镧示踪观察兔视网膜冲击伤后血视网膜屏障改变
作者：巢 阳 王正国 惠延年 杨志焕 袁 俭
单位：巢阳、袁俭 610083 成都，成都军区总医院眼科；王正国、杨志焕 重庆第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所；惠延年 西安第四军医大学附属西京医院眼科
关键词：
中华创伤杂志990418 视网膜的损伤与血视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)受损有直接关系[1，2]。笔者采用镧示踪观察视网膜冲击伤后BRB形态学变化,为临床提供理论依据。
一、材料与方法
1. 分组：健康杂色家兔24只，体重2.0～2.5 kg，雌雄兼用，随机分成6组，于伤后1小时、3小时、1天、3天、7天和14天各时相点分别活杀4只，制做光、电镜标本。5只未致伤眼为正常对照组。
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2.动物模型建立：动物麻醉后，采用BST-Ⅲ型生物激波管双夹膜压差破膜法正向致伤单侧兔眼一次，压力峰值(Pm)：(666±10.5) kPa，正压持续时间(Tm):(7.25±0.96) ms。
3.BRB硝酸镧示踪电镜观察：伤后不同时相点，两侧颈总动脉插管,同时注入硝酸镧原液20 ml，3分钟内摘除眼球，将眼后节置入质量浓度为30 g/L的戊二醛液中固定20分钟，在解剖显微镜下剥离脉络膜视网膜组织，切成1 mm×5 mm条块，在质量浓度为30 g/L的戊二醛液中继续固定2小时，用0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液漂洗三次，然后按常规电镜标本制备程序，做超薄切片，用JEN-100SX电子显微镜观察并照像。正常对照系指注入示踪剂的未致伤眼，电镜制备方法同上。
4.光镜观察：伤后不同时相点摘取眼球浸入眼球固定液中。1周后常规洗涤、脱水、透明、石蜡包埋、HE染色，光镜下观察并照像。同时利用各时间点电镜包埋块，切1μ厚片，经美蓝加碱性复红染色，光镜观察照像。
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二、结果
1.镧示踪BRB超微结构变化：正常时见硝酸镧呈颗粒状散在分布于脉络膜毛细血管腔内，并附着在管壁上，同时可见镧颗粒从脉络膜血管内皮细胞间隙漏出，渗入视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞基底部，并沿细胞间隙向细胞顶部移动，但终止于RPE细胞顶部的紧密连接(闭锁小带)。伤后1～3小时见镧颗粒通过少数开放的RPE细胞间紧密连接向视网膜内渗透。伤后1天RPE细胞间少数紧密接连破坏，镧沿细胞间隙向视网膜内渗透，到达外核层感光细胞间隙水平，同时内核层细胞间隙及内网状层胞突之间也可见镧示踪剂。伤后3天RPE细胞浆内可见吞噬的外节碎片，色素颗粒外溢，外核层细胞核间隙有镧颗粒。伤后7天部分RPE细胞变性，色素颗粒减少，视网膜内可见少量镧颗粒。伤后14天神经胶质细胞增生，视网膜内未见镧渗透。
2. 光镜观察：伤后1～3小时脉络膜血管扩张、充血，后极部神经纤维层水肿。伤后1天RPE层部分细胞破坏，视锥视杆细胞外节排列紊乱、破裂。伤后3天部分RPE细胞破坏、色素紊乱，外核层部分细胞变性。伤后7天RPE细胞局限性增生，视锥视杆层变薄，外核层细胞间隙轻度增宽，神经纤维层水肿减轻。伤后14天RPE层可见局部色素颗粒堆积，有神经胶质细胞增生，外核层细胞轻度减少。
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三、讨论
正常视网膜功能需要细胞外液及离子浓度的严格调控，后者又取决于视网膜毛细血管内皮(retinal capillary endothelium, RCE)和RPE的特殊结构与代谢功能，这就构成BRB的概念[3]。BRB由内外两部分组成[4]：内皮部分由RCE细胞及其连接构成，谓内屏障；上皮部分由RPE细胞及其连接构成，称外屏障。在正常情况下，RCE细胞具有单向主动运输功能；而RPE细胞除作为视网膜的选择性通透屏障外，还能主动运输各种离子、分子和液体，从而共同维护视网膜组织内环境稳定。
笔者观察到，正常情况下镧颗粒可经具有膜孔、细胞间连接疏松、基底膜不完整的脉络膜毛细血管内皮细胞间隙渗出，而RPE细胞膜与细胞间紧密连接致密，能阻止大分子物质通过，以致镧颗粒不能进入视网膜组织。
冲击伤后，由于冲击波的直接作用，造成视网膜水肿、出血、渗出等血管反应性改变及部分视网膜组织细胞损伤，少数变性、坏死。另一方面根据硝酸镧电镜示踪显示伤后1～3小时少数RPE细胞间隙的紧密连接开放，镧沿细胞间隙向视网膜渗透，表明BRB已出现轻度损害，伤后1～3天最为严重，且这种损害持续1周以上。由于BRB损害，其维持视网膜组织正常代谢的作用亦破坏，选择通透性发生障碍，许多原来不能透过屏障的物质得以透过，引起细胞外坏境紊乱，如未及时治疗，部分受损、处于可逆状态不稳定的细胞可进一步变性、坏死[5]，导致视网膜继发性损害。因此，笔者认为视网膜冲击伤的治疗越早越好，且持续10天以上。在伤后早期进行积极治疗，可改善视网膜血管通透性变化，维护BRB的基本功能，使视网膜细胞内外环境相对稳定，以防止视网膜继发性损害。
