用抗独特型疫苗主动免疫治疗鼻咽癌病人的临床研究
作者：李官成 谢鹭 周国华 符红普 周建华 孙去病
单位：李官成 谢鹭 周国华 孙去病 湖南医科大学肿瘤研究所(长沙，410078)；符红普 湖南省肿瘤医院放疗科(长沙，410006)；周建华 湖南医科大学病理教研室(长沙，410078)；孙去病 通讯作者
关键词：鼻咽肿瘤；抗独特型疫苗；主动免疫治疗
癌症990404
【摘要】目的：探讨抗独特型疫苗主动免疫治疗鼻咽癌病人的抗肿瘤效应。方法：用两株具有鼻咽癌相关抗原内影像的抗独特型单克隆抗体2H4、5D3，经氢氧化铝凝胶沉淀法制备成抗独特型疫苗Alum-2H4、Alum-5D3，对19例晚期鼻咽癌放疗病人作主动免疫治疗，9例放疗加生理盐水注射为对照组。用ELISA检测治疗前后病人血清抗体和细胞因子水平。用原位Northern杂交检测外周血单个核细胞(PBMC)IL-2mRNA的表达。结果：接受Alum-2H4或Alum-5D3治疗的病人无一例有过敏或其他毒副反应，血清中抗抗独特型抗体(Ab3)、抗肿瘤抗体(Ab1’)水平均有不同程度的增高，但也产生了人抗鼠抗体(HAMA)。血清细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2水平在大多数治疗组病人中升高。而对照组Ab1'、IFN-γ、TNF-α及IL-2血清水平均未升高。病人血清的IL-2含量与PBMCIL-2mRNA的表达呈正相关关系(r=0.8829)。结论：(1)疫苗化的2H4和5D3用于晚期鼻咽癌病人的主动免疫治疗是安全的。(2)抗独特型疫苗可作为模拟抗原激发鼻咽癌病人的主动免疫应答。
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中图分类号：R739.63 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0372-04
Clinic study of active immunotherapy with anti-idiotypic vaccine for patients of nasopharyngeal carcinoma(NPC)
LI Guan-cheng, XIE Lu, ZHOU Guo-hua, et al.
Cancer Reseach Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078,P. R. China
【Abstract】Objective：To investigate active immunotherapy with anti-idiotypic vaccine for patients with nasopharygeal carcinom (NPC). Method： Anti-idiotypic antibodies (2H4/5D3) bearing the internal image of the NPC antigen were used in active immunotherapy to NPC patients receiving radiotherapy. Using ELISA, antibodies and cytokine levels in patients’sera were determined before and after active immunotherapy. IL-2 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) were measured as well by in situ hybridization. Results：Nineteen patients with NPC at stage Ⅳ were treated with Alum-precipitated 2H4 or 5D3. Neither hypersensitivity nor adverse side effect was observed. Anti-anti-idiotypic antibodies (Ab3) were elevated, the levels of anti-NPC antibodies (Ab1') were increased and human anti-mouse antibodies (HAMA) were occurred in nineteen patients of the experimental group, where as the levels of Ab1' didn't rise in control group. SerumIL-2, IFN-γ and TNF-α levels were increased in most patients in experimental group. While in the control group, there was no difference of Ab1' and cytokine level between pre-therapy and post-therapy, in addition, IL-2 mRNA expression in PBMC of NPC patients was closely related to serum IL-2 (r=+0.8829) by in situ hybridization. Conclusions：(1)Anti-idiotype vaccine is safe for clinic active immunotherapy. (2) Anti-idiotypic vaccine might enhance humoral and/or cellular immunity of NPC patients receiving radiotherapy.
