烧伤焦痂毒性物质D1对大鼠肝线粒体H＋－ATP酶活性及能量偶联的影响
作者：楼淑芬 宋举峰 陈宗荣
单位：楼淑芬、陈宗荣 400038 重庆，第三军医大学预防医学系复合伤研究所；宋举峰 新疆马兰解放军第五四六医院
关键词：烧伤；亚线粒体颗粒；H+转运ATP合酶；荧光光度测定法
中华创伤杂志990413 【摘要】 目的 观察烧伤焦痂D1成分对肝线粒体H+-ATP酶活性及ATP生成的影响，以探讨D1对线粒体呼吸抑制的作用机制。方法 制备大鼠肝亚线粒体成分并从烧伤焦痂中提取D1成分，在含线粒体的反应体系中加入D1成分，测H+-ATP酶活性及ATP生成量，并检测ANS荧光强度以反映线粒体氧化磷酸化偶联状态。结果 亚线粒体颗粒ATP酶水解活力的正常值为(7.18±0.06)μmol.mg-1.min-1，与D1作用后，H+-ATP酶活力有明显下降，其下降程度和D1的剂量呈负相关，并且本实验直接观察到在新鲜制备SMP中D1成分，直接抑制了ATP的生成。ANS荧光强度下降，亦与D1剂量呈负相关。结论 H+-ATP酶活力下降可能是D1对线粒体呼吸抑制机制之一，H+-ATP酶活力下降导致ATP生成减少。荧光强度下降反映线粒体氧化磷酸化功能下降。
, 百拇医药
Effects of D1 Extracted From Burn Eschar on H+-ATPase Activity and Energy Coupling of Liver Mitochondria in the Rats
LOU Shufen, SONG Jufeng, CHEN Zongrong.
Dept. of Radiation Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Objective Burn eschar contains many toxic substances. The present study was aimed to study the effects of D1, a toxic component from burn eschar, on mitochndrial H+-ATPase activity and ATP production. Methods Submitochondria and D1 were freshly prepared from rat liver and burn eschar separately; D1 was added to the reaction medium containing submitochondria. The H+-ATPase activity, ATP content and ANS fluorescence intensity were measured. Results The control value of H-ATPase activity in submitochondria was (7.18±0.06) Piμmol/mg. H+-ATPase activity was reduced sharply after adding D1 into reaction medium and there existed a negative correlation between D1 concentration and H+-ATPase activity. Furthermore, it was directly observed in the present study that D1 could inhibit ATP production in submitochondria. Decrease in ANS fluorescence intensity was negatively correlated with D1 concentration. Conclusions Reduction of H+-ATPase activity may contribute to the inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation by D1, and to the decrease of ATP production. Decline in ANS fluorescence intensity reflects the suppression in mitochondrial oxidative phosphorylation.
, 百拇医药
【Key words】 Burns Submitochondrial particles H+-transporting ATP synthase Fluorophotometry
