由空白前体脂质体制备抗癌药物脂质体
作者：全东琴 苏德森 顾学裘
单位：沈阳药科大学药学系
关键词：空白前体脂质体；包裹率；急性毒性；抑瘤率
沈阳药科大学学报990402 摘 要 以空白前体脂质体作为药物载体，将药物溶液分散在载体中，制成药物脂质体.空白前体脂质体对5-Fu等几种抗癌药物均可达到一定的包裹率，阿霉素在一定条件下可达到85%以上，并与传统薄膜法进行了比较.抑瘤活性及毒性实验结果表明：与游离药物相比，5-Fu、阿霉素等药物的抑瘤活性都有不同程度的提高.急性毒性实验表明：除Ara C外，几种药物的毒性均有所降低，以顺铂最明显.
分类号 R944.9
Liposomes of Anti-cancer Drugs Prepared by Empty Proliposomes
, 百拇医药
Quan Dongqin,Su Desen,Gu Xueqiu
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The empty proliposomes as the drug carrier were used to entrap hydrophilic anti-cancer drugs.The empty proliposomes could reach a certain trap efficiency to such cancer drugs as 5-Fu,compared with the “film”method.In certains conditions,the E% of ADM was up to 85%.The value of LD50(i.v)increased(other than Ara-C)and the inhibitory effect against S180 was improved significantly after being in mice,especially for ADM.
, 百拇医药
Key words empty proliposomes;trap efficiency;acute toxicity;tumour-inhibitory percentage
脂质体作为一种新剂型，在抗肿瘤药物的应用治疗上，具有其他剂型所无法比拟的优势和潜力〔1〕.肿瘤细胞吞噬力比正常细胞强，含有比正常细胞浓度高的磷酸酶及酰胺酶，所以如果将抗癌药物包封为脂质体，不仅由于酶解使药物容易释出，而且还促使药物在肿瘤细胞部位特意地蓄积，即脂质体对肿瘤细胞有被动靶向性.大量动物实验和临床结果表明，抗癌药物包封为脂质体后可以改变药物在体内分布，提高药物的选择性，从而达到提高药物疗效、减少毒副作用的目的.作者分别选取了临床上常见的抗癌药物，以空白前体脂质体作为抗癌药物载体，以敏感的S180瘤源为药理模型，与游离药物比较了抑瘤活性及毒性的改变.
1 材料与仪器
, http://www.100md.com
1.1 药品
5-Fu、FT-207(济南制药厂)；盐酸阿霉素ADM(海门制药厂)；盐酸阿糖胞苷Ara-C、顺铂DDP(锦州制药一厂)；干扰素IFN(沈阳新乐制药厂)；水杨酸钠(SS)、蛋黄卵磷脂EPC(自制)；胆固醇CH(进口分装).
1.2 仪器
可见紫外分光光度计(日本岛津UV-260)；高速匀浆机(江苏省江阴县祝塘仪器厂)；紫外检测器(北京新技术应用技术研究所).
2 实验方法与结果
2.1 空白前体脂质体的制备
蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇(CH)、高分子表面活性剂(P)重量比为4∶1∶2，采用融熔法制备〔2〕，即EPC、CH等脂溶性成分用少量乙醇溶解，加热至70℃左右，然后加入水相pH 7.2磷酸盐缓冲液，不断搅拌，再于匀浆机上以15 000 r/min匀化3次，加入支持剂，取1 mL分装于西林瓶中，冷冻干燥.冷冻干燥后的样品充氮气密封，避光贮存，待用.药物脂质体的制备是将药物溶液分散于空白前体脂质体中，用手振摇即可.
, 百拇医药
2.2 包裹率的测定
2.2.1 方法
用Sephadex G-50柱层析法，柱长30 cm，内径1 cm，流动相为pH 7.2磷酸盐缓冲液，流速为0.8 mL/min，上样量为0.5 mL，流出液直接接于检测器上，由记录仪上可得到分离图谱.接取游离5-Fu处的洗脱液，定容后于265 nm处测定吸收度值，代入标准曲线方程，求得C游，按EN=[(C总-C游)/C总]×100%.计算包裹率.
对阿霉素则接取脂质体峰处的洗脱液，用10%Triton X-100溶液以体积比1∶2加入脂质体中，使脂质体膜溶解，定容后于480 nm处测定吸收度值.空白脂质体同法操作作为对照.对干扰素采用离心法，将上清液进行活性检测，得出游离药物浓度.