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Key words：Nasopharyngeal carcinoma;Anti-idiotyic vaccine;Active immunotherapy
根据Jerne免疫网络理论[1]，抗独特型抗体(Ab2β)在三维空间能够模拟Ab1所识别的抗原结构，可以替代肿瘤抗原作为抗肿瘤疫苗，激发机体体液免疫和细胞免疫应答。抗独特型抗体的这种分子模拟功能在肿瘤免疫治疗领域已展示出诱人的前景[2～5]。我们以杂交瘤技术制备模仿人鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)相关抗原的单克隆抗独特型抗体(Ab2)，利用其内影像特点，作为模拟抗原制成抗独特型疫苗，主动免疫治疗鼻咽癌病人进行临床研究，探索其抗肿瘤效应和应用价值。
1 材料和方法
1.1 临床资料
根据1987年国际防癌联合会(UICC)修订的TNM分期法[6]，选择Ⅳ期鼻咽癌病人33例，心、肝、肾功能正常；白细胞≥3×109/dl，血小板≥10×1010/dl。鼻咽癌病人在放疗1～2周后，随机进入实验一、二组和对照组。实验一、二组分别用Alum-2H4、Alum-5D3作主动免疫治疗。治疗前先用20μg抗独特型疫苗作皮内试验，阴性病人进入疗程。疗程为：在0、7、28天作三角肌下缘皮下注射，每次2mg。对照组用生理盐水代替抗独特型疫苗。治疗前及疗程结束2周后，分别采集病人外周血，一部分用于分离血清；另一部分肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。
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1.2 抗独特型疫苗的制备
抗独特型单克隆抗体2H4、5D3杂交瘤经常规腹水制备法获得抗体，采用正辛酸-饱和硫酸铵(SAS)序列沉淀法纯化、SDS-PAGE检测纯度。在无菌条件下，用氢氧化铝凝胶沉淀法(Alum-Precipitation)制成抗独特型疫苗，并调整抗体浓度为10mg/ml。60℃热处理30分钟灭活，然后通过支原体、细菌、热原质检测；用单剂量毒理研究法检测毒性[7]。
1.3 检测方法
1.3.1 血清抗体的检测：采用酶联免疫吸附法(ELISA)。1)抗抗独特型抗体(Ab3)：血清抗体中抗鼠IgG恒定区部分的吸收，以100μg正常鼠IgG加300μl病人血清预孵育，4℃振荡过夜。酶标板用30μg/ml的Ab2(2H4/5D3)100μl包被，1%BSA封板，加1∶40稀释的治疗前后的病人血清，以PBS作阴性对照，每孔100μl,37℃2h，PBS-Tween20洗板，加HRP-羊抗人IgG(北京生物制品研究所，效价1∶280)37℃2h，洗板，加底物ABTS显色20min，EL309型酶标仪(Bio-Tek)测A405值。2)抗肿瘤抗体(Ab1')∶5×104HNE2鼻咽癌细胞/孔铺板，0.15%戊二醛溶液固定，封板，病人血清1∶8稀释，然后同1。3)人抗鼠抗体(HAMA)：30μg/ml正常鼠IgG包被板，封板，病人治疗前后的血清以1∶100稀释，余同1。
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1.3.2 血清细胞因子水平的检测：病人血清按PREDITATM Tumor Necrosis Factor-α ELISA kit。 Inter Test-rTM Human IFN-γ ELISA kit和Inter Test-2xTM Human IL-2 ELISA kit(均为Genzyme Co.产品)的使用说明检测TNF-α、IFN-γ及IL-2的含量。
1.3.3 原位杂交检测PBMC IL-2 mRNA的表达：1)IL-2探针的制备：按分子克隆手册[8]，用氯化钙将插入IL-2基因片段的载体质粒pBR322转化大肠杆菌HB101，筛选阳性克隆。以碱裂解法提取质粒DNA，BamH Ⅰ酶切，电泳，回收0.94Kb的片段。以Dig-Ⅱ-dUTP(Dig DNA Labeling and Detection Kit，宝灵曼公司)及随机引物法标记。2)原位杂交：5×106/ml病人PBMC滴于涂有Apes胶的干洁玻片上，自然干燥，4%缓冲多聚甲醛固定。经杂交前处理和预杂交后，按常规方法进行。用宝灵曼公司Dig检测盒作免疫组化，镜检。并用PC Vision Plus(85型)通用图像分析系统测量杂交信号的灰度水平(Grey Level, GL)。设无探针杂交的阴性对照。
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2 结果
抗独特型疫苗Alum-2H4和Alum-5D3纯度良好，无菌、无热原质，毒理研究结果无异常。共有33例病人进入本实验，因客观原因，仅28例病人完成一个疗程。其中Alum-2H4治疗组11例，男性9例，女性2例，年龄范围26～57岁，平均年龄42.3岁。Alum-5D3治疗组8例，男性7例，女性1例，年龄范围27～57岁，平均年龄43.3岁。对照组9例，男性7例，女性2例，年龄范围26～62岁，平均年龄43.1岁。无一例病人有过敏性休克或其它系统性毒副反应，少部分病人局部有搔痒硬结，能自行消失。