大面积烧伤产生的焦痂有时因客观上的种种原因，不能及时除去。焦痂中含有多种有毒性的物质，其中烧伤焦痂中提出的毒性物质D1能抑制鼠肝线粒体呼吸功能[1]，损害线粒体呼吸链的复合物Ⅲ节段[2]，增加线粒体膜的通透性，并使线粒体膜的跨膜电位电压下降[3]。笔者观察D1对H+转运ATP酶活性及能量偶联的影响。
材料与方法
1. 动物：Wistar成年大鼠，雌雄不拘，体重(200±20)g，由本校动物室提供。
, 百拇医药
2.试剂：三磷酸腺苷(ATP)，1-苯胺基-8-萘磺酸镁(ANS)为Sigma公司产品，其余试剂皆为国产分析纯。
3.仪器：Beckman J-21型高速低温离心机(美国)；日立55P-72型超速低温离心机(日本)；Beckman DU-7紫外/可见光分光光度计(美国)，日立MPF-4型荧光分光光度计(日本)及SHG-1型生物化学发光测量仪(上海)。
4.鼠肝亚线粒体的制备[4，5]：断头处死大鼠，取出肝脏，在2℃分离介质(0.25 mol/L蔗糖，pH7.4)内剪碎并洗数次以除去残留的血液。将洗净的肝组织加预冷的分离介质在玻璃匀浆器中研磨数次，500×g离心6分钟 。取上清液以10 000×g离心10分钟。以预冷的分离介质洗涤沉淀物，10 000×g离心10分钟。复以分离介质悬浮沉淀，在冰浴中超声处理(185W，每次10 s，共4次)。超声处理后，10 000×g离心10分钟。取上清液以105 000×g离心45分钟，以分离介质悬浮沉淀，定蛋白含量，悬浮液中所含的蛋白即为亚线粒体颗粒(SMP)。
, 百拇医药
5.D1的制备见参考文献[1]。
6.H+-ATP酶水解活力的测定[6]：在0.25 ml, 0.1 mol/L Tris (pH7.5)介质中加入SMP0.1 ml (1 mg/ml)，再分别加入D1100，75,50，25，12μl (1mg/ml)。30℃保温2 分钟，以0.25 ml ATP混合液(含0.004 mol/L MgCl2, 0.02 mol/L, ATP, 0.1 mol/L Tris, pH7.5)启动反应，在30℃水浴中保温10分钟，以20%三氯醋酸0.25 ml终止反应。1 000×g离心10分钟。取上清液0.25 ml加重蒸馏水1 ml，混匀，再加入1.5 ml显色剂(含10%抗坏血酸，2.5%钼酸铵，6 Eq/L硫酸及重蒸馏水，按1∶1∶1∶2临用时配制)，充分震荡混匀。45℃水浴10分钟，在DU-7分光光度计上710 nm处读吸光度值。查对磷(Pi)标准曲线，可得无机磷含量，酶活力单位以μmol.mg-1.min-1表示。
, 百拇医药
7.线粒体ATP含量测定：取新鲜制备的SMP，分别加入D1100，75，50，15，12 μl(1 mg/ml)，30℃保温5 分钟用荧光发光法测ATP含量。ATP荧光发光测定试剂盒(ATP biolumin cence, HS kit)购于Boehringer Mannhem公司(德国)，测定程序按试剂盒操作说明进行。
8.ANS荧光强度的测定：在2.8 ml 0.1 mol/L Tris (pH7.5)介质中加入0.1ml SMP(6 mg/ml)再分别加入D1 (l mg/ml) 100，75，50，25，12 μl。30℃保温5分钟，加入20μl ANS 1 mmol/L。 震荡混匀2分钟,加入50μl ATP-MgCl2混合液0.1 mol/L。在MPF-4型荧光分光光度计上测定荧光强度。激发波长375 nm，发射波长440 nm，狭缝5 nm。荧光相对强度为测得的荧光值减去MP，ANS及D1单独测定时各荧光强度之修正值。
, 百拇医药
9.统计处理：各组均值之间的差异用t检验，用直线回归法发析D1剂量与观察指标间的相关关系。
结 果
1. H+-ATP酶水解活力的变化：表1显示D1作用于亚线粒体颗粒后ATP水解酶的活力变化：正常亚线粒体颗粒ATP水解酶的活力(7.18±0.06)μmol.mg-1.min-1。加入D1后，ATP酶活力下降，其下降的程度与D1的剂量呈负相关(r=-0.9990)。
2. D1对SMP ATP生成的影响：新鲜制备SMP在加入不同剂量的D1后，用荧光发光法测得反应体系中的ATP的含量均下降，D1对ATP生成的抑制呈显著的量效反应关系(表1)。
, 百拇医药
表1 D1对亚线粒体颗粒ATP酶水解活力的影响(
±s) 组别
鼠数
ATP酶活性
(μmol.mg-1.min-1)
ATP含量
(μmol/mg)
对照组
10
, 百拇医药
7.18±0.06
2.76±0.13
D1组(μg/ml)
12.0
10
6.70±0.18**
2.61±0.12**
25.0
