类脂A和内毒素对人肾小球内皮细胞线粒体脱氢酶活性的影响
作者：罗晓凤 梁光萍 罗向东 杨宗城
单位：罗晓凤 梁光萍 罗向东 杨宗城 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所) 重庆，400038
关键词：类脂A；内毒素；人肾小球内皮细胞；线粒体脱氢酶；MTT法
提 要 目的
提 要 目的：为证明构成内毒素(LPS)的主要核心部分类脂A(Lipid A)在LPS直接损伤内皮细胞中所起的作用。方法：分离培养人肾小球内皮细胞(HGVEC)，把细胞分为正常对照组、LPS时间梯度组、LPS浓度梯度组和Lipid A浓度梯度组。线粒体脱氢酶(Mitochondria dehydrogenase,MtDH)活性采用MTT法测定。结果：时间梯度组：1 μg/ml LPS使内皮细胞线粒体脱氢酶活性呈进行性下降，在12 h时比正常对照组下降显著(P<0.01)。浓度梯度组LPS在0.9 μg/ml使线粒体脱氢酶活性显著下降，而Lipid A在0.6 μg/ml处即可出现显著下降。结论：LPS和Lipid A均可直接损伤HGVEC，使其线粒体脱氢酶活性下降，Lipid A的损伤作用强于LPS，证明Lipid A在LPS引起的内皮细胞直接损伤中起主要作用。
, 百拇医药
中图法分类号 R344;R344.51
Effects of lipid A and LPS on mitochondrial dehydrogenase of human glomerular endothelial cells*
Luo Xiaofeng, Liang Guangping, Luo Xiangdong, Yang Zongcheng
Research Institute of Burn, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400038
Abstract Objective: To investigate the injurious effects of LPS and lipid A on vascular endothelial cells (VECs). Methods: Cultured human glomerular vascular endothelial cells (HGVECs) were divided into the control group and the groups treated with LPS in different time durations, the groups treated with LPS in different concentrations and the groups treated with lipid A in different concentrations. The activity of mitochondrial dehydrogenase was measured with MTT. Results: LPS 1 μg/ml inhibited significantly the activity of mitochondrial dehydrogenase (P<0.01). The inhibiting concentration was lower in lipid A (0.6 μg/ml) than in LPS (0.9 μg/ml). Conclusion: Both LPS and lipid A possess direct injurious effects on HGVECs and inhibit the activity of mitochondrial dehydrogenase. The inhibition is more powerful in lipid A than in LPS. The finding suggests that lipid A plays a major role in the injurious effects on VECs.
, 百拇医药
Key words lipid A; LPS; human glomerular vascular endothelial cell; mitochondrial dehydrogenase; MTT
多脏器功能衰竭(MOF)是烧伤患者的严重并发症和主要致死原因[1]。近年研究发现血管内皮细胞损伤可能是引发烧伤后MOF的重要因素[2]。在多种引起VEC损伤的因素中LPS的损伤作用一直是人们关注的重点。现已知LPS的主要成份为Lipid A，但目前对于Lipid A在烧伤后MOF中所起的作用知之甚少。本研究采用体外培养的HGVEC为模型，动态观察了不同浓度下LPS和Lipid A和HGVEC线粒体脱氢酶活性的影响，以分析两者对VEC损伤的作用和程度，为进一步研究LPS对VEC的损伤机制和MOF发生机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 人肾小球内皮细胞(HGVEC)的培养
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新鲜人胎肾，用无菌Hanks液冲净表面血迹，剥离肾被膜，剪肾皮质于50目滤网研磨，同时用Hanks液将其冲滤至200目上，收集200目滤网上组织团，1 000 r/min离心10 min，沉淀为肾小球。将肾小球加入0.02%胶原酶(Hanks液配)中，孵育1 h，吹散细胞团，4 h后去掉未贴壁细胞。用含20%胎牛血清M199培养液培养，2～3 d换液一次，经抗Ⅷ因子及形态学鉴定，90%细胞为HGVEC。
1.2 LPS刺激HGVEC
单层融合细胞用0.25%EDTA-Na,0.25%胰酶消化2～3min,1000 r/min离心15 min，调整细胞密度为1.5×105个/ml,150μl/孔接种于96孔板，待细胞完全融合后弃上清，分为三组：
A组：内毒素时间梯度组(内毒素由Sigma公司购入，产品号L2880，来自大肠杆菌011：B4株)内毒素浓度为1.0μg/ml,37℃ 5%CO2孵育，时间分别为1、3、6、12 h，每时相各设5孔(含15%小牛血清)。另设正常细胞培养组作对照。