2.1 血清抗体的检测
抗独特型疫苗主动免疫治疗的结果(表1)显示：所有用Ab2治疗的病人均产生了Ab3；而且鼻咽癌病人的血清中本来就存在抗肿瘤抗体(Ab1')，经主动免疫治疗后，病人血清Ab1'的水平有不同程度的提高。对照组无明显变化。但接受鼻咽癌抗独型疫苗治疗的病人的血清中均出现了人抗鼠抗体(HAMA)。
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表1 鼻咽癌病人免疫治疗前后血清中各种抗体的测定(A405值) 治疗措施
Ab3
Abl'
HAMA
Alum-2H4
治疗前
0.509±0.09
0.716±0.10
0.399±0.06
n=11
治疗后
1.407±0.23*
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1.439±0.24*
1.333±0.15*
Alum-5D3
治疗前
0.580±0.08
0.732±0.12
0.349±0.05
n=8
治疗后
1.574±0.22*
1.404±0.16*
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1.383±0.19*
对照组
治疗前
未做
0.571±0.06
未做
n=9
治疗后
未做
0.547±0.13**
未做
治疗后与治疗前比较：*：P<0.001;**P>0.2
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2.2 血清细胞因子的检测(表2)
表2 细胞因子检测结果(单位：pg/ml) 治疗措施
TNF-α
IFN-γ
IL-2
Alum-2H4
治疗前
UD
45.5±54.7
61.5±101.5
n=11
治疗后
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188.4±271.9*
386.2±258.9*
472.2±483.5*
Alum-5D3
治疗前
UD
80.8±76.2
216.9±191.6
n=8
治疗后
139.0±187.1*
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470.6±276.8*
824.1±767.0*
对照组
治疗前
UD
126.5±129.9
UD
n=9
治疗后
UD
69.9±83.5**
UD
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治疗后与治疗前比较：*：P<0.05;**P>0.2。UD：在可检测水平之下。
Alum-2H4治疗组：治疗前TNF-α低于可检出水平，治疗后5/11病人血清中可检出，平均水平为188.4±271.9 pg/ml(t=2.2974，P<0.05)；IFN-γ治疗前6/11病人的平均水平为45.5± 54.7 pg/ml，治疗后11/11病人的平均水平为386.2±258.9 pg/ml，明显高于治疗前(t=4.2697，P<0.001)；但有一例病人治疗后IFN-γ轻微下降。血清IL-2治疗前6/11病人的平均水平为65.1±101.5pg/ml,治疗后7/11病人的平均水平提高到472.2± 483.5 pg/ml(t=2.7572,P>0.02)；但在治疗前检出IL-2的6例病人中，有1例病人治疗后IL-2下降至可检出水平之下，且与IFN-γ下降为同一病人。
Alum-5D3治疗组：8例病人治疗前未检出TNF-α，治疗后4/8病人TNF-α升高，平均水平为139.0±187.1pg/ml(t=2.1673,P<0.05)；治疗前5/8病人IFN-γ的平均水平为80.8± 76.2 pg/ml，治疗后7/8病人的平均水平升高到470.6± 276.8 pg/ml，(t=3.8404,P<0.002);IL-2治疗前7/8病人的平均水平为216.9±191.6pg/ml，治疗后，除1例下降至低于可检测水平外，6/8病人的平均水平上升为824.1±767.0 pg/ml,(t=2.1724,P<0.05)。
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对照组：血清TNF-α、IL-2在放疗前后均低于可检测水平，而IFN-γ放疗前7/9病人检出的平均水平为126.5±129.9 pg/ml；放疗后7/9病人检出IFN-γ，平均水平为69.9±83.5pg/ml，呈下降趋势，但无统计学意义(t=1.1053,P>0.2)。
2.3 PBMCIL-2mRNA的表达及与血清IL-2的关系
原位DNA-RNA杂交结果显示淋巴细胞结构、形态保持良好，阳性信号清楚，经图像分析仪测算其灰度水平。Alum-2H4治疗组，平均灰度水平治疗前为128.65±16.2，治疗后为186.84±66.6，明显高于治疗前(t=2.8141,P<2.8141,)。Alum-5D3治疗组治疗前后平均灰度水平分别为155.99±35.6和214.14±16.6，有显著差别(t=2.1796,P<0.05)。对照组治疗前后平均灰度水平分别为105.21±9.97和108.25± 6.6，两者无差异(t=0.7634,P>0.2)；无探针杂交的阴性对照平均灰度水平为92.00±10.4(图1)。以病人PBMC灰度水平减去无探针杂交阴性对照的灰度水平，为IL-2mRNA的表达的数值，再将IL-2mRNA表达的灰度值与IL-2在血清中的蛋白表达量作相关分析，发现二者成正相关关系(r=0.8829,P<0.001)。