, 百拇医药 2.2.2 与薄膜法制备药物脂质体包裹率的比较
以相同处方，水相为pH 7.2磷酸盐缓冲液，离子强度0.268，按薄膜法制备，测定5-Fu等不同药物的包裹率，结果见表1.由空白前体脂质体法制备的药物脂质体的包裹率高于薄膜法.
Tab.1 The results of E% compared
with the“film” method(n=3) Drugs
E/%
Film method
By empty proliposomes
5-Fu
16.5
, http://www.100md.com
25.4
FT-207
18.9
29.6
SS
9.3
20.0
ADM
56.8
85.6
Ara-C
20.3
56.2
, http://www.100md.com
IFN
23.5
33.3
2.3 小鼠S180抑瘤实验
2.3.1 材料与方法
材料：昆明种小白鼠，10只/组，雄性，体重17～22 g(沈阳药科大学实验动物中心提供)；肉瘤S180(辽宁省肿瘤研究所提供).
瘤细胞(S180)接种方法 ：用碘氟消毒瘤源小鼠腹部，吸取瘤液(必要时打开腹腔)，用生理盐水按体积比1∶1～1∶4稀释，混匀，每次取0.2 mL/只，打入小鼠腋下(无阻力，腋下鼓起).接种后24 h给药.
2.3.2 实验结果
, http://www.100md.com
见表2.可以看出，5-Fu等药物加入空白前体脂质体中后，对小鼠S180抑瘤作用都有显著提高，以阿霉素提高最显著.
Tab.2 Inhibitory effect against S180 in mice
Group
Administration way
Dose/mg.kg-1
Average tumor weight
(
±s)g
, http://www.100md.com Inhibitory/%
P
with control
with two groups
1
Control
i.p×7d
0.4 mL
1.87±0.31
5-Fu
i.p×7d
10
, 百拇医药
1.20±0.22
36.32
<0
L-5-Fu
i.p×7d
10
0.98±0.23
47.67
<0.001
<0.05
2
Control
i.p×7d
, http://www.100md.com
0.4 mL
1.87±0.31
FT-207
i.p×7d
100
0.74±0.16
67.04
<0.001
L-FT-207
i.p×7d
100
0.46±0.22
, 百拇医药
79.74
<0.001
<0.01
3
Control
i.p×5d
0.4 mL
1.87±0.31
ADM
i.p×5d
2
1.31±0.74
30.21
, 百拇医药
<0.001
L-ADM
i.p×5d
2
0.81±0.16
56.51
<0.001
<0.001
4
Control
i.p×7d
0.4 mL
2.87±0.77
, 百拇医药
DDP
i.p×7d
1
1.78±0.23
L-DDP
i.p×7d
1
1.38±0.31
52.01
<0.001
<0.01
5
Control
, http://www.100md.com
i.p×4.5 h×3
0.4 mL
2.28±0.61
Ara-C
i.p×4.5 h×3
10
1.60±0.27
29.79
<0.01
L-Ara-C
i.p×4.5 h×3
10
, 百拇医药
1.05±0.32
54.01
<0.01
<0.001
6
Control
i.p×4d
0.4 mL
1.97±0.58
MTX
i.p×4d
2
, 百拇医药
1.00±0.35
49.0
<0.001
L-MTX
i.p×4d
2
0.52±0.44
73.5
<0.001
<0.05
2.4 药物急性毒性实验
2.4.1 材料与方法
, 百拇医药
实验动物如前.
方法：以5-Fu为例.在预实验所获得的全不死和100%致死量的给药剂量范围内，5-Fu及L-5-Fu分别选用4个剂量，相邻剂量之间按比例1∶0.8.将小鼠随机分成8组，每组10只，其中4组按剂量尾静脉注射5-Fu，另外4组按剂量尾静脉注射L-5-Fu,观察4 d，记录每组死亡数.用简化机率单位法计算LD50(mg/kg)及95%可信限.
2.4.2 测定结果
见表3.