, 百拇医药
B组和C组：分别为内毒素和类脂A浓度梯度组 根据A组实验结果，LPS于12 h处对线粒体脱氢酶活性有显著抑制作用，设立LPS和Lipid A(Sigma,L5399，为双磷酸类脂A)，0.3、0.6、0.9、1.2 μg/ml处4个浓度梯度，以正常细胞组作对照，孵育12 h。每个浓度各设5孔。
1.3 MTT法测定MtDH活性
各时相点和浓度点弃去原培养液，加入MTT20μl/孔(5 g/L),37℃5%CO2孵育4 h，各孔中加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，室温振荡10 min，酶联反应仪测定490 nm波长处Dλ值。
1.4 统计学处理
采用t检验。
2 结果
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2.1 1 μg/ml LPS在不同时相点对HGVEC活力的影响
1 μg/ml LPS刺激HGVEC，分别于1、3、6、12 h测定MtDH活性。随时间延长，MtDH活性降低，至12 h时与正常对照组比较有显著降低(P<0.01)，见表1。
表1 1 μg/ml LPS对HGVECs的MtDH活性的影响(x±s)
Tab 1 The effect of LPS(1 μg/ml) on MtDH activityof HGVECs(±s)
Control
Incubation time(h)
1
3
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6
12
1.56±0.12
1.50±0.15
1.41±0.06
1.38±0.06
0.78±0.27※
n=5；※：P<0.01 vs control
2.2 不同浓度LPS和Lipid A与HGVEC孵育12 h MtDH活性比较
LPS和LipidA在相同浓度时比较MtDH活性差异不显著(P>0.05)；LPS和Lipid A随着浓度增加，MtDH活性逐渐降低，LPS升至0.9 μg/ml和LipidA升至0.6 μg/ml以后，MtDH活性显著低于对照(P<0.01)，见表2。
, 百拇医药
表2 不同浓度LPS和Lipid A对HGVEC的MtDH活性影响
Tab 2 The effect of LPS and Lipid A with various concentration on MtDH activity of HGVECs
Control
Concentration (μg/ml)
0.3
0.6
0.9
1.2
LPS
1.63±0.015
, 百拇医药
1.60±0.005
1.45±0.23
0.96±0.24※
1.05±0.17※
Lipid A
1.63±0.015
1.27±0.05
1.04±0.05※
0.91±0.12※
0.99±0.51※
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※：P<0.01 vs control;no significance between LPS group vs Lipid A group
2.3 形态学变化见图1、2
内毒素浓度达到0.9μg/ml以上，共同孵育时间达到12 h以上均可见到内皮细胞明显的形态学变化。最常见的形态改变为胞体收缩，细胞边缘卷曲，其次是细胞浆中的网状结构消失(卡马斯亮蓝染色时可见胞浆中丰富的网状结构)[3]。同时可见到较多的细胞核固缩，核碎裂，少数细胞的核消失、脱出。类脂A引起的内皮细胞损伤，在形态上与LPS非常相似，其损伤浓度在0.6μg/ml以上，作用时间在12 h以上。
图1 加入0.9 μg/ml LPS后12 h HGVEC的形态变化 细胞肿胀，胞浆内结构部分消失，胞核部分脱落，呈空泡状
, 百拇医药
Fig 1 Morphologic changes of HGVEC cultured in medium with 0.9 μg/ml LPS at 12 h
图2 加入0.6 μg/ml Lipid A后12 h HGVEC的形态变化 细胞皱缩，细胞间连接消失，部分细胞脱落，有些细胞呈空泡状
Fig 2 Morphologic changes of HGVEC cultured in medium with 0.6 μg/ml Lipid A at 12 h
3 讨论
LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁上的脂糖成分，由类脂A和多糖链组成。本实验所用类脂A为含有两种磷酸基的完整Lipid A[4]。文献报道单磷酸基Lipid A的生物活性低于双磷酸基Lipid A。目前认为LPS的主要生物学效应部分是脂多糖的类脂A部。烧伤早期血中内毒素升高较早，是参与损伤血管内皮细胞的重要因素之一。国内外对内毒素在多脏器损害发生中的作用已引起广泛关注。通常内毒素通过直接和间接两条途径损伤内皮细胞，使内皮细胞出现过强反应，引起功能和形态变化，对全身脏器造成损害。内毒素对血管内皮细胞的间接损害(指内毒素通过刺激免疫细胞，释放炎性介质和细胞因子作用内皮细胞)研究得较多，也比较深入[5]，而内毒素对内皮细胞的直接损伤研究较少，许多机制尚不清楚[6]，是一正待突破的环节。本实验从内毒素的主要生物活性成分类脂A入手，以直接作用于HGVEC的方法来研究内毒素的直接作用。
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本实验发现LPS和Lipid A对HGVEC线粒体脱氢酶活性有显著的直接抑制作用，并有明显的时间依赖性和浓度依赖性。刺激HGVEC同等时间(12 h)，Lipid A(0.6μg/ml)对HGVEC线粒体脱氢酶的抑制浓度低于LPS(0.9μg/ml)，从而说明Lipid A对HGVEC的直接损伤作用强于LPS。
