重症休克时血管反应性持续降低的机理
作者：赵克森 刘 杰 金春华 杨贵远 黄绪亮
单位：510515 广东省广州市，第一军医大学
关键词：
中国微循环990414
探讨重症难治性休克(又名不可逆性休克)的机理和防治是目前休克研究的热点之一。据美国新版病理生理学和西氏内科学，不可逆性休克是指病人对所有休克治疗措施处于无反应状态。其中微血管对升压药物反应性丧失是晚期休克难治的重要原因之一。Zhao等1985年报导，随着休克病程的进展，骨骼肌微动脉对儿茶酚胺的反应性，继早期升高后呈进行性下降，最后微血管呈现麻痹衰竭状态，即使输血补液治疗，这种反应性下降仍持续存在。长期血压降低和灌流量不足带来脑、心等重要生命器官功能障碍，它是休克后期死亡的重要原因之一。微循环衰竭几乎在各型休克的终末均会发生，其机制至今尚未完全查明。解决这一问题的关键是必须了解休克后期小血管平滑肌细胞内部到底发生了什么变化，使其失去了反应性。近年来由于血管平滑肌细胞快速分离技术，微电极和膜片钳技术，细胞荧光探针和共聚焦显微镜观察技术的进展，使本项研究有了深入探讨的可能。全军休克微循环重点实验室近年来对此作了系统的研究，从分子、细胞、整体三个层次进行了论证。
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1 血管平滑肌细胞膜电位的变化
复制大鼠重症失血性休克模型，制备脊斜肌微循环活体观察标本，以局部滴加去甲肾上腺素(NE)引起脊斜肌三级微动脉收缩的最低浓度作为血管反应性的阈值指标(Zhao 1985)。用微电极测定休克不同时期小动脉平滑肌条的膜电位，用链霉蛋白酶E (Pronase E)快速分离法分离小动脉平滑肌细胞(ASMCs)，以电位敏感荧光探针DiBAC4和ACAS 570共聚焦显微镜观察系统，测定血管平滑肌细胞膜电位的变化。
表1 失血性休克时血管平滑肌细胞膜电位(mV)的变化
休 克 前
休 克 后
20分钟
120分钟
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主动脉
-49.5±5.6
-38.7±6.1*
-52.3±8.4
n
22
19
14
小动脉
-36.7±6.3
-29.2±5.3*
-51.0±9.1*
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n
32
28
22
* 与失血前相比，P<0.01，n为测定血管数
结果查明，假手术对照组在术后2h内平滑肌膜电位与术前相比无明显变化。而在休克组动物，在休克早期(失血后20min)，小动脉平滑肌膜电位负值减少(由-36.7±6.3减至-29.2±5.3mV)，此时血管对NE的反应性明显增高(反应阈值由失血前0.17±0.03μg/ml减至0.05±0.02μg/ml)。在休克后期(失血后120min)，小动脉平滑肌膜电位负值明显增大为-51.0±9.1mV，出现超极化，而此时血管反应性显著降低(NE反应阈浓度提高14.7倍)。将休克过程中血管反应性的NE阈值与小动脉平滑肌膜电位进行相关分析，二者呈显著相关(相关系数0.96，P<0.01)。休克后期在用优降糖等实验治疗以后，可以改善超极化状态(平滑肌膜电位负值降低)，血管对NE的反应性也显著提高(见后述)。因此血管平滑肌细胞膜超极化是导致重症休克血管反应性低下的重要原因。
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2 血管平滑肌细胞膜ATP敏感钾通道的变化
神经、肌肉细胞静息膜电位是由于细胞膜上钾通道在静息时开放的结果。血管平滑肌细胞膜上有多种K+通道，其中ATP敏感K+通道(KATPchannel)近年来受到重视。它受细胞内ATP水平控制，在正常状态时多数是关闭的，只有当细胞氧化代谢障碍和ATP水平降低时才引起它的开放。它的特异阻滞剂是优降糖。为了探讨休克后期血管平滑肌超极化的机理，用膜片钳技术对KATP通道进行了测定。急性分离失血性休克2h的小动脉平滑肌原代细胞，采用细胞贴附式和内面向外式膜片钳技术，经膜片钳放大器(CEZ-2300，kohden)和信号数据采集系统(Lab master-125kHz Axon)对细胞膜KATP通道进行测定。