10
6.26±0.18**
2.46±0.09**
, 百拇医药
50.0
10
5.18±0.13**
1.96±0.24**
75.0
10
4.05±0.20**
1.78±0.17**
100.0
10
2.86±0.12**
, http://www.100md.com
1.62±0.15**
与对照组比较，**P<0.01
3. D1对ANS荧光强度的影响：表2显示D1作用于亚线粒体颗粒后对荧光强度的影响。正常亚线粒体颗粒的荧光强度为(28.52±0.11)荧光单位，加入D1后荧光单位下降，其下降的程度与D1的剂量呈负相关(r=-0.9821)。
表2 D1对亚线粒体颗粒荧光强度的影响(±s)
组别
, 百拇医药
鼠数
荧光强度
百分比(%)
对照组
10
28.52±0.11
100.00
D1组(μg/ml)
12.0
10
26.28±1.02**
92.17
, 百拇医药
25.0
10
24.61±1.06**
86.40
50.0
10
23.11±1.37**
81.13
75.0
10
21.29±1.14**
74.66
, 百拇医药
100.0
10
19.53±1.13**
68.49
与对照组比较，**P<0.01讨 论
生物化学反应一般都包含有能量的变化，这种变化可用来驱动诸如从ADP及Pi合成ATP，或者离子跨膜运转这一类的反应。能量转换是通过线粒体内膜来实现。
线粒体内膜上装配着两套不同的蛋白质，其中一套通常被称为ATP酶。H+-ATP酶其功能是在转运H+的同时催化ADP和Pi合成ATP，称为ATP合成酶。第二套蛋白质是能催化电子向最终受体O2传递的呼吸链。两套蛋白质中任何一套受了损伤都可导致线粒体能量转换受到抑制，氧化磷酸化作用发生脱偶联。有研究[1]证明D1可抑制线粒体呼吸，造成线粒体呼吸链的损害。同时，还发现D1造成线粒体膜通透性增加，跨膜电位电压下降。本实验的结果表明D1可使线粒体膜上的H+-ATP酶活力下降，D1的剂量越大，下降的幅度越大，两者之间呈高度负相关，而且在新鲜制备的SMP中加入D1后，直接用荧光发光法测定ATP含量的变化，结果提示D1抑制SMP的ATP生成，呈量效反应关系。由于H+-ATP酶与ATP合成有密切关系，故H+-ATP酶活力下降，导致ATP合成减少，出现氧化磷酸化作用的脱偶联。本研究直接进一步证明了D1对线粒体的毒性作用。
, http://www.100md.com
已经证明D1可抑制线粒体呼吸，随着D1的作用可发生脱偶联，本实验还从另一个方面进一步证明了这一点。ANS是一种带负电子的小分子荧光探针，ANS荧光强度的改变能灵敏地反映线粒体氧化磷酸化的变化。实验表明，D1可使ANS的荧光强度减弱。D1的剂量越大，ANS的荧光强度越小，两者间呈高度负相关。
从以上的结果看，D1通过损害线粒体呼吸链，增大线粒体膜通透性，以及抑制膜上的H+-ATP酶活性和线粒体ATP的生成，造成线粒体的呼吸抑制，其毒性作用是多方面的。
*本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39170743)
参考文献
1 Chen ZR, Xiong Y. Inhibition of mitochondrial respiratory function by an organic solvent extractable component isolated from an extract of burn eschar. Burns, 1991, 17∶282-287.
, 百拇医药
2 Chen ZR, Lou SF. Sites of inhibition of mitochondrial electron transport by D1, an organic solvent extractable component from burn eschar. Burns, 1994, 20∶311-315.
3 楼淑芬，陈宗荣.焦痂毒性提取物对线粒体膜电位的作用.第三军医大学学报, 1996,18∶99-101.
4 Aprille JR, Hom JR, Ruffs J. Liver and skeletal muscle mitochondrial function following burn injury. J Trauma, 1977,17∶279-283.
5 Cadenus E, Boveris A, Chance B. Low level chemiluminescence of bovine heart submitochondrial particles. Biochem J, 1980, 186∶659-667.