实验说明Lipid A是损伤HGVEC的主要成分。LPS由O-特异侧链、核心多糖和类脂A组成，其分子量随所含糖、脂的比重不同而相差较大，约为(1 000～2 000)×103u，本实验所用LPS为大肠杆菌011：B4株提取，其LPS中富含类脂A。因此，从理论上推测与LPS相同浓度下Lipid A损伤效应应该大致与LPS相差不多，但由于目前尚不清楚内皮细胞上与LPS结合的受体物质的性质，还未有人对LPS损伤内皮细胞的机制进行研究，也未能证实LPS损伤内皮细胞的主要核心是Lipid A。本研究首次证明了Lipid A是LPS中对内皮细胞造成直接损伤的主要成分。
, 百拇医药
基金项目:国家自然科学基金资助项目,No.39830400
作者简介:罗晓凤,女,25岁,护师
参考文献
1 黄跃生，杨宗城，陈发明，等.严重烧伤脏器损害机制与防治.解放军医学杂志，1996，21(1)：20
2 杨宗城，罗向东，高建川，等.严重烧伤后内皮细胞损伤及其在早期脏器损害发病中的作用.解放军医学杂志，1996，21(1)：10
3 罗向东，杨宗城，黎 鳌.缺氧环境对培养的血管内皮细胞的损伤.中华创伤杂志，1996，12(5)：306
4 Qureshi N, Takayamak, Heller D, et al. Position of ester groups of the Lipid A backbone of lipopolysaccharides obtained from salmonella typhimurium. J Biol Chem,1983,258(21):12947
5 Tennenberg S D, Weller J J. Endotoxin-induced, nea-trophil-mediated entothelial cytotoxicity is enhanced by T-lyphocytes. J Surg Res,1997,69(1):11
6 罗向东，杨宗城，黎 鳌.内毒素对培养人脏静脉内皮细胞的损伤作用.中华创伤杂志，1998，14(3)：154
收稿：1998-10-10
修回：1999-02-01, 百拇医药
单位：罗晓凤 梁光萍 罗向东 杨宗城 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所) 重庆，400038
关键词：类脂A；内毒素；人肾小球内皮细胞；线粒体脱氢酶；MTT法
提 要 目的
提 要 目的：为证明构成内毒素(LPS)的主要核心部分类脂A(Lipid A)在LPS直接损伤内皮细胞中所起的作用。方法：分离培养人肾小球内皮细胞(HGVEC)，把细胞分为正常对照组、LPS时间梯度组、LPS浓度梯度组和Lipid A浓度梯度组。线粒体脱氢酶(Mitochondria dehydrogenase,MtDH)活性采用MTT法测定。结果：时间梯度组：1 μg/ml LPS使内皮细胞线粒体脱氢酶活性呈进行性下降，在12 h时比正常对照组下降显著(P<0.01)。浓度梯度组LPS在0.9 μg/ml使线粒体脱氢酶活性显著下降，而Lipid A在0.6 μg/ml处即可出现显著下降。结论：LPS和Lipid A均可直接损伤HGVEC，使其线粒体脱氢酶活性下降，Lipid A的损伤作用强于LPS，证明Lipid A在LPS引起的内皮细胞直接损伤中起主要作用。
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中图法分类号 R344;R344.51
Effects of lipid A and LPS on mitochondrial dehydrogenase of human glomerular endothelial cells*
Luo Xiaofeng, Liang Guangping, Luo Xiangdong, Yang Zongcheng
Research Institute of Burn, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing,400038
Abstract Objective: To investigate the injurious effects of LPS and lipid A on vascular endothelial cells (VECs). Methods: Cultured human glomerular vascular endothelial cells (HGVECs) were divided into the control group and the groups treated with LPS in different time durations, the groups treated with LPS in different concentrations and the groups treated with lipid A in different concentrations. The activity of mitochondrial dehydrogenase was measured with MTT. Results: LPS 1 μg/ml inhibited significantly the activity of mitochondrial dehydrogenase (P<0.01). The inhibiting concentration was lower in lipid A (0.6 μg/ml) than in LPS (0.9 μg/ml). Conclusion: Both LPS and lipid A possess direct injurious effects on HGVECs and inhibit the activity of mitochondrial dehydrogenase. The inhibition is more powerful in lipid A than in LPS. The finding suggests that lipid A plays a major role in the injurious effects on VECs.