生理状况下，KATP通道主要处于关闭状态，在封接成功的200例正常血管平滑肌细胞中，仅有9%具有KATP通道电流活动。重症休克使记录到KATP通道特性电流的细胞增至33.3%，KATP通道电导增大，由111.0±6.5增至129.0±9.5PS，通道动力学也发生改变。由表2可见通道开放时间，包括去极化时通道开放的短成分和长成分，以及平均通道开放时间，通道开放概率也明显增大，并诱导通道呈多级开放。据此可以得出结论，重症休克时平滑肌细胞膜KATP通道开放，带来细胞膜超极化，参与低血管反应性的发生，它为防治休克低血管反应性提出新途径。当然平滑肌细胞膜K+通道还有多种，近年来钙依赖性钾通道也引起注意，尚需进一步扩大研究。
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表2 休克时小动脉平滑肌细胞膜KATP通道变化△
单通道电阻
(pS)
开放概率
%
开放时间短成份
ms
开放时间长成份
ms
平均开放时间
ms
对照组
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休克组
111±6.5
129±9.5*
2.77±1.0
34.8±14.5*
0.32±0.18
1.88±0.38*
6.9±4.33
13.12±3.66*
3.08±0.40
34.80±14.5*
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* 与对照组比，P<0.01；△ 在钳制电压-40mV条件下
3 平滑肌细胞内酸中毒的作用
临床经验指出，重症休克病人代谢性酸中毒不纠正，升压药物也难以发挥作用。但在重症休克时，小血管平滑肌细胞内pH发生了什么变化，它在低血管反应性中起何种作用，用碱性药物纠正全身性酸中毒是否能纠正平滑肌细胞内酸中毒，纠正了细胞内酸中毒，血管反应性是否完全恢复……？这些问题至今未见报告。
我们用上述方法分离重症休克后期小动脉平滑肌细胞，用pH敏感荧光探针(Snafl calcein-AM)和ACAS 570共聚焦显微镜测定细胞内pH值，用血气分析法测定休克晚期血液pH变化，用膜片钳测定平滑肌细胞内pH变化对KATP通道的影响。
从表3可见，失血性休克90min，小动脉平滑肌发生细胞内酸中毒，此时血管反应性明显下降，NE反应阈值升高14.7倍。当休克120min，pHi值进一步降为6.63±0.11，而NE阈值增至正常的50倍。将pHi与NE反应阈值进行相关分析，相关系数-0.999，说明pHi与反应性显著相关，细胞内酸中毒确实是反应性下降的重要原因之一。用NaHCO3治疗后，平滑肌pHi为7.03±0.16，与失血前已无明显差异(P>0.05)，但血管反应性仅部分恢复，NE反应阈值仍为正常的4.9倍。这说明细胞内酸中毒虽然参与反应性下降的发生，但并非是导致血管反应性下降的唯一因素，这也是临床重症休克患者在纠正酸中毒后有的升压效果并不显著的原因之一。用膜片钳技术证明，在有少量ATP存在(0.2mmol/L ATP)条件下，在钳制电压-40mV时，平滑肌细胞内pHi由7.2降至6.8，KATP通道开放概率明显增大，通道电流幅度增大(表4)。说明平滑肌细胞内酸中毒除了已知导致H+-Ca2+竞争以外，它还引起KATP通道开放，加重细胞膜超极化，也是引起血管反应性降低的原因之一。
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表3 重症休克ASMCs细胞内酸中毒对血管反应性影响
失 血 前
失 血90/
失 血120/
NaHCO3治疗后
细胞内pHi
(ASMC)
7.08±0.18
6.96±0.11*
6.63±0.11**
