3~30倍,3周后可达50倍,而没有基质的扩增体系则难以维持 LTC-IC的自我更新 能力;而新一代的“生物反应器”则可持续灌注低浓度的细胞因子和不断更换培养基,从而 减轻细胞分化压力,清除细胞代谢产物,减少污染机会,增加扩增效率;此外,TGF-β、M IP-1α、TNF-α、LIF等负调控因子可阻止细胞分化,在适当的时机加入扩增体系,使扩 增细胞的分化速率减慢,从而保留更多的早期造血细胞数量和功能。
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    扩增造血祖细胞的同时,也明显地加速了其分化,这是造血祖细胞扩增所面临的一个难题, 但同时又为我们展开了一个新的研究领域,即利用造血干/ 祖细胞具有多向分化的潜能,通过 SCF、IL-3、GM-CSF、G-CSF、EPO、TPO、II-2、IL-4、IL-7等细胞因子的不同组合,以及骨髓、胸腺、淋巴结等造血微环境的作用,定向地诱导其分化,产生大量所需的功能细胞(如红细胞、粒细胞、血小板、树突状细胞、NK细胞和淋巴细胞等),满足基础研究及 临床应用的需要,这在新一代的细胞免疫治疗中将具有十分重要的意义。

    五、造血细胞相关的细胞治疗与基因治疗

    细胞治疗是生物免疫治疗和基因治疗的重要组成部分,血细胞由于具有运输氧、修复损伤内 皮、控制感染、参与机体免疫等多种复杂的功能,因此,又是细胞治疗的主要细胞来源。血细胞输注和造血干细胞移植己广泛应用于许多疾病的临床治疗,造血细胞治疗的领域也拓展到恶性血液疾病、遗传性疾病、重症免疫缺陷、AIDS、自身免疫性疾病以及肿瘤放化疗后的造血支持治疗等领域。以造血干/ 祖细胞体外扩增及定向诱导分化为代表的新一代细胞治疗也己从实验室走向临床应用,并进一步拓宽了其应用领域:外周血干细胞移植时减少动员次数和分离时间、自体造血干细胞移植时的肿瘤净化、脐带血干细胞移植、造血干细胞作为靶细胞的基因治疗、异基因骨髓和外周血干细胞移植、造血干细胞移植相关及肿瘤放化疗后的粒细胞和血小板减少、以及 NK、DC和淋巴细胞介导的生物免疫治疗等。
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    除造血细胞相关的造血支持治疗外,LAK、CIK、CTL、TIL以及 DC等细胞介导的免疫治 疗也逐渐成为恶性肿瘤等疾病的重要治疗策略。其中DC是体内最有效的抗原递呈细胞( APC ),通过其表面的 B7、MHC-Ⅱ、CD1、ICAM-1等信号分子和共刺激分子,并分泌大量 IL-1 2等细胞因子,激活 T辅助细胞,并传递特异性抗原信号,最终激活细胞毒T细胞(CTL)。因此,在肿瘤免疫及其治疗中具有重要意义。利用 GM-CSF、IL-4、TNF-α、FL、SCF、Ran k、Trance等细胞因子的不同组合,可以从CD34+造血祖细胞和外周血单核细胞诱导扩增出大量的 DC,进一步则通过肿瘤特异性多肽、酸提抗原或肿瘤差异 mRNA刺激、肿瘤抗原编码基因导入、细胞因子修饰、DC与肿瘤细胞融合、DC吞噬细胞凋亡小体等策略使 DC装载特异 性抗原,诱导抗原特异性 CTL杀伤肿瘤细胞,因此己成为当今肿瘤生物治疗领域倍受关注的 焦点。目前,DC回输疗法己成功地试用于非霍奇金淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌和多发性骨 髓瘤等恶性肿瘤晚期患者的治疗。此外,DC的来源与大量扩增、免疫学特性、作用机制等研 究也成为热点。DC在感染、移植排斥和自身免疫性疾病中的作用也有人涉及,在HIV的研究中,有人发现DC可能是病毒感染早期逃避机体免疫而进行复制的部位:而在移植前去除移 植物中的 DC或降低其抗原递呈能力均可使移植存活期延长。进一步的深入研究,将会使DC 介导的特异性免疫治疗在肿瘤、感染、移植免疫、自身免疫等疾病中得到更安全、有效的应用。
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    由于造血干细胞具有自我更新、多向分化、重建长期造血、采集和体外处理容易等特点,因 此是基因治疗最理想的靶细胞之一,以此为基础的基因治疗在重症免疫缺陷、遗传性疾病、 恶性肿瘤、造血干细胞保护、AIDS等领域具有广阔的应用前景。在美国 NIH公布的基因治疗方案中,以造血细胞作为靶细胞的基因治疗方案己达30余个,这些治疗方案正从实验室阶段逐渐向临床过渡。其中ADA转染CD34+细胞治疗重症联合免疫缺陷综合征( SCID) 、FACC导入治疗 Fanconi贫血、β-珠蛋白及其相关调控区基因的转染治疗 β-地中海贫血 和镰状细胞贫血、Ⅸ因子基因转入治疗血友病B等均获得了令人鼓舞的疗效;外源基因标记 在自体造血干细胞移植后复发原因和净化效果的分析中也己成为主要的证据,这在干细胞移植后的造血重建、细胞归巢( Homing)、肿瘤复发的克隆起源、各种净化肿瘤细胞方法的评 价等方面具有重要价值;mdr-l、dhfr、mgmt等耐药基因的转染则可使造血干/ 祖细胞能够耐受更高的化疗药物剂量,从而可以进一步提高化疗剂量和增加不同作用机制的药物组合, 使肿瘤化疗效果更加满意,同时又保护造血细胞免遭伤害;抑制HIV复制的基因转入T淋巴 细胞后表现出对HIV复制的明显抑制作用,若将其转染造血干/ 祖细胞,在体内分化为对HI V有抗性的巨噬细胞、T细胞等,从而获得治疗 AIDS的长期效果;此外,通过 HSV-TK自杀 基因的转染和 GCV的选择性杀伤作用,调控 T淋巴细胞的数量,也将为异基因造血干细胞移 植时控制 GvHD保留 GvL的治疗方案奠定基础。目前人们普遍关注的造血干/ 祖细胞及其亚 群的分离纯化、造血细胞基因转染效率的提高、基因转移载体(脂质体、逆转录病毒、腺病 毒、腺相关病毒等)的不断改进、转基因细胞的扩增和定向诱导分化、新的目的基因的发现 、目的基因转染后的稳定表达和调控等领域的深入研究将会使造血细胞相关的基因治疗更加 有效和广泛地应用于临床。

    作者简介:军事医学科学院放射医学研究所实验血液学研究室主任,研究员, 博士生导师。中国实验血液 学会常务理事、副秘书长,全军血液学专业委员会副主任委员,中国医药生物技术协会血 液 专业委员会副秘书长,《International Journal of Hematology》、《中华放射医学与防 护杂志》、《中国实验血液学杂志》编委。

    注释:国家杰出青年科学基金资助(39825111)

    收稿:1999-01-27), http://www.100md.com