胃癌组织中RB基因17、21外显子突变的分析
作者：阮绪芝 严世荣 骆传祖 易建华 黄永章 熊秀敏
单位：
阮绪芝 骆传祖 易建华 湖北郧阳医学院生物教研室(十堰，442000)；严世荣 黄永章 熊秀敏 湖北郧阳医学院生化教研室；易建华 湖北郧阳医学院附属太和医院病理科
关键词：胃肿瘤；RB基因；聚合酶链反应-单链构象多态性
癌症990437
中图分类号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)04-0468-02
胃癌发生的分子机理尚不十分清楚，大量的研究表明，RB基因与肿瘤发生、生长调节密切相关。已在骨肉瘤、膀胱癌、食管癌[1]等中发现有RB基因的缺失、突变，而关于胃癌中RB基因突变的研究报道较少。我们采用PCR-SSCP方法，对胃癌组织中RB基因部分特殊区域进行了突变分析，以探讨胃癌发生与RB基因之间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本收集
胃癌及癌旁正常组织均来自郧阳医学院附属太和医院病理科确诊的胃癌患者，病理分级采用1988年公布的新的TNM分期法，术后迅速取材，-20℃冻存。
1.2 DNA提取
常规酚、氯仿抽提法抽提。
1.3 PCR扩增
引物根据文献[2]报道设计，由上海生化所合成。
50μlPCR反应体系，含DNA样品0.2～0.5μg，50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCI,pH8.3，0.01%明胶，0.4mmol/LdNTP,1mmol/LMgCl2,上下游引物各50pmol，反应混合物经97℃变性5分钟后，加入2UTaqDNA酶，石蜡油覆盖。反应在PECetus热循环仪中进行，反应条件为92℃45秒，50℃45秒，72℃1分钟，循环35次后，72℃延伸5分钟。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
, 百拇医药
1.4 SSCP分析
取10μlPCR产物，加10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA,0.05%溴酚蓝)，沸水中变性5分钟后立即于冰水中。10%非变性聚丙烯酰胺(29∶1)凝胶电泳，电压200伏，加冰水冷却。SSCP分析采用银染法[3]。
1.5 统计分析
RB基因突变与临床病理参数之间的关系用χ2检验。
2 结果
2.1 PCR-SSCP分析结果
35例胃癌标本均扩增出特异片段，无一例缺失。10例有17外显子泳动变位(图1中2)，15例有21外显子泳动变位，其中两例(图1中5，6)的泳动条带有多条。
, http://www.100md.com
图1 胃癌患者RB基因17外显子和21外显子的PCR-SSCP结果.N：癌旁组织；1～3为癌组织的17外显子；4～6为癌组织的21外显子；M：pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ,ds-双链DNA，ws-野生型单链DNA，ms-突变单链。
2.2 RB基因突变与胃癌临床病理的关系见表1
表1 RB基因突变与临床病理参数的关系 临床病理参数
总例数
RB基因突变
x2
P值
组织类型
0.17
, 百拇医药
>0.05
高、中分化腺癌
13
7
低分化腺癌
13
8
粘液腺癌
9
5
淋巴结转移
4.64
<0.05
, 百拇医药
无
16
6
有
19
14
病理分级
6.56
<0.05
Ⅰ和Ⅱ
18
6
Ⅲ和Ⅳ
17
, http://www.100md.com
13
3 讨论
RB基因在胃癌发生发展中的作用，尚未见报道。我们采用PCR-SSCP法检测到35例胃癌组织中10例有17外显子突变，占30%，15例有21外显子的突变，占44%，提示该区为RB基因突变的多发部位，这与Yandell在不同肿瘤细胞株中发现的RB基因的突变多发区相一致。本次的实验结果中还发现了2个病例的21外显子有多处点突变，进一步证实了胃癌组织中RB基因21外显子突变的多发性。缺失突变分析表明任何突变若影响到了RB蛋白的两个“结合袋”(pocket,由外显子13-17，18-22所编码)区，均可消除RB基因抑制细胞增殖的作用[4]。实验中所检测的外显子17和21正好分别位于RB蛋白两个“结合袋”编码区，它们的突变可能会影响到RB蛋白“结合袋”区结构，很可能使RB蛋白失去其调控细胞周期的作用。因此，该区域的突变可能是胃癌发生发展中的重要环节。