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7.03±0.16
NE阈浓度μg/ml
(血管反应性)
0.17±0.03
2.50±0.65**
8.49±0.81**
0.82±0.30*
* 与失血前比P<0.05；** 与失血前比P<0.01表4 ASMCs细胞内酸中毒对KATP通道影响△ KATP通道
pHi
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7.2
6.8
电流幅度pA
开放概率Po
-5.67±1.23
0.020±0.021
-7.51±151*
0.090±0.041**
* 与pH7.2比 P<0.05，** 与pH7.2比P<0.01；△钳制电压-40mV
4 NO在休克低血管反应性中的作用
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NO有强大的扩张血管作用。生理条件下，血管内皮细胞中固有的NO合酶(cNOS)催化NO持续合成，使得血管保持一定的舒张状态，对正常血压调节和器官血流分布起重要作用。休克时NO的作用一直是争论的问题。一般认为休克早期主要是通过cNOS的作用，产生一定量NO，具有扩张血管、减少白细胞和血小板聚集的作用。而在休克后期，通过诱生型合酶(iNOS)产生大量的NO，大量NO参与了血管反应性低下的发生。但实验治疗得到了矛盾的结果。有报告用NO抑制剂，如iNOS抑制剂，有提升血压和提高存活率作用。但也有报告抑制NO使全身血管阻力上升，对器官血流恢复不利，使用NO促进剂，如左旋精氨酸(L-Arg)反而能提高休克动物存活率。上述报告多数是在整体动物研究，没有从细胞水平直接观察NO对休克血管平滑肌所起的作用。也很难理解，在休克时同样一个NO，由cNOS产生的对机体有利，而由iNOS产生的则是有害的。它是由于NO量的不同还是发生了质的变化，抑或是由于所处阶段不同，血管本身的状态发生了变化？为此本室对NO的作用进行了研究，除了一般测定血中NO含量和NOS活性以外，着重研究NO对休克时血管平滑肌的作用，包括NO生成药物L-Arg和NO供体SNAP(S亚硝基-N-乙酰青霉胺)的作用。用膜电位敏感荧光探针(DiBAC4)和共聚焦显微镜，观察平滑肌细胞膜电位变化。
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结果查明，在失血性休克早期，血中NO已开始轻度增高，血管对NE反应性也增高。此时ASMCs有轻度的去极化，给NO未引起膜电位负值明显增大。在失血性休克后期血中NO显著增高，血管反应性下降。此时给游离的平滑肌加入底物L-Arg，ASMCs膜电位负值增加33.8±8.6%，加重了超极化。
NO供体SNAP试验证明，少量NO供体并不引起ASMCs超极化，只有大量SNAP才引起超极化。这种作用，又可以被事先加入超氧阴离子清除剂(Tiron)完全消除。说明大量NO是通过与O2形成过氧化硝酸根(OONO)而引起ASMCs超极化的。用KATP通道抑制剂(优降糖)，Kca通道抑制剂(蝎毒)，cGMP抑制剂(ODQ)证明，大量的OONO可能通过KATP、Kca、cGMP等途径引起ASMCs超极化和细胞内钙离子减少。本项研究初步说明，休克早期和后期NO为什么有不同的利弊效应，一方面是血管平滑肌膜电位处于不同状态，另一方面是NO量的不同和OONO形成。近年来文献报告OONO的细胞毒性作用，它可引起脂质过氧化，DNA断裂，激活多聚ADP-核糖合成酶(PARS)，抑制线粒体呼吸和带来能量耗竭，从而可能参与血管衰竭的发生，值得注意。
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5 平滑肌细胞内钙动力学变化的作用