, 百拇医药
参考文献
1 Stao Y, Berkowrtz BA, Wilson CA, et al. Blood-retinal barrier breakdown caused by
diode vs argon laser endophotocoagulation. Arch Ophthalmol, 1992, 110∶277-281.
2 Hui YN, Wu YQ, Xiao QS, et al. Repair of outer blood-retinal barrier after severe ocular blunt trauma in rabbits. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol, 1993, 231∶365-369.
3 Sen HA, Campochiaro PA. Intravitreous injection of adenosine or its agonists causes breakdown of the blood-retinal barrier. Arch Ophthamol, 1989, 107∶1364-1367.
, 百拇医药
4 Vinores SA, Niel EV, Swerdloff JL, et al. Electron microscopic immunocytochemical evidence for the mechanism of blood-retinal barrier breakdown in galactosemic rats and its association with aldose recductase expression and inhibition. Exp Eye Res, 1993, 57∶732-735.
5 Hubschmann OR, Nathanson DC. The role of calcium and cellular membrane dysfunction in experimental trauma and subarachnoid hemorrhage. J Neurosurg, 1985, 62∶698-703.
收稿日期：1998-05-01
修稿日期：1999-04-11, 百拇医药
单位：巢阳、袁俭 610083 成都，成都军区总医院眼科；王正国、杨志焕 重庆第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所；惠延年 西安第四军医大学附属西京医院眼科
关键词：
中华创伤杂志990418 视网膜的损伤与血视网膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)受损有直接关系[1，2]。笔者采用镧示踪观察视网膜冲击伤后BRB形态学变化,为临床提供理论依据。
一、材料与方法
1. 分组：健康杂色家兔24只，体重2.0～2.5 kg，雌雄兼用，随机分成6组，于伤后1小时、3小时、1天、3天、7天和14天各时相点分别活杀4只，制做光、电镜标本。5只未致伤眼为正常对照组。
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2.动物模型建立：动物麻醉后，采用BST-Ⅲ型生物激波管双夹膜压差破膜法正向致伤单侧兔眼一次，压力峰值(Pm)：(666±10.5) kPa，正压持续时间(Tm):(7.25±0.96) ms。
3.BRB硝酸镧示踪电镜观察：伤后不同时相点，两侧颈总动脉插管,同时注入硝酸镧原液20 ml，3分钟内摘除眼球，将眼后节置入质量浓度为30 g/L的戊二醛液中固定20分钟，在解剖显微镜下剥离脉络膜视网膜组织，切成1 mm×5 mm条块，在质量浓度为30 g/L的戊二醛液中继续固定2小时，用0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液漂洗三次，然后按常规电镜标本制备程序，做超薄切片，用JEN-100SX电子显微镜观察并照像。正常对照系指注入示踪剂的未致伤眼，电镜制备方法同上。
4.光镜观察：伤后不同时相点摘取眼球浸入眼球固定液中。1周后常规洗涤、脱水、透明、石蜡包埋、HE染色，光镜下观察并照像。同时利用各时间点电镜包埋块，切1μ厚片，经美蓝加碱性复红染色，光镜观察照像。
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二、结果