从病例检查结果分析看，中晚期胃癌中RB基因突变率明显高于早期胃癌，而与胃癌的组织类型无关。同时检测的癌旁正常组织中未见类似突变，暗示RB基因(主要指编码“结合袋”区)可能在胃癌发生发展中属较晚期的改变，这有待探讨。
, http://www.100md.com
RB基因的结构异常类型在癌症发生中有多种，已报道的有缺失、突变、甲基化、扩增等，在有些情况下RB基因有低外显率[5]。本次报道的胃癌组织中RB基因主要以突变为主，未发现RB基因的缺失。对于胃癌中是否存在RB基因的过表达或甲基化及RB基因突变的部位与表达量的关系，将做进一步的研究。
基金项目：湖北省教委科研青年发展基金资助项目，编号96C19
参考文献
1 李华川，陆士新，姜伟，等.食管癌组织中抗癌基因RB的研究[J].中华肿瘤杂志，1990，12(3)：161.
2 李华川，陆士新.食道组织中RB基因突变与表达的研究[J].中华肿瘤杂志，1993，15：412.
3 邵根泽，任运生，张少英，等.P53基因突变，int-2基因扩增与食管癌的关系[J].中华医学遗传学杂志，1997，14(5)：316.
4 Qin XQ, Chittenden T, Livingston DM, etal. Identification of agrowth suppression domain within the retinoblastoma geneproduct [J]. Genesand Dev, 1992,6(6):953～964.
5 黄倩，ThaddeusP.DryjaDavidW.Yandell.伴有低外显率的RB基因点突变及特征和意义[J].中华医学遗传学杂志，1998，15(3)：139.
收稿日期：1998-10-19；修回日期：1999-03-15, http://www.100md.com
单位：
阮绪芝 骆传祖 易建华 湖北郧阳医学院生物教研室(十堰，442000)；严世荣 黄永章 熊秀敏 湖北郧阳医学院生化教研室；易建华 湖北郧阳医学院附属太和医院病理科
关键词：胃肿瘤；RB基因；聚合酶链反应-单链构象多态性
癌症990437
中图分类号：R735.2 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(1999)04-0468-02
胃癌发生的分子机理尚不十分清楚，大量的研究表明，RB基因与肿瘤发生、生长调节密切相关。已在骨肉瘤、膀胱癌、食管癌[1]等中发现有RB基因的缺失、突变，而关于胃癌中RB基因突变的研究报道较少。我们采用PCR-SSCP方法，对胃癌组织中RB基因部分特殊区域进行了突变分析，以探讨胃癌发生与RB基因之间的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本收集
胃癌及癌旁正常组织均来自郧阳医学院附属太和医院病理科确诊的胃癌患者，病理分级采用1988年公布的新的TNM分期法，术后迅速取材，-20℃冻存。
1.2 DNA提取
常规酚、氯仿抽提法抽提。
1.3 PCR扩增
引物根据文献[2]报道设计，由上海生化所合成。
50μlPCR反应体系，含DNA样品0.2～0.5μg，50mmol/LKCl,10mmol/LTris-HCI,pH8.3，0.01%明胶，0.4mmol/LdNTP,1mmol/LMgCl2,上下游引物各50pmol，反应混合物经97℃变性5分钟后，加入2UTaqDNA酶，石蜡油覆盖。反应在PECetus热循环仪中进行，反应条件为92℃45秒，50℃45秒，72℃1分钟，循环35次后，72℃延伸5分钟。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
, 百拇医药
1.4 SSCP分析