一般认为，儿茶酚胺类缩血管药物引起小血管收缩过程包括：作用于肾上腺素能受体，引起细胞外Ca2+内流和以肌浆网为主的Ca2+释放，细胞内Ca2+浓度升高，使肌钙蛋白C变构，带来肌动-球蛋白结合而发生收缩。在此过程中钙离子起到重要的兴奋-收缩偶联的作用。为了进一步阐明休克后期ASMCs细胞膜超极化引起血管对升压药物收缩反应减低的原理，需要查明去甲肾上腺素作用后，平滑肌细胞内钙动力学的变化。对重症失血性休克后期，血管反应性下降的大鼠，游离小动脉原代平滑肌细胞，用钙敏感荧光探针Fluo-3-AM和激光共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+的变化。
从表5可见，正常大鼠ASMCs经NE(1μg/ml)刺激后，[Ca2+]i升高29.3±5.1%，而休克后期，仅升高14.7±1.1%，不足正常的50%。用EDTA鳌合Ca2+证明，此时外Ca2+内流减少更为显著。由于ASMCs细胞膜超极化，影响了电压依赖性钙通道(POC)的开放，使刺激时细胞内Ca2+升高幅度减低，从而使血管收缩反应性减弱(此时NE刺激阈值升高了14.7倍)。用优降糖阻断KTAP通道，减轻休克时ASMCs超极化，从而使NE刺激后，细胞内Ca2+增高的幅度回升，血管反应性也得到恢复(NE阈值由升高14.7倍下降到3倍)。
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表5 休克后期NE阈值和NE引起ASMCs[Ca2+]i变化的影响
NE阈值(μg/ml)
[Ca2+]i变化(%)
对照组
休克组
休克+优降糖组
0.17±0.03
2.50±0.64**
0.54±0.19**△
29.3±5.1
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14.7±1.1**
21.4±3.1**△
与对照组比 **P<0.01；与休克组比 △P<0.05，△△P<0.01
6 血管反应性恢复剂-休克治疗的新思路
综上所述，以平滑肌细胞膜超极化为中心的重症休克低血管反应性机理的阐明，为恢复和提高休克血管反应性提出了新思路。其发生机理可概括为图1。
图1 重症休克后期血管反应性下降的机理
ASMCs—小动脉平滑肌细胞 KATP—ATP敏感钾通道
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POC—电位依赖性钙通道 [Ca2+]i—细胞内钙离子浓度
在整体实验中，通过阻断血管收缩反应低下发生的多条通道，从而可能促进休克低血管反应性的恢复，我们将其统称为血管反应性恢复剂，其中包括KATP通道拮抗剂(优降糖)，预防OONO形成的超氧阴离子清除剂(tiron)，iNOS抑制剂(氨枯胍AG)，细胞内H+中和剂(NaHCO3)，以及中药虎杖甙等。如用优降糖和碳酸氢钠联合治疗，它使休克大鼠血管反应性阈值、血压、微动脉血流量均比对照组明显改善，24小时存活率也显著提高。这项研究一方面验证离体细胞研究的正确性，另一方面也为临床休克防治提出新思路。现已取得初步成果，目前这方面的工作正在进行之中。
参考文献
1 Zhao KS，Junker D，Delano FA，et al.Microvascular adjustments during irreversible hemorrhagic shock.Microvas Res.1985，30：143
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2 Liu J，Zhao KS，Jin CH，et al.Effect of intracellular acidosis on the pathogenesis of vascular hyporeactivity in severe hemorrhagic shock.Crit Care ＆ Shock.1999，3：112
3 刘杰，赵克森.重症休克大鼠细动脉平滑肌膜电位变化在血管反应性降低中的作用.中国病理生理杂志.1998，14：39
4 刘杰，赵克森.钙动力学变化在重症休克血管反应性低下发生中的作用.中华创伤杂志.1997，13：333