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图1 原位杂交检测鼻咽癌病人免疫治疗前后PBMCIL-2mRNA表达水平
3 讨论
由于抗独特型抗体在免疫网络中的特殊地位，它在肿瘤免疫治疗及预防中的潜力引起了广泛的关注。国外已对多种肿瘤制备了相应抗独特型抗体替代肿瘤抗原作为疫苗用于病人的主动免疫治疗。Mittleman等[2]报道了6年来采用HMW-MAA的内影像Ab2β(MK2-23)治疗恶性黑色素瘤的结果，发现在接受治疗的患者60%产生了抗HMW-MAA抗体(Ab3)，Ab3反应与患者存活期延长显著相关。Denton等[3]用模拟结肠癌相关抗原的Ab2β(105AD7)免疫13例晚期结肠癌患者，存活期(12个月)较未免疫对照组延长(4个月)。细胞因子的检测是判断机体细胞免疫功能的客观指标，有资料表明[9]：Th1细胞产生INF-γ、IL-10和TNF，促进细胞介导的免疫应答；Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6及LI-10，影响B细胞发育，增强体液免疫应答。Durrant等[4]用单克隆Ab2免疫结肠癌病人，有65%的病人血浆IL-2升高，40%病人血浆中可检测到TNF-α，并发现用Ab2免疫的病人的生存期明显长于未用Ab2免疫的病人(P=0.022)。Somasundaram等[5]用抗人胃肠道癌单抗GA733的多克隆羊Ab2治疗13例结肠癌病人，7例产生了与肿瘤细胞反应的Ab3，其中4例在治疗后诱导了CD4+MHCII依赖性的T细胞，并在体外培养中对Ab2或GA733抗原的刺激产生特异的增殖。这些结果提示，具有内影像特点的抗独特型抗体诱导产生的主动免疫应答，其过程涉及体液免疫和细胞免疫两方面。
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用鼻咽癌抗独特型疫苗(Alum-2H4/Alum-5D3)免疫病人能诱发生Ab3。Ab3是针对Ab2可变区产生的属特异性体液免疫应答，其中一部分能与Ab1互相模拟，即具有与原抗原结合性称之为抗肿瘤抗体Ab1’。我们发现在鼻咽癌病人血清中本来就存在抗鼻咽癌抗体，可能是病人自身免疫系统针对肿瘤抗原产生的，证实了鼻咽癌病人体液免疫反应程度较高的说法。Ab2免疫后能明显提高Ab1’的水平，可能直接参予对肿瘤细胞的抗体依赖细胞毒性或补体依赖细胞毒杀伤。总Ab3的产生已被证实与微小肿瘤病灶消退和/或病人生存时间延长成正相关[2～4]。鼻咽癌病人接受Ab2的主动免疫治疗后，部分病人产生了TNF，大部分病人的IFN和LI-2的含量增高；而单纯放疗的对照组病人，细胞因子水平未增高。提示Ab2对鼻咽癌病人免疫可能也激活了T细胞亚群(Th1)，活化的Th1细胞释放细胞因子。如IFN-γ可通过影响NK细胞及T细胞功能而发挥抗肿瘤效应；IL-2可促进T细胞生长，及克隆性扩增来增强机体的免疫功能，亦可诱导或促进多种细胞毒性细胞活性，如NK、CTL、LAK及TIL等，发挥免疫监视及抗肿瘤免疫功能。同时IL-2能协同刺激B细胞增殖及分泌抗体，与补体及效应细胞相作用，发挥ADCC及CDC的抗肿瘤效应。
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由于Ab2(2H4/5D3)是经杂交瘤产生的小鼠源性单抗，用于人体不可避免地均造成了人抗小鼠抗体(human-anti-mouse-antibody,HAMA)的产生。这是鼠源性抗体用于临床所面临的共同问题，但在接受Ab2进行主动免疫治疗的19例病人中，无一例病人出现超敏反应及明显的毒副作用，说明鼠源性Ab2用于治疗晚期病人是较安全可行的。
从本次实验的临床效果来看，无论是实验组还是对照组，最后均完全缓解或部分缓解出院。由于合并了放疗，观察时间短，无法判定与Ab2免疫治疗有关的确切效果。当然，放疗的效果是可肯以定的。但我们有充分理由推测Ab2的主动免疫治疗，通过提高病人免疫系统的抗肿瘤活性而有助于抑制肿瘤进一步转移或早期复发，是一种值得进一步探索的免疫疗法。
基金项目：本课题为国家自然科学基金(39270706)及美国中华医学基金会(CMB)资助项目。
参考文献
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5 Somasundarm R, Zaloudik J, Jacob L, et al. Induction of antigen-specific T and B cell immunity in colon carcinoma patients by anti-idiotypic antibody[J]. J Immunol, 1995,155：3253～3261.