Tab.3 The results of LD50(i.v)in mice Drugs
LD50/mg.kg-1
, 百拇医药
Confident limit/mg.kg-1
5-Fu
222.72
198.97～249.33
L-5-Fu
273.80
243.77～307.50
FT-207
578.65
501.34～715.98
L-FT-207
, 百拇医药
624.86
531.34～715.98
DDP
9.66
8.40～11.11
L-DDP
19.76
17.25～32.99
Ara-C
210.3
187.02～236.53
L-Ara-C
, 百拇医药
158.33
125.18～200.46
ADM
13.25
11.50～15.99
L-ADM
26.75
23.43～31.87
4 d按第1，3，5，7天给药；始末动物数n=10 从表3中可以看出，5-Fu等药物加入空白前体脂质体中后，LD50(i.v)增加(除Ara-C)，毒性降低，以顺铂和阿霉素增加最显著，LD50(i.v)提高了两倍以上.Ara-C的毒性增加可能是因为游离的阿糖胞苷在体内半衰期短，消除较快，而加入空白前体脂质体中后，使阿糖胞苷在体内半衰期增加，消除减慢.3 讨论
, 百拇医药
a.在研究的5-Fu等6种药物中，ADM、Ara-C的包裹率较高，因为这两种药物与磷脂双分子层有较强的亲合作用(疏L-为加入空白前体脂体中水键力或静电引力)，ADM的包裹率更高一些，这可能是由于ADM是一种两亲性的药物，与磷脂(也是两亲性的)双分子层的亲合作用更强的缘故，这也可以解释为什么象干扰素这样的蛋白质药物，虽然分子质量很大，理论上很难包裹，但也可以获得较高包裹率的原因.
b.在相同处方条件下，由空白前体脂质体与薄膜法制备药物脂质体比较，前者对5-Fu等6种药物的包裹率有显著提高.这可能是由于一方面在冷冻干燥过程中，磷脂膜相互融合从而增大了脂质体的内水相体积；另一方面由于支持剂在膜内产生了一种高渗环境，有利于药物的进入.
参考文献
1 Guo LSS.Novel anti-fungal drug delivery:stable amphotericin B-cholesteryl sulfate dids.Int J Pharm,1991，75：45
2 顾学裘，马竹卿，辛顺妹，等.多相脂质体(139，76)混悬型静脉注射液的研究.中草药，1982，13(5)：15～20
收稿日期:1998-10-08, 百拇医药
单位：沈阳药科大学药学系
关键词：空白前体脂质体；包裹率；急性毒性；抑瘤率
沈阳药科大学学报990402 摘 要 以空白前体脂质体作为药物载体，将药物溶液分散在载体中，制成药物脂质体.空白前体脂质体对5-Fu等几种抗癌药物均可达到一定的包裹率，阿霉素在一定条件下可达到85%以上，并与传统薄膜法进行了比较.抑瘤活性及毒性实验结果表明：与游离药物相比，5-Fu、阿霉素等药物的抑瘤活性都有不同程度的提高.急性毒性实验表明：除Ara C外，几种药物的毒性均有所降低，以顺铂最明显.
分类号 R944.9
Liposomes of Anti-cancer Drugs Prepared by Empty Proliposomes
, 百拇医药
Quan Dongqin,Su Desen,Gu Xueqiu
Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015
Abstract The empty proliposomes as the drug carrier were used to entrap hydrophilic anti-cancer drugs.The empty proliposomes could reach a certain trap efficiency to such cancer drugs as 5-Fu,compared with the “film”method.In certains conditions,the E% of ADM was up to 85%.The value of LD50(i.v)increased(other than Ara-C)and the inhibitory effect against S180 was improved significantly after being in mice,especially for ADM.
, 百拇医药
Key words empty proliposomes;trap efficiency;acute toxicity;tumour-inhibitory percentage
脂质体作为一种新剂型，在抗肿瘤药物的应用治疗上，具有其他剂型所无法比拟的优势和潜力〔1〕.肿瘤细胞吞噬力比正常细胞强，含有比正常细胞浓度高的磷酸酶及酰胺酶，所以如果将抗癌药物包封为脂质体，不仅由于酶解使药物容易释出，而且还促使药物在肿瘤细胞部位特意地蓄积，即脂质体对肿瘤细胞有被动靶向性.大量动物实验和临床结果表明，抗癌药物包封为脂质体后可以改变药物在体内分布，提高药物的选择性，从而达到提高药物疗效、减少毒副作用的目的.作者分别选取了临床上常见的抗癌药物，以空白前体脂质体作为抗癌药物载体，以敏感的S180瘤源为药理模型，与游离药物比较了抑瘤活性及毒性的改变.