5 刘杰，赵克森，金春华.肠系膜细动脉平滑肌细胞的分离及其ATP敏感钾通道特性.第一军医大学学报.1998，18：8
6 刘杰，赵克森.重症休克时血管反应性降低的发生机制.医学卫生科学技术进展.军事医学科学出版社.1996，198—200
, 百拇医药
7 刘杰，金春华，赵克森.优降糖和碳酸氢钠对重症低血容量性休克大鼠的联合治疗作用.中国危重病急救医学.1999，11：348
8 刘杰，赵克森，王雪梅，等.血管平滑肌细胞内酸中毒在重症休克血管反应降低中的作用.中华创伤杂志.1999，15：245
9 刘杰，赵克森，金春华.重症休克时细动脉平滑肌细胞膜ATP敏感钾通道的变化.中华创伤杂志.1998，14：10
10 刘杰，赵克森，金春华.大鼠细动脉平滑肌细胞内酸中毒对ATP敏感钾通道的影响.中国病理生理杂志.1999，15：696
11 金春华，赵克森.虎杖甙对正常人血管平滑肌细胞内钙和膜电位的调节作用.中国病理生理杂志.1999，15：233
12 金春华，赵克森.虎杖甙对大鼠血管平滑肌膜电位的影响.第一军医大学学报.1998，28：202
13 金春华，赵克森，刘杰.虎杖甙对休克大鼠微血管平滑肌细胞钙、pH和膜电位的影响.中国药理学通报.1998，14；539, 百拇医药
单位：510515 广东省广州市，第一军医大学
关键词：
中国微循环990414
探讨重症难治性休克(又名不可逆性休克)的机理和防治是目前休克研究的热点之一。据美国新版病理生理学和西氏内科学，不可逆性休克是指病人对所有休克治疗措施处于无反应状态。其中微血管对升压药物反应性丧失是晚期休克难治的重要原因之一。Zhao等1985年报导，随着休克病程的进展，骨骼肌微动脉对儿茶酚胺的反应性，继早期升高后呈进行性下降，最后微血管呈现麻痹衰竭状态，即使输血补液治疗，这种反应性下降仍持续存在。长期血压降低和灌流量不足带来脑、心等重要生命器官功能障碍，它是休克后期死亡的重要原因之一。微循环衰竭几乎在各型休克的终末均会发生，其机制至今尚未完全查明。解决这一问题的关键是必须了解休克后期小血管平滑肌细胞内部到底发生了什么变化，使其失去了反应性。近年来由于血管平滑肌细胞快速分离技术，微电极和膜片钳技术，细胞荧光探针和共聚焦显微镜观察技术的进展，使本项研究有了深入探讨的可能。全军休克微循环重点实验室近年来对此作了系统的研究，从分子、细胞、整体三个层次进行了论证。
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1 血管平滑肌细胞膜电位的变化
复制大鼠重症失血性休克模型，制备脊斜肌微循环活体观察标本，以局部滴加去甲肾上腺素(NE)引起脊斜肌三级微动脉收缩的最低浓度作为血管反应性的阈值指标(Zhao 1985)。用微电极测定休克不同时期小动脉平滑肌条的膜电位，用链霉蛋白酶E (Pronase E)快速分离法分离小动脉平滑肌细胞(ASMCs)，以电位敏感荧光探针DiBAC4和ACAS 570共聚焦显微镜观察系统，测定血管平滑肌细胞膜电位的变化。
表1 失血性休克时血管平滑肌细胞膜电位(mV)的变化
休 克 前
休 克 后
20分钟
120分钟
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主动脉
-49.5±5.6
-38.7±6.1*
-52.3±8.4
n
22
19
14
小动脉
-36.7±6.3
-29.2±5.3*
-51.0±9.1*
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n
32
28
22
* 与失血前相比，P<0.01，n为测定血管数