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7 Operation manual for control of production, preclinical toxicology and phase Ⅰ trials of anti-tumor antibodies and drug antibody conjngates. Prepared by a Joint Committee of the：Cancer Research Compaign National Institute for Biological Standardsand Control[J]. Br J Cancer,1986;54：557～568.
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9 Liblau RS, Singer SM, Mc Devitt Ho. Th1 and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases [J]. Immunol Today, 1995,16(1)：34～38.
收稿日期：1999-06-04, http://www.100md.com
单位：李官成 谢鹭 周国华 孙去病 湖南医科大学肿瘤研究所(长沙，410078)；符红普 湖南省肿瘤医院放疗科(长沙，410006)；周建华 湖南医科大学病理教研室(长沙，410078)；孙去病 通讯作者
关键词：鼻咽肿瘤；抗独特型疫苗；主动免疫治疗
癌症990404
【摘要】目的：探讨抗独特型疫苗主动免疫治疗鼻咽癌病人的抗肿瘤效应。方法：用两株具有鼻咽癌相关抗原内影像的抗独特型单克隆抗体2H4、5D3，经氢氧化铝凝胶沉淀法制备成抗独特型疫苗Alum-2H4、Alum-5D3，对19例晚期鼻咽癌放疗病人作主动免疫治疗，9例放疗加生理盐水注射为对照组。用ELISA检测治疗前后病人血清抗体和细胞因子水平。用原位Northern杂交检测外周血单个核细胞(PBMC)IL-2mRNA的表达。结果：接受Alum-2H4或Alum-5D3治疗的病人无一例有过敏或其他毒副反应，血清中抗抗独特型抗体(Ab3)、抗肿瘤抗体(Ab1’)水平均有不同程度的增高，但也产生了人抗鼠抗体(HAMA)。血清细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2水平在大多数治疗组病人中升高。而对照组Ab1'、IFN-γ、TNF-α及IL-2血清水平均未升高。病人血清的IL-2含量与PBMCIL-2mRNA的表达呈正相关关系(r=0.8829)。结论：(1)疫苗化的2H4和5D3用于晚期鼻咽癌病人的主动免疫治疗是安全的。(2)抗独特型疫苗可作为模拟抗原激发鼻咽癌病人的主动免疫应答。
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中图分类号：R739.63 文献标识码：A 文章编号：1000-467X(1999)04-0372-04
Clinic study of active immunotherapy with anti-idiotypic vaccine for patients of nasopharyngeal carcinoma(NPC)
LI Guan-cheng, XIE Lu, ZHOU Guo-hua, et al.
Cancer Reseach Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078,P. R. China
【Abstract】Objective：To investigate active immunotherapy with anti-idiotypic vaccine for patients with nasopharygeal carcinom (NPC). Method： Anti-idiotypic antibodies (2H4/5D3) bearing the internal image of the NPC antigen were used in active immunotherapy to NPC patients receiving radiotherapy. Using ELISA, antibodies and cytokine levels in patients’sera were determined before and after active immunotherapy. IL-2 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) were measured as well by in situ hybridization. Results：Nineteen patients with NPC at stage Ⅳ were treated with Alum-precipitated 2H4 or 5D3. Neither hypersensitivity nor adverse side effect was observed. Anti-anti-idiotypic antibodies (Ab3) were elevated, the levels of anti-NPC antibodies (Ab1') were increased and human anti-mouse antibodies (HAMA) were occurred in nineteen patients of the experimental group, where as the levels of Ab1' didn't rise in control group. SerumIL-2, IFN-γ and TNF-α levels were increased in most patients in experimental group. While in the control group, there was no difference of Ab1' and cytokine level between pre-therapy and post-therapy, in addition, IL-2 mRNA expression in PBMC of NPC patients was closely related to serum IL-2 (r=+0.8829) by in situ hybridization. Conclusions：(1)Anti-idiotype vaccine is safe for clinic active immunotherapy. (2) Anti-idiotypic vaccine might enhance humoral and/or cellular immunity of NPC patients receiving radiotherapy.