6 Reinlila M, MacDonala E, Salem N, et al. Standardized method for the determination of human erythrocyte membrane adenosine trihosphatases. Anal Biochem, 1982, 124∶19-26.
收稿日期:1998-04-02
修稿日期:1999-02-16, 百拇医药
单位：楼淑芬、陈宗荣 400038 重庆，第三军医大学预防医学系复合伤研究所；宋举峰 新疆马兰解放军第五四六医院
关键词：烧伤；亚线粒体颗粒；H+转运ATP合酶；荧光光度测定法
中华创伤杂志990413 【摘要】 目的 观察烧伤焦痂D1成分对肝线粒体H+-ATP酶活性及ATP生成的影响，以探讨D1对线粒体呼吸抑制的作用机制。方法 制备大鼠肝亚线粒体成分并从烧伤焦痂中提取D1成分，在含线粒体的反应体系中加入D1成分，测H+-ATP酶活性及ATP生成量，并检测ANS荧光强度以反映线粒体氧化磷酸化偶联状态。结果 亚线粒体颗粒ATP酶水解活力的正常值为(7.18±0.06)μmol.mg-1.min-1，与D1作用后，H+-ATP酶活力有明显下降，其下降程度和D1的剂量呈负相关，并且本实验直接观察到在新鲜制备SMP中D1成分，直接抑制了ATP的生成。ANS荧光强度下降，亦与D1剂量呈负相关。结论 H+-ATP酶活力下降可能是D1对线粒体呼吸抑制机制之一，H+-ATP酶活力下降导致ATP生成减少。荧光强度下降反映线粒体氧化磷酸化功能下降。
, 百拇医药
Effects of D1 Extracted From Burn Eschar on H+-ATPase Activity and Energy Coupling of Liver Mitochondria in the Rats
LOU Shufen, SONG Jufeng, CHEN Zongrong.
Dept. of Radiation Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038
【Abstract】 Objective Burn eschar contains many toxic substances. The present study was aimed to study the effects of D1, a toxic component from burn eschar, on mitochndrial H+-ATPase activity and ATP production. Methods Submitochondria and D1 were freshly prepared from rat liver and burn eschar separately; D1 was added to the reaction medium containing submitochondria. The H+-ATPase activity, ATP content and ANS fluorescence intensity were measured. Results The control value of H-ATPase activity in submitochondria was (7.18±0.06) Piμmol/mg. H+-ATPase activity was reduced sharply after adding D1 into reaction medium and there existed a negative correlation between D1 concentration and H+-ATPase activity. Furthermore, it was directly observed in the present study that D1 could inhibit ATP production in submitochondria. Decrease in ANS fluorescence intensity was negatively correlated with D1 concentration. Conclusions Reduction of H+-ATPase activity may contribute to the inhibition of mitochondrial oxidative phosphorylation by D1, and to the decrease of ATP production. Decline in ANS fluorescence intensity reflects the suppression in mitochondrial oxidative phosphorylation.