结果查明，假手术对照组在术后2h内平滑肌膜电位与术前相比无明显变化。而在休克组动物，在休克早期(失血后20min)，小动脉平滑肌膜电位负值减少(由-36.7±6.3减至-29.2±5.3mV)，此时血管对NE的反应性明显增高(反应阈值由失血前0.17±0.03μg/ml减至0.05±0.02μg/ml)。在休克后期(失血后120min)，小动脉平滑肌膜电位负值明显增大为-51.0±9.1mV，出现超极化，而此时血管反应性显著降低(NE反应阈浓度提高14.7倍)。将休克过程中血管反应性的NE阈值与小动脉平滑肌膜电位进行相关分析，二者呈显著相关(相关系数0.96，P<0.01)。休克后期在用优降糖等实验治疗以后，可以改善超极化状态(平滑肌膜电位负值降低)，血管对NE的反应性也显著提高(见后述)。因此血管平滑肌细胞膜超极化是导致重症休克血管反应性低下的重要原因。
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2 血管平滑肌细胞膜ATP敏感钾通道的变化
神经、肌肉细胞静息膜电位是由于细胞膜上钾通道在静息时开放的结果。血管平滑肌细胞膜上有多种K+通道，其中ATP敏感K+通道(KATPchannel)近年来受到重视。它受细胞内ATP水平控制，在正常状态时多数是关闭的，只有当细胞氧化代谢障碍和ATP水平降低时才引起它的开放。它的特异阻滞剂是优降糖。为了探讨休克后期血管平滑肌超极化的机理，用膜片钳技术对KATP通道进行了测定。急性分离失血性休克2h的小动脉平滑肌原代细胞，采用细胞贴附式和内面向外式膜片钳技术，经膜片钳放大器(CEZ-2300，kohden)和信号数据采集系统(Lab master-125kHz Axon)对细胞膜KATP通道进行测定。
生理状况下，KATP通道主要处于关闭状态，在封接成功的200例正常血管平滑肌细胞中，仅有9%具有KATP通道电流活动。重症休克使记录到KATP通道特性电流的细胞增至33.3%，KATP通道电导增大，由111.0±6.5增至129.0±9.5PS，通道动力学也发生改变。由表2可见通道开放时间，包括去极化时通道开放的短成分和长成分，以及平均通道开放时间，通道开放概率也明显增大，并诱导通道呈多级开放。据此可以得出结论，重症休克时平滑肌细胞膜KATP通道开放，带来细胞膜超极化，参与低血管反应性的发生，它为防治休克低血管反应性提出新途径。当然平滑肌细胞膜K+通道还有多种，近年来钙依赖性钾通道也引起注意，尚需进一步扩大研究。
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表2 休克时小动脉平滑肌细胞膜KATP通道变化△
单通道电阻
(pS)
开放概率
%
开放时间短成份
ms
开放时间长成份
ms
平均开放时间
ms
对照组
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休克组
111±6.5
129±9.5*
2.77±1.0
34.8±14.5*
0.32±0.18
1.88±0.38*
6.9±4.33
13.12±3.66*
3.08±0.40
34.80±14.5*
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* 与对照组比，P<0.01；△ 在钳制电压-40mV条件下
3 平滑肌细胞内酸中毒的作用
临床经验指出，重症休克病人代谢性酸中毒不纠正，升压药物也难以发挥作用。但在重症休克时，小血管平滑肌细胞内pH发生了什么变化，它在低血管反应性中起何种作用，用碱性药物纠正全身性酸中毒是否能纠正平滑肌细胞内酸中毒，纠正了细胞内酸中毒，血管反应性是否完全恢复……？这些问题至今未见报告。
我们用上述方法分离重症休克后期小动脉平滑肌细胞，用pH敏感荧光探针(Snafl calcein-AM)和ACAS 570共聚焦显微镜测定细胞内pH值，用血气分析法测定休克晚期血液pH变化，用膜片钳测定平滑肌细胞内pH变化对KATP通道的影响。