1 材料与仪器
, http://www.100md.com
1.1 药品
5-Fu、FT-207(济南制药厂)；盐酸阿霉素ADM(海门制药厂)；盐酸阿糖胞苷Ara-C、顺铂DDP(锦州制药一厂)；干扰素IFN(沈阳新乐制药厂)；水杨酸钠(SS)、蛋黄卵磷脂EPC(自制)；胆固醇CH(进口分装).
1.2 仪器
可见紫外分光光度计(日本岛津UV-260)；高速匀浆机(江苏省江阴县祝塘仪器厂)；紫外检测器(北京新技术应用技术研究所).
2 实验方法与结果
2.1 空白前体脂质体的制备
蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇(CH)、高分子表面活性剂(P)重量比为4∶1∶2，采用融熔法制备〔2〕，即EPC、CH等脂溶性成分用少量乙醇溶解，加热至70℃左右，然后加入水相pH 7.2磷酸盐缓冲液，不断搅拌，再于匀浆机上以15 000 r/min匀化3次，加入支持剂，取1 mL分装于西林瓶中，冷冻干燥.冷冻干燥后的样品充氮气密封，避光贮存，待用.药物脂质体的制备是将药物溶液分散于空白前体脂质体中，用手振摇即可.
, 百拇医药
2.2 包裹率的测定
2.2.1 方法
用Sephadex G-50柱层析法，柱长30 cm，内径1 cm，流动相为pH 7.2磷酸盐缓冲液，流速为0.8 mL/min，上样量为0.5 mL，流出液直接接于检测器上，由记录仪上可得到分离图谱.接取游离5-Fu处的洗脱液，定容后于265 nm处测定吸收度值，代入标准曲线方程，求得C游，按EN=[(C总-C游)/C总]×100%.计算包裹率.
对阿霉素则接取脂质体峰处的洗脱液，用10%Triton X-100溶液以体积比1∶2加入脂质体中，使脂质体膜溶解，定容后于480 nm处测定吸收度值.空白脂质体同法操作作为对照.对干扰素采用离心法，将上清液进行活性检测，得出游离药物浓度.
, 百拇医药 2.2.2 与薄膜法制备药物脂质体包裹率的比较
以相同处方，水相为pH 7.2磷酸盐缓冲液，离子强度0.268，按薄膜法制备，测定5-Fu等不同药物的包裹率，结果见表1.由空白前体脂质体法制备的药物脂质体的包裹率高于薄膜法.
Tab.1 The results of E% compared
with the“film” method(n=3) Drugs
E/%
Film method
By empty proliposomes
5-Fu
16.5
, http://www.100md.com
25.4
FT-207
18.9
29.6
SS
9.3
20.0
ADM
56.8
85.6
Ara-C
20.3
56.2
, http://www.100md.com
IFN
23.5
33.3
2.3 小鼠S180抑瘤实验
2.3.1 材料与方法
材料：昆明种小白鼠，10只/组，雄性，体重17～22 g(沈阳药科大学实验动物中心提供)；肉瘤S180(辽宁省肿瘤研究所提供).
瘤细胞(S180)接种方法 ：用碘氟消毒瘤源小鼠腹部，吸取瘤液(必要时打开腹腔)，用生理盐水按体积比1∶1～1∶4稀释，混匀，每次取0.2 mL/只，打入小鼠腋下(无阻力，腋下鼓起).接种后24 h给药.
2.3.2 实验结果
, http://www.100md.com
见表2.可以看出，5-Fu等药物加入空白前体脂质体中后，对小鼠S180抑瘤作用都有显著提高，以阿霉素提高最显著.