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【Key words】 Burns Submitochondrial particles H+-transporting ATP synthase Fluorophotometry
大面积烧伤产生的焦痂有时因客观上的种种原因，不能及时除去。焦痂中含有多种有毒性的物质，其中烧伤焦痂中提出的毒性物质D1能抑制鼠肝线粒体呼吸功能[1]，损害线粒体呼吸链的复合物Ⅲ节段[2]，增加线粒体膜的通透性，并使线粒体膜的跨膜电位电压下降[3]。笔者观察D1对H+转运ATP酶活性及能量偶联的影响。
材料与方法
1. 动物：Wistar成年大鼠，雌雄不拘，体重(200±20)g，由本校动物室提供。
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2.试剂：三磷酸腺苷(ATP)，1-苯胺基-8-萘磺酸镁(ANS)为Sigma公司产品，其余试剂皆为国产分析纯。
3.仪器：Beckman J-21型高速低温离心机(美国)；日立55P-72型超速低温离心机(日本)；Beckman DU-7紫外/可见光分光光度计(美国)，日立MPF-4型荧光分光光度计(日本)及SHG-1型生物化学发光测量仪(上海)。
4.鼠肝亚线粒体的制备[4，5]：断头处死大鼠，取出肝脏，在2℃分离介质(0.25 mol/L蔗糖，pH7.4)内剪碎并洗数次以除去残留的血液。将洗净的肝组织加预冷的分离介质在玻璃匀浆器中研磨数次，500×g离心6分钟 。取上清液以10 000×g离心10分钟。以预冷的分离介质洗涤沉淀物，10 000×g离心10分钟。复以分离介质悬浮沉淀，在冰浴中超声处理(185W，每次10 s，共4次)。超声处理后，10 000×g离心10分钟。取上清液以105 000×g离心45分钟，以分离介质悬浮沉淀，定蛋白含量，悬浮液中所含的蛋白即为亚线粒体颗粒(SMP)。
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5.D1的制备见参考文献[1]。
6.H+-ATP酶水解活力的测定[6]：在0.25 ml, 0.1 mol/L Tris (pH7.5)介质中加入SMP0.1 ml (1 mg/ml)，再分别加入D1100，75,50，25，12μl (1mg/ml)。30℃保温2 分钟，以0.25 ml ATP混合液(含0.004 mol/L MgCl2, 0.02 mol/L, ATP, 0.1 mol/L Tris, pH7.5)启动反应，在30℃水浴中保温10分钟，以20%三氯醋酸0.25 ml终止反应。1 000×g离心10分钟。取上清液0.25 ml加重蒸馏水1 ml，混匀，再加入1.5 ml显色剂(含10%抗坏血酸，2.5%钼酸铵，6 Eq/L硫酸及重蒸馏水，按1∶1∶1∶2临用时配制)，充分震荡混匀。45℃水浴10分钟，在DU-7分光光度计上710 nm处读吸光度值。查对磷(Pi)标准曲线，可得无机磷含量，酶活力单位以μmol.mg-1.min-1表示。
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7.线粒体ATP含量测定：取新鲜制备的SMP，分别加入D1100，75，50，15，12 μl(1 mg/ml)，30℃保温5 分钟用荧光发光法测ATP含量。ATP荧光发光测定试剂盒(ATP biolumin cence, HS kit)购于Boehringer Mannhem公司(德国)，测定程序按试剂盒操作说明进行。
8.ANS荧光强度的测定：在2.8 ml 0.1 mol/L Tris (pH7.5)介质中加入0.1ml SMP(6 mg/ml)再分别加入D1 (l mg/ml) 100，75，50，25，12 μl。30℃保温5分钟，加入20μl ANS 1 mmol/L。 震荡混匀2分钟,加入50μl ATP-MgCl2混合液0.1 mol/L。在MPF-4型荧光分光光度计上测定荧光强度。激发波长375 nm，发射波长440 nm，狭缝5 nm。荧光相对强度为测得的荧光值减去MP，ANS及D1单独测定时各荧光强度之修正值。
, 百拇医药
9.统计处理：各组均值之间的差异用t检验，用直线回归法发析D1剂量与观察指标间的相关关系。
结 果
1. H+-ATP酶水解活力的变化：表1显示D1作用于亚线粒体颗粒后ATP水解酶的活力变化：正常亚线粒体颗粒ATP水解酶的活力(7.18±0.06)μmol.mg-1.min-1。加入D1后，ATP酶活力下降，其下降的程度与D1的剂量呈负相关(r=-0.9990)。
2. D1对SMP ATP生成的影响：新鲜制备SMP在加入不同剂量的D1后，用荧光发光法测得反应体系中的ATP的含量均下降，D1对ATP生成的抑制呈显著的量效反应关系(表1)。
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表1 D1对亚线粒体颗粒ATP酶水解活力的影响(
±s) 组别鼠数
ATP酶活性
(μmol.mg-1.min-1)
ATP含量
(μmol/mg)
对照组
10
, 百拇医药
7.18±0.06
2.76±0.13
D1组(μg/ml)
12.0
10
6.70±0.18**
2.61±0.12**
25.0
10
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2.46±0.09**
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1.96±0.24**