从表3可见，失血性休克90min，小动脉平滑肌发生细胞内酸中毒，此时血管反应性明显下降，NE反应阈值升高14.7倍。当休克120min，pHi值进一步降为6.63±0.11，而NE阈值增至正常的50倍。将pHi与NE反应阈值进行相关分析，相关系数-0.999，说明pHi与反应性显著相关，细胞内酸中毒确实是反应性下降的重要原因之一。用NaHCO3治疗后，平滑肌pHi为7.03±0.16，与失血前已无明显差异(P>0.05)，但血管反应性仅部分恢复，NE反应阈值仍为正常的4.9倍。这说明细胞内酸中毒虽然参与反应性下降的发生，但并非是导致血管反应性下降的唯一因素，这也是临床重症休克患者在纠正酸中毒后有的升压效果并不显著的原因之一。用膜片钳技术证明，在有少量ATP存在(0.2mmol/L ATP)条件下，在钳制电压-40mV时，平滑肌细胞内pHi由7.2降至6.8，KATP通道开放概率明显增大，通道电流幅度增大(表4)。说明平滑肌细胞内酸中毒除了已知导致H+-Ca2+竞争以外，它还引起KATP通道开放，加重细胞膜超极化，也是引起血管反应性降低的原因之一。
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表3 重症休克ASMCs细胞内酸中毒对血管反应性影响
失 血 前
失 血90/
失 血120/
NaHCO3治疗后
细胞内pHi
(ASMC)
7.08±0.18
6.96±0.11*
6.63±0.11**
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7.03±0.16
NE阈浓度μg/ml
(血管反应性)
0.17±0.03
2.50±0.65**
8.49±0.81**
0.82±0.30*
* 与失血前比P<0.05；** 与失血前比P<0.01表4 ASMCs细胞内酸中毒对KATP通道影响△ KATP通道
pHi
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7.2
6.8
电流幅度pA
开放概率Po
-5.67±1.23
0.020±0.021
-7.51±151*
0.090±0.041**
* 与pH7.2比 P<0.05，** 与pH7.2比P<0.01；△钳制电压-40mV
4 NO在休克低血管反应性中的作用
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NO有强大的扩张血管作用。生理条件下，血管内皮细胞中固有的NO合酶(cNOS)催化NO持续合成，使得血管保持一定的舒张状态，对正常血压调节和器官血流分布起重要作用。休克时NO的作用一直是争论的问题。一般认为休克早期主要是通过cNOS的作用，产生一定量NO，具有扩张血管、减少白细胞和血小板聚集的作用。而在休克后期，通过诱生型合酶(iNOS)产生大量的NO，大量NO参与了血管反应性低下的发生。但实验治疗得到了矛盾的结果。有报告用NO抑制剂，如iNOS抑制剂，有提升血压和提高存活率作用。但也有报告抑制NO使全身血管阻力上升，对器官血流恢复不利，使用NO促进剂，如左旋精氨酸(L-Arg)反而能提高休克动物存活率。上述报告多数是在整体动物研究，没有从细胞水平直接观察NO对休克血管平滑肌所起的作用。也很难理解，在休克时同样一个NO，由cNOS产生的对机体有利，而由iNOS产生的则是有害的。它是由于NO量的不同还是发生了质的变化，抑或是由于所处阶段不同，血管本身的状态发生了变化？为此本室对NO的作用进行了研究，除了一般测定血中NO含量和NOS活性以外，着重研究NO对休克时血管平滑肌的作用，包括NO生成药物L-Arg和NO供体SNAP(S亚硝基-N-乙酰青霉胺)的作用。用膜电位敏感荧光探针(DiBAC4)和共聚焦显微镜，观察平滑肌细胞膜电位变化。
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结果查明，在失血性休克早期，血中NO已开始轻度增高，血管对NE反应性也增高。此时ASMCs有轻度的去极化，给NO未引起膜电位负值明显增大。在失血性休克后期血中NO显著增高，血管反应性下降。此时给游离的平滑肌加入底物L-Arg，ASMCs膜电位负值增加33.8±8.6%，加重了超极化。