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Key words：Nasopharyngeal carcinoma;Anti-idiotyic vaccine;Active immunotherapy
根据Jerne免疫网络理论[1]，抗独特型抗体(Ab2β)在三维空间能够模拟Ab1所识别的抗原结构，可以替代肿瘤抗原作为抗肿瘤疫苗，激发机体体液免疫和细胞免疫应答。抗独特型抗体的这种分子模拟功能在肿瘤免疫治疗领域已展示出诱人的前景[2～5]。我们以杂交瘤技术制备模仿人鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)相关抗原的单克隆抗独特型抗体(Ab2)，利用其内影像特点，作为模拟抗原制成抗独特型疫苗，主动免疫治疗鼻咽癌病人进行临床研究，探索其抗肿瘤效应和应用价值。
1 材料和方法
1.1 临床资料
根据1987年国际防癌联合会(UICC)修订的TNM分期法[6]，选择Ⅳ期鼻咽癌病人33例，心、肝、肾功能正常；白细胞≥3×109/dl，血小板≥10×1010/dl。鼻咽癌病人在放疗1～2周后，随机进入实验一、二组和对照组。实验一、二组分别用Alum-2H4、Alum-5D3作主动免疫治疗。治疗前先用20μg抗独特型疫苗作皮内试验，阴性病人进入疗程。疗程为：在0、7、28天作三角肌下缘皮下注射，每次2mg。对照组用生理盐水代替抗独特型疫苗。治疗前及疗程结束2周后，分别采集病人外周血，一部分用于分离血清；另一部分肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。
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1.2 抗独特型疫苗的制备
抗独特型单克隆抗体2H4、5D3杂交瘤经常规腹水制备法获得抗体，采用正辛酸-饱和硫酸铵(SAS)序列沉淀法纯化、SDS-PAGE检测纯度。在无菌条件下，用氢氧化铝凝胶沉淀法(Alum-Precipitation)制成抗独特型疫苗，并调整抗体浓度为10mg/ml。60℃热处理30分钟灭活，然后通过支原体、细菌、热原质检测；用单剂量毒理研究法检测毒性[7]。
1.3 检测方法
1.3.1 血清抗体的检测：采用酶联免疫吸附法(ELISA)。1)抗抗独特型抗体(Ab3)：血清抗体中抗鼠IgG恒定区部分的吸收，以100μg正常鼠IgG加300μl病人血清预孵育，4℃振荡过夜。酶标板用30μg/ml的Ab2(2H4/5D3)100μl包被，1%BSA封板，加1∶40稀释的治疗前后的病人血清，以PBS作阴性对照，每孔100μl,37℃2h，PBS-Tween20洗板，加HRP-羊抗人IgG(北京生物制品研究所，效价1∶280)37℃2h，洗板，加底物ABTS显色20min，EL309型酶标仪(Bio-Tek)测A405值。2)抗肿瘤抗体(Ab1')∶5×104HNE2鼻咽癌细胞/孔铺板，0.15%戊二醛溶液固定，封板，病人血清1∶8稀释，然后同1。3)人抗鼠抗体(HAMA)：30μg/ml正常鼠IgG包被板，封板，病人治疗前后的血清以1∶100稀释，余同1。
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1.3.2 血清细胞因子水平的检测：病人血清按PREDITATM Tumor Necrosis Factor-α ELISA kit。 Inter Test-rTM Human IFN-γ ELISA kit和Inter Test-2xTM Human IL-2 ELISA kit(均为Genzyme Co.产品)的使用说明检测TNF-α、IFN-γ及IL-2的含量。
1.3.3 原位杂交检测PBMC IL-2 mRNA的表达：1)IL-2探针的制备：按分子克隆手册[8]，用氯化钙将插入IL-2基因片段的载体质粒pBR322转化大肠杆菌HB101，筛选阳性克隆。以碱裂解法提取质粒DNA，BamH Ⅰ酶切，电泳，回收0.94Kb的片段。以Dig-Ⅱ-dUTP(Dig DNA Labeling and Detection Kit，宝灵曼公司)及随机引物法标记。2)原位杂交：5×106/ml病人PBMC滴于涂有Apes胶的干洁玻片上，自然干燥，4%缓冲多聚甲醛固定。经杂交前处理和预杂交后，按常规方法进行。用宝灵曼公司Dig检测盒作免疫组化，镜检。并用PC Vision Plus(85型)通用图像分析系统测量杂交信号的灰度水平(Grey Level, GL)。设无探针杂交的阴性对照。
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2 结果
抗独特型疫苗Alum-2H4和Alum-5D3纯度良好，无菌、无热原质，毒理研究结果无异常。共有33例病人进入本实验，因客观原因，仅28例病人完成一个疗程。其中Alum-2H4治疗组11例，男性9例，女性2例，年龄范围26～57岁，平均年龄42.3岁。Alum-5D3治疗组8例，男性7例，女性1例，年龄范围27～57岁，平均年龄43.3岁。对照组9例，男性7例，女性2例，年龄范围26～62岁，平均年龄43.1岁。无一例病人有过敏性休克或其它系统性毒副反应，少部分病人局部有搔痒硬结，能自行消失。