Tab.2 Inhibitory effect against S180 in mice
Group
Administration way
Dose/mg.kg-1
Average tumor weight
(
±s)g, http://www.100md.com Inhibitory/%
P
with control
with two groups
1
Control
i.p×7d
0.4 mL
1.87±0.31
5-Fu
i.p×7d
10
, 百拇医药
1.20±0.22
36.32
<0
L-5-Fu
i.p×7d
10
0.98±0.23
47.67
<0.001
<0.05
2
Control
i.p×7d
, http://www.100md.com
0.4 mL
1.87±0.31
FT-207
i.p×7d
100
0.74±0.16
67.04
<0.001
L-FT-207
i.p×7d
100
0.46±0.22
, 百拇医药
79.74
<0.001
<0.01
3
Control
i.p×5d
0.4 mL
1.87±0.31
ADM
i.p×5d
2
1.31±0.74
30.21
, 百拇医药
<0.001
L-ADM
i.p×5d
2
0.81±0.16
56.51
<0.001
<0.001
4
Control
i.p×7d
0.4 mL
2.87±0.77
, 百拇医药
DDP
i.p×7d
1
1.78±0.23
L-DDP
i.p×7d
1
1.38±0.31
52.01
<0.001
<0.01
5
Control
, http://www.100md.com
i.p×4.5 h×3
0.4 mL
2.28±0.61
Ara-C
i.p×4.5 h×3
10
1.60±0.27
29.79
<0.01
L-Ara-C
i.p×4.5 h×3
10
, 百拇医药
1.05±0.32
54.01
<0.01
<0.001
6
Control
i.p×4d
0.4 mL
1.97±0.58
MTX
i.p×4d
2
, 百拇医药
1.00±0.35
49.0
<0.001
L-MTX
i.p×4d
2
0.52±0.44
73.5
<0.001
<0.05
2.4 药物急性毒性实验
2.4.1 材料与方法
, 百拇医药
实验动物如前.
方法：以5-Fu为例.在预实验所获得的全不死和100%致死量的给药剂量范围内，5-Fu及L-5-Fu分别选用4个剂量，相邻剂量之间按比例1∶0.8.将小鼠随机分成8组，每组10只，其中4组按剂量尾静脉注射5-Fu，另外4组按剂量尾静脉注射L-5-Fu,观察4 d，记录每组死亡数.用简化机率单位法计算LD50(mg/kg)及95%可信限.
2.4.2 测定结果
见表3.
Tab.3 The results of LD50(i.v)in mice Drugs
LD50/mg.kg-1
, 百拇医药
Confident limit/mg.kg-1
5-Fu
222.72
198.97～249.33
L-5-Fu
273.80
243.77～307.50
FT-207
578.65
501.34～715.98
L-FT-207
, 百拇医药
624.86
531.34～715.98
DDP
9.66
8.40～11.11
L-DDP
19.76
17.25～32.99
Ara-C
210.3
187.02～236.53
L-Ara-C
, 百拇医药
158.33
125.18～200.46
ADM
13.25
11.50～15.99
L-ADM
26.75
23.43～31.87
4 d按第1，3，5，7天给药；始末动物数n=10 从表3中可以看出，5-Fu等药物加入空白前体脂质体中后，LD50(i.v)增加(除Ara-C)，毒性降低，以顺铂和阿霉素增加最显著，LD50(i.v)提高了两倍以上.Ara-C的毒性增加可能是因为游离的阿糖胞苷在体内半衰期短，消除较快，而加入空白前体脂质体中后，使阿糖胞苷在体内半衰期增加，消除减慢.3 讨论
, 百拇医药
a.在研究的5-Fu等6种药物中，ADM、Ara-C的包裹率较高，因为这两种药物与磷脂双分子层有较强的亲合作用(疏L-为加入空白前体脂体中水键力或静电引力)，ADM的包裹率更高一些，这可能是由于ADM是一种两亲性的药物，与磷脂(也是两亲性的)双分子层的亲合作用更强的缘故，这也可以解释为什么象干扰素这样的蛋白质药物，虽然分子质量很大，理论上很难包裹，但也可以获得较高包裹率的原因.
b.在相同处方条件下，由空白前体脂质体与薄膜法制备药物脂质体比较，前者对5-Fu等6种药物的包裹率有显著提高.这可能是由于一方面在冷冻干燥过程中，磷脂膜相互融合从而增大了脂质体的内水相体积；另一方面由于支持剂在膜内产生了一种高渗环境，有利于药物的进入.
参考文献
1 Guo LSS.Novel anti-fungal drug delivery:stable amphotericin B-cholesteryl sulfate dids.Int J Pharm,1991，75：45
2 顾学裘，马竹卿，辛顺妹，等.多相脂质体(139，76)混悬型静脉注射液的研究.中草药，1982，13(5)：15～20
收稿日期:1998-10-08, 百拇医药