NO供体SNAP试验证明，少量NO供体并不引起ASMCs超极化，只有大量SNAP才引起超极化。这种作用，又可以被事先加入超氧阴离子清除剂(Tiron)完全消除。说明大量NO是通过与O2形成过氧化硝酸根(OONO)而引起ASMCs超极化的。用KATP通道抑制剂(优降糖)，Kca通道抑制剂(蝎毒)，cGMP抑制剂(ODQ)证明，大量的OONO可能通过KATP、Kca、cGMP等途径引起ASMCs超极化和细胞内钙离子减少。本项研究初步说明，休克早期和后期NO为什么有不同的利弊效应，一方面是血管平滑肌膜电位处于不同状态，另一方面是NO量的不同和OONO形成。近年来文献报告OONO的细胞毒性作用，它可引起脂质过氧化，DNA断裂，激活多聚ADP-核糖合成酶(PARS)，抑制线粒体呼吸和带来能量耗竭，从而可能参与血管衰竭的发生，值得注意。
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5 平滑肌细胞内钙动力学变化的作用
一般认为，儿茶酚胺类缩血管药物引起小血管收缩过程包括：作用于肾上腺素能受体，引起细胞外Ca2+内流和以肌浆网为主的Ca2+释放，细胞内Ca2+浓度升高，使肌钙蛋白C变构，带来肌动-球蛋白结合而发生收缩。在此过程中钙离子起到重要的兴奋-收缩偶联的作用。为了进一步阐明休克后期ASMCs细胞膜超极化引起血管对升压药物收缩反应减低的原理，需要查明去甲肾上腺素作用后，平滑肌细胞内钙动力学的变化。对重症失血性休克后期，血管反应性下降的大鼠，游离小动脉原代平滑肌细胞，用钙敏感荧光探针Fluo-3-AM和激光共聚焦显微镜测定细胞内Ca2+的变化。
从表5可见，正常大鼠ASMCs经NE(1μg/ml)刺激后，[Ca2+]i升高29.3±5.1%，而休克后期，仅升高14.7±1.1%，不足正常的50%。用EDTA鳌合Ca2+证明，此时外Ca2+内流减少更为显著。由于ASMCs细胞膜超极化，影响了电压依赖性钙通道(POC)的开放，使刺激时细胞内Ca2+升高幅度减低，从而使血管收缩反应性减弱(此时NE刺激阈值升高了14.7倍)。用优降糖阻断KTAP通道，减轻休克时ASMCs超极化，从而使NE刺激后，细胞内Ca2+增高的幅度回升，血管反应性也得到恢复(NE阈值由升高14.7倍下降到3倍)。
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表5 休克后期NE阈值和NE引起ASMCs[Ca2+]i变化的影响
NE阈值(μg/ml)
[Ca2+]i变化(%)
对照组
休克组
休克+优降糖组
0.17±0.03
2.50±0.64**
0.54±0.19**△
29.3±5.1
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14.7±1.1**
21.4±3.1**△
与对照组比 **P<0.01；与休克组比 △P<0.05，△△P<0.01
6 血管反应性恢复剂-休克治疗的新思路
综上所述，以平滑肌细胞膜超极化为中心的重症休克低血管反应性机理的阐明，为恢复和提高休克血管反应性提出了新思路。其发生机理可概括为图1。
图1 重症休克后期血管反应性下降的机理
ASMCs—小动脉平滑肌细胞 KATP—ATP敏感钾通道
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POC—电位依赖性钙通道 [Ca2+]i—细胞内钙离子浓度
在整体实验中，通过阻断血管收缩反应低下发生的多条通道，从而可能促进休克低血管反应性的恢复，我们将其统称为血管反应性恢复剂，其中包括KATP通道拮抗剂(优降糖)，预防OONO形成的超氧阴离子清除剂(tiron)，iNOS抑制剂(氨枯胍AG)，细胞内H+中和剂(NaHCO3)，以及中药虎杖甙等。如用优降糖和碳酸氢钠联合治疗，它使休克大鼠血管反应性阈值、血压、微动脉血流量均比对照组明显改善，24小时存活率也显著提高。这项研究一方面验证离体细胞研究的正确性，另一方面也为临床休克防治提出新思路。现已取得初步成果，目前这方面的工作正在进行之中。
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