2.1 血清抗体的检测
抗独特型疫苗主动免疫治疗的结果(表1)显示：所有用Ab2治疗的病人均产生了Ab3；而且鼻咽癌病人的血清中本来就存在抗肿瘤抗体(Ab1')，经主动免疫治疗后，病人血清Ab1'的水平有不同程度的提高。对照组无明显变化。但接受鼻咽癌抗独型疫苗治疗的病人的血清中均出现了人抗鼠抗体(HAMA)。
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表1 鼻咽癌病人免疫治疗前后血清中各种抗体的测定(A405值) 治疗措施
Ab3
Abl'
HAMA
Alum-2H4
治疗前
0.509±0.09
0.716±0.10
0.399±0.06
n=11
治疗后
1.407±0.23*
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1.439±0.24*
1.333±0.15*
Alum-5D3
治疗前
0.580±0.08
0.732±0.12
0.349±0.05
n=8
治疗后
1.574±0.22*
1.404±0.16*
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1.383±0.19*
对照组
治疗前
未做
0.571±0.06
未做
n=9
治疗后
未做
0.547±0.13**
未做
治疗后与治疗前比较：*：P<0.001;**P>0.2
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2.2 血清细胞因子的检测(表2)
表2 细胞因子检测结果(单位：pg/ml) 治疗措施
TNF-α
IFN-γ
IL-2
Alum-2H4
治疗前
UD
45.5±54.7
61.5±101.5
n=11
治疗后
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188.4±271.9*
386.2±258.9*
472.2±483.5*
Alum-5D3
治疗前
UD
80.8±76.2
216.9±191.6
n=8
治疗后
139.0±187.1*
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470.6±276.8*
824.1±767.0*
对照组
治疗前
UD
126.5±129.9
UD
n=9
治疗后
UD
69.9±83.5**
UD
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治疗后与治疗前比较：*：P<0.05;**P>0.2。UD：在可检测水平之下。
Alum-2H4治疗组：治疗前TNF-α低于可检出水平，治疗后5/11病人血清中可检出，平均水平为188.4±271.9 pg/ml(t=2.2974，P<0.05)；IFN-γ治疗前6/11病人的平均水平为45.5± 54.7 pg/ml，治疗后11/11病人的平均水平为386.2±258.9 pg/ml，明显高于治疗前(t=4.2697，P<0.001)；但有一例病人治疗后IFN-γ轻微下降。血清IL-2治疗前6/11病人的平均水平为65.1±101.5pg/ml,治疗后7/11病人的平均水平提高到472.2± 483.5 pg/ml(t=2.7572,P>0.02)；但在治疗前检出IL-2的6例病人中，有1例病人治疗后IL-2下降至可检出水平之下，且与IFN-γ下降为同一病人。
Alum-5D3治疗组：8例病人治疗前未检出TNF-α，治疗后4/8病人TNF-α升高，平均水平为139.0±187.1pg/ml(t=2.1673,P<0.05)；治疗前5/8病人IFN-γ的平均水平为80.8± 76.2 pg/ml，治疗后7/8病人的平均水平升高到470.6± 276.8 pg/ml，(t=3.8404,P<0.002);IL-2治疗前7/8病人的平均水平为216.9±191.6pg/ml，治疗后，除1例下降至低于可检测水平外，6/8病人的平均水平上升为824.1±767.0 pg/ml,(t=2.1724,P<0.05)。
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对照组：血清TNF-α、IL-2在放疗前后均低于可检测水平，而IFN-γ放疗前7/9病人检出的平均水平为126.5±129.9 pg/ml；放疗后7/9病人检出IFN-γ，平均水平为69.9±83.5pg/ml，呈下降趋势，但无统计学意义(t=1.1053,P>0.2)。
2.3 PBMCIL-2mRNA的表达及与血清IL-2的关系