取10μlPCR产物，加10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA,0.05%溴酚蓝)，沸水中变性5分钟后立即于冰水中。10%非变性聚丙烯酰胺(29∶1)凝胶电泳，电压200伏，加冰水冷却。SSCP分析采用银染法[3]。
1.5 统计分析
RB基因突变与临床病理参数之间的关系用χ2检验。
2 结果
2.1 PCR-SSCP分析结果
35例胃癌标本均扩增出特异片段，无一例缺失。10例有17外显子泳动变位(图1中2)，15例有21外显子泳动变位，其中两例(图1中5，6)的泳动条带有多条。
, http://www.100md.com
图1 胃癌患者RB基因17外显子和21外显子的PCR-SSCP结果.N：癌旁组织；1～3为癌组织的17外显子；4～6为癌组织的21外显子；M：pGEM-3Zf(+)/HaeⅢ,ds-双链DNA，ws-野生型单链DNA，ms-突变单链。
2.2 RB基因突变与胃癌临床病理的关系见表1
表1 RB基因突变与临床病理参数的关系 临床病理参数
总例数
RB基因突变
x2
P值
组织类型
0.17
, 百拇医药
>0.05
高、中分化腺癌
13
7
低分化腺癌
13
8
粘液腺癌
9
5
淋巴结转移
4.64
<0.05
, 百拇医药
无
16
6
有
19
14
病理分级
6.56
<0.05
Ⅰ和Ⅱ
18
6
Ⅲ和Ⅳ
17
, http://www.100md.com
13
3 讨论
RB基因在胃癌发生发展中的作用，尚未见报道。我们采用PCR-SSCP法检测到35例胃癌组织中10例有17外显子突变，占30%，15例有21外显子的突变，占44%，提示该区为RB基因突变的多发部位，这与Yandell在不同肿瘤细胞株中发现的RB基因的突变多发区相一致。本次的实验结果中还发现了2个病例的21外显子有多处点突变，进一步证实了胃癌组织中RB基因21外显子突变的多发性。缺失突变分析表明任何突变若影响到了RB蛋白的两个“结合袋”(pocket,由外显子13-17，18-22所编码)区，均可消除RB基因抑制细胞增殖的作用[4]。实验中所检测的外显子17和21正好分别位于RB蛋白两个“结合袋”编码区，它们的突变可能会影响到RB蛋白“结合袋”区结构，很可能使RB蛋白失去其调控细胞周期的作用。因此，该区域的突变可能是胃癌发生发展中的重要环节。
从病例检查结果分析看，中晚期胃癌中RB基因突变率明显高于早期胃癌，而与胃癌的组织类型无关。同时检测的癌旁正常组织中未见类似突变，暗示RB基因(主要指编码“结合袋”区)可能在胃癌发生发展中属较晚期的改变，这有待探讨。
, http://www.100md.com
RB基因的结构异常类型在癌症发生中有多种，已报道的有缺失、突变、甲基化、扩增等，在有些情况下RB基因有低外显率[5]。本次报道的胃癌组织中RB基因主要以突变为主，未发现RB基因的缺失。对于胃癌中是否存在RB基因的过表达或甲基化及RB基因突变的部位与表达量的关系，将做进一步的研究。
基金项目：湖北省教委科研青年发展基金资助项目，编号96C19
参考文献
1 李华川，陆士新，姜伟，等.食管癌组织中抗癌基因RB的研究[J].中华肿瘤杂志，1990，12(3)：161.
2 李华川，陆士新.食道组织中RB基因突变与表达的研究[J].中华肿瘤杂志，1993，15：412.
3 邵根泽，任运生，张少英，等.P53基因突变，int-2基因扩增与食管癌的关系[J].中华医学遗传学杂志，1997，14(5)：316.
4 Qin XQ, Chittenden T, Livingston DM, etal. Identification of agrowth suppression domain within the retinoblastoma geneproduct [J]. Genesand Dev, 1992,6(6):953～964.
5 黄倩，ThaddeusP.DryjaDavidW.Yandell.伴有低外显率的RB基因点突变及特征和意义[J].中华医学遗传学杂志，1998，15(3)：139.
收稿日期：1998-10-19；修回日期：1999-03-15, http://www.100md.com