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1.78±0.17**
100.0
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1.62±0.15**
与对照组比较，**P<0.01
3. D1对ANS荧光强度的影响：表2显示D1作用于亚线粒体颗粒后对荧光强度的影响。正常亚线粒体颗粒的荧光强度为(28.52±0.11)荧光单位，加入D1后荧光单位下降，其下降的程度与D1的剂量呈负相关(r=-0.9821)。
表2 D1对亚线粒体颗粒荧光强度的影响(
±s)组别
, 百拇医药
鼠数
荧光强度
百分比(%)
对照组
10
28.52±0.11
100.00
D1组(μg/ml)
12.0
10
26.28±1.02**
92.17
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25.0
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24.61±1.06**
86.40
50.0
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23.11±1.37**
81.13
75.0
10
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19.53±1.13**
68.49
与对照组比较，**P<0.01讨 论
生物化学反应一般都包含有能量的变化，这种变化可用来驱动诸如从ADP及Pi合成ATP，或者离子跨膜运转这一类的反应。能量转换是通过线粒体内膜来实现。
线粒体内膜上装配着两套不同的蛋白质，其中一套通常被称为ATP酶。H+-ATP酶其功能是在转运H+的同时催化ADP和Pi合成ATP，称为ATP合成酶。第二套蛋白质是能催化电子向最终受体O2传递的呼吸链。两套蛋白质中任何一套受了损伤都可导致线粒体能量转换受到抑制，氧化磷酸化作用发生脱偶联。有研究[1]证明D1可抑制线粒体呼吸，造成线粒体呼吸链的损害。同时，还发现D1造成线粒体膜通透性增加，跨膜电位电压下降。本实验的结果表明D1可使线粒体膜上的H+-ATP酶活力下降，D1的剂量越大，下降的幅度越大，两者之间呈高度负相关，而且在新鲜制备的SMP中加入D1后，直接用荧光发光法测定ATP含量的变化，结果提示D1抑制SMP的ATP生成，呈量效反应关系。由于H+-ATP酶与ATP合成有密切关系，故H+-ATP酶活力下降，导致ATP合成减少，出现氧化磷酸化作用的脱偶联。本研究直接进一步证明了D1对线粒体的毒性作用。
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已经证明D1可抑制线粒体呼吸，随着D1的作用可发生脱偶联，本实验还从另一个方面进一步证明了这一点。ANS是一种带负电子的小分子荧光探针，ANS荧光强度的改变能灵敏地反映线粒体氧化磷酸化的变化。实验表明，D1可使ANS的荧光强度减弱。D1的剂量越大，ANS的荧光强度越小，两者间呈高度负相关。
从以上的结果看，D1通过损害线粒体呼吸链，增大线粒体膜通透性，以及抑制膜上的H+-ATP酶活性和线粒体ATP的生成，造成线粒体的呼吸抑制，其毒性作用是多方面的。
*本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39170743)
参考文献
1 Chen ZR, Xiong Y. Inhibition of mitochondrial respiratory function by an organic solvent extractable component isolated from an extract of burn eschar. Burns, 1991, 17∶282-287.
, 百拇医药
2 Chen ZR, Lou SF. Sites of inhibition of mitochondrial electron transport by D1, an organic solvent extractable component from burn eschar. Burns, 1994, 20∶311-315.
3 楼淑芬，陈宗荣.焦痂毒性提取物对线粒体膜电位的作用.第三军医大学学报, 1996,18∶99-101.
4 Aprille JR, Hom JR, Ruffs J. Liver and skeletal muscle mitochondrial function following burn injury. J Trauma, 1977,17∶279-283.
5 Cadenus E, Boveris A, Chance B. Low level chemiluminescence of bovine heart submitochondrial particles. Biochem J, 1980, 186∶659-667.
6 Reinlila M, MacDonala E, Salem N, et al. Standardized method for the determination of human erythrocyte membrane adenosine trihosphatases. Anal Biochem, 1982, 124∶19-26.
收稿日期:1998-04-02
修稿日期:1999-02-16, 百拇医药