原位DNA-RNA杂交结果显示淋巴细胞结构、形态保持良好，阳性信号清楚，经图像分析仪测算其灰度水平。Alum-2H4治疗组，平均灰度水平治疗前为128.65±16.2，治疗后为186.84±66.6，明显高于治疗前(t=2.8141,P<2.8141,)。Alum-5D3治疗组治疗前后平均灰度水平分别为155.99±35.6和214.14±16.6，有显著差别(t=2.1796,P<0.05)。对照组治疗前后平均灰度水平分别为105.21±9.97和108.25± 6.6，两者无差异(t=0.7634,P>0.2)；无探针杂交的阴性对照平均灰度水平为92.00±10.4(图1)。以病人PBMC灰度水平减去无探针杂交阴性对照的灰度水平，为IL-2mRNA的表达的数值，再将IL-2mRNA表达的灰度值与IL-2在血清中的蛋白表达量作相关分析，发现二者成正相关关系(r=0.8829,P<0.001)。
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图1 原位杂交检测鼻咽癌病人免疫治疗前后PBMCIL-2mRNA表达水平
3 讨论
由于抗独特型抗体在免疫网络中的特殊地位，它在肿瘤免疫治疗及预防中的潜力引起了广泛的关注。国外已对多种肿瘤制备了相应抗独特型抗体替代肿瘤抗原作为疫苗用于病人的主动免疫治疗。Mittleman等[2]报道了6年来采用HMW-MAA的内影像Ab2β(MK2-23)治疗恶性黑色素瘤的结果，发现在接受治疗的患者60%产生了抗HMW-MAA抗体(Ab3)，Ab3反应与患者存活期延长显著相关。Denton等[3]用模拟结肠癌相关抗原的Ab2β(105AD7)免疫13例晚期结肠癌患者，存活期(12个月)较未免疫对照组延长(4个月)。细胞因子的检测是判断机体细胞免疫功能的客观指标，有资料表明[9]：Th1细胞产生INF-γ、IL-10和TNF，促进细胞介导的免疫应答；Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6及LI-10，影响B细胞发育，增强体液免疫应答。Durrant等[4]用单克隆Ab2免疫结肠癌病人，有65%的病人血浆IL-2升高，40%病人血浆中可检测到TNF-α，并发现用Ab2免疫的病人的生存期明显长于未用Ab2免疫的病人(P=0.022)。Somasundaram等[5]用抗人胃肠道癌单抗GA733的多克隆羊Ab2治疗13例结肠癌病人，7例产生了与肿瘤细胞反应的Ab3，其中4例在治疗后诱导了CD4+MHCII依赖性的T细胞，并在体外培养中对Ab2或GA733抗原的刺激产生特异的增殖。这些结果提示，具有内影像特点的抗独特型抗体诱导产生的主动免疫应答，其过程涉及体液免疫和细胞免疫两方面。
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用鼻咽癌抗独特型疫苗(Alum-2H4/Alum-5D3)免疫病人能诱发生Ab3。Ab3是针对Ab2可变区产生的属特异性体液免疫应答，其中一部分能与Ab1互相模拟，即具有与原抗原结合性称之为抗肿瘤抗体Ab1’。我们发现在鼻咽癌病人血清中本来就存在抗鼻咽癌抗体，可能是病人自身免疫系统针对肿瘤抗原产生的，证实了鼻咽癌病人体液免疫反应程度较高的说法。Ab2免疫后能明显提高Ab1’的水平，可能直接参予对肿瘤细胞的抗体依赖细胞毒性或补体依赖细胞毒杀伤。总Ab3的产生已被证实与微小肿瘤病灶消退和/或病人生存时间延长成正相关[2～4]。鼻咽癌病人接受Ab2的主动免疫治疗后，部分病人产生了TNF，大部分病人的IFN和LI-2的含量增高；而单纯放疗的对照组病人，细胞因子水平未增高。提示Ab2对鼻咽癌病人免疫可能也激活了T细胞亚群(Th1)，活化的Th1细胞释放细胞因子。如IFN-γ可通过影响NK细胞及T细胞功能而发挥抗肿瘤效应；IL-2可促进T细胞生长，及克隆性扩增来增强机体的免疫功能，亦可诱导或促进多种细胞毒性细胞活性，如NK、CTL、LAK及TIL等，发挥免疫监视及抗肿瘤免疫功能。同时IL-2能协同刺激B细胞增殖及分泌抗体，与补体及效应细胞相作用，发挥ADCC及CDC的抗肿瘤效应。
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由于Ab2(2H4/5D3)是经杂交瘤产生的小鼠源性单抗，用于人体不可避免地均造成了人抗小鼠抗体(human-anti-mouse-antibody,HAMA)的产生。这是鼠源性抗体用于临床所面临的共同问题，但在接受Ab2进行主动免疫治疗的19例病人中，无一例病人出现超敏反应及明显的毒副作用，说明鼠源性Ab2用于治疗晚期病人是较安全可行的。
从本次实验的临床效果来看，无论是实验组还是对照组，最后均完全缓解或部分缓解出院。由于合并了放疗，观察时间短，无法判定与Ab2免疫治疗有关的确切效果。当然，放疗的效果是可肯以定的。但我们有充分理由推测Ab2的主动免疫治疗，通过提高病人免疫系统的抗肿瘤活性而有助于抑制肿瘤进一步转移或早期复发，是一种值得进一步探索的免疫疗法。
基金项目：本课题为国家自然科学基金(39270706)及美国中华医学基金会(CMB)资助项目。
参考文献
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收稿日期：1999-06-04, http://www.100md.com