1.镧示踪BRB超微结构变化：正常时见硝酸镧呈颗粒状散在分布于脉络膜毛细血管腔内，并附着在管壁上，同时可见镧颗粒从脉络膜血管内皮细胞间隙漏出，渗入视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞基底部，并沿细胞间隙向细胞顶部移动，但终止于RPE细胞顶部的紧密连接(闭锁小带)。伤后1～3小时见镧颗粒通过少数开放的RPE细胞间紧密连接向视网膜内渗透。伤后1天RPE细胞间少数紧密接连破坏，镧沿细胞间隙向视网膜内渗透，到达外核层感光细胞间隙水平，同时内核层细胞间隙及内网状层胞突之间也可见镧示踪剂。伤后3天RPE细胞浆内可见吞噬的外节碎片，色素颗粒外溢，外核层细胞核间隙有镧颗粒。伤后7天部分RPE细胞变性，色素颗粒减少，视网膜内可见少量镧颗粒。伤后14天神经胶质细胞增生，视网膜内未见镧渗透。
2. 光镜观察：伤后1～3小时脉络膜血管扩张、充血，后极部神经纤维层水肿。伤后1天RPE层部分细胞破坏，视锥视杆细胞外节排列紊乱、破裂。伤后3天部分RPE细胞破坏、色素紊乱，外核层部分细胞变性。伤后7天RPE细胞局限性增生，视锥视杆层变薄，外核层细胞间隙轻度增宽，神经纤维层水肿减轻。伤后14天RPE层可见局部色素颗粒堆积，有神经胶质细胞增生，外核层细胞轻度减少。
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三、讨论
正常视网膜功能需要细胞外液及离子浓度的严格调控，后者又取决于视网膜毛细血管内皮(retinal capillary endothelium, RCE)和RPE的特殊结构与代谢功能，这就构成BRB的概念[3]。BRB由内外两部分组成[4]：内皮部分由RCE细胞及其连接构成，谓内屏障；上皮部分由RPE细胞及其连接构成，称外屏障。在正常情况下，RCE细胞具有单向主动运输功能；而RPE细胞除作为视网膜的选择性通透屏障外，还能主动运输各种离子、分子和液体，从而共同维护视网膜组织内环境稳定。
笔者观察到，正常情况下镧颗粒可经具有膜孔、细胞间连接疏松、基底膜不完整的脉络膜毛细血管内皮细胞间隙渗出，而RPE细胞膜与细胞间紧密连接致密，能阻止大分子物质通过，以致镧颗粒不能进入视网膜组织。
冲击伤后，由于冲击波的直接作用，造成视网膜水肿、出血、渗出等血管反应性改变及部分视网膜组织细胞损伤，少数变性、坏死。另一方面根据硝酸镧电镜示踪显示伤后1～3小时少数RPE细胞间隙的紧密连接开放，镧沿细胞间隙向视网膜渗透，表明BRB已出现轻度损害，伤后1～3天最为严重，且这种损害持续1周以上。由于BRB损害，其维持视网膜组织正常代谢的作用亦破坏，选择通透性发生障碍，许多原来不能透过屏障的物质得以透过，引起细胞外坏境紊乱，如未及时治疗，部分受损、处于可逆状态不稳定的细胞可进一步变性、坏死[5]，导致视网膜继发性损害。因此，笔者认为视网膜冲击伤的治疗越早越好，且持续10天以上。在伤后早期进行积极治疗，可改善视网膜血管通透性变化，维护BRB的基本功能，使视网膜细胞内外环境相对稳定，以防止视网膜继发性损害。
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参考文献
1 Stao Y, Berkowrtz BA, Wilson CA, et al. Blood-retinal barrier breakdown caused by
diode vs argon laser endophotocoagulation. Arch Ophthalmol, 1992, 110∶277-281.
2 Hui YN, Wu YQ, Xiao QS, et al. Repair of outer blood-retinal barrier after severe ocular blunt trauma in rabbits. Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol, 1993, 231∶365-369.
3 Sen HA, Campochiaro PA. Intravitreous injection of adenosine or its agonists causes breakdown of the blood-retinal barrier. Arch Ophthamol, 1989, 107∶1364-1367.
, 百拇医药
4 Vinores SA, Niel EV, Swerdloff JL, et al. Electron microscopic immunocytochemical evidence for the mechanism of blood-retinal barrier breakdown in galactosemic rats and its association with aldose recductase expression and inhibition. Exp Eye Res, 1993, 57∶732-735.
5 Hubschmann OR, Nathanson DC. The role of calcium and cellular membrane dysfunction in experimental trauma and subarachnoid hemorrhage. J Neurosurg, 1985, 62∶698-703.
收稿日期：1998-05-01
修稿日期：1999-04-11, 百拇医药