, 百拇医药
Key words lipid A; LPS; human glomerular vascular endothelial cell; mitochondrial dehydrogenase; MTT
多脏器功能衰竭(MOF)是烧伤患者的严重并发症和主要致死原因[1]。近年研究发现血管内皮细胞损伤可能是引发烧伤后MOF的重要因素[2]。在多种引起VEC损伤的因素中LPS的损伤作用一直是人们关注的重点。现已知LPS的主要成份为Lipid A，但目前对于Lipid A在烧伤后MOF中所起的作用知之甚少。本研究采用体外培养的HGVEC为模型，动态观察了不同浓度下LPS和Lipid A和HGVEC线粒体脱氢酶活性的影响，以分析两者对VEC损伤的作用和程度，为进一步研究LPS对VEC的损伤机制和MOF发生机制提供依据。
1 材料与方法
1.1 人肾小球内皮细胞(HGVEC)的培养
, http://www.100md.com
新鲜人胎肾，用无菌Hanks液冲净表面血迹，剥离肾被膜，剪肾皮质于50目滤网研磨，同时用Hanks液将其冲滤至200目上，收集200目滤网上组织团，1 000 r/min离心10 min，沉淀为肾小球。将肾小球加入0.02%胶原酶(Hanks液配)中，孵育1 h，吹散细胞团，4 h后去掉未贴壁细胞。用含20%胎牛血清M199培养液培养，2～3 d换液一次，经抗Ⅷ因子及形态学鉴定，90%细胞为HGVEC。
1.2 LPS刺激HGVEC
单层融合细胞用0.25%EDTA-Na,0.25%胰酶消化2～3min,1000 r/min离心15 min，调整细胞密度为1.5×105个/ml,150μl/孔接种于96孔板，待细胞完全融合后弃上清，分为三组：
A组：内毒素时间梯度组(内毒素由Sigma公司购入，产品号L2880，来自大肠杆菌011：B4株)内毒素浓度为1.0μg/ml,37℃ 5%CO2孵育，时间分别为1、3、6、12 h，每时相各设5孔(含15%小牛血清)。另设正常细胞培养组作对照。
, 百拇医药
B组和C组：分别为内毒素和类脂A浓度梯度组 根据A组实验结果，LPS于12 h处对线粒体脱氢酶活性有显著抑制作用，设立LPS和Lipid A(Sigma,L5399，为双磷酸类脂A)，0.3、0.6、0.9、1.2 μg/ml处4个浓度梯度，以正常细胞组作对照，孵育12 h。每个浓度各设5孔。
1.3 MTT法测定MtDH活性
各时相点和浓度点弃去原培养液，加入MTT20μl/孔(5 g/L),37℃5%CO2孵育4 h，各孔中加入200μl二甲基亚砜(DMSO)，室温振荡10 min，酶联反应仪测定490 nm波长处Dλ值。
1.4 统计学处理
采用t检验。
2 结果
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2.1 1 μg/ml LPS在不同时相点对HGVEC活力的影响
1 μg/ml LPS刺激HGVEC，分别于1、3、6、12 h测定MtDH活性。随时间延长，MtDH活性降低，至12 h时与正常对照组比较有显著降低(P<0.01)，见表1。
表1 1 μg/ml LPS对HGVECs的MtDH活性的影响(x±s)
Tab 1 The effect of LPS(1 μg/ml) on MtDH activityof HGVECs(±s)
Control
Incubation time(h)
1
3
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6
12
1.56±0.12
1.50±0.15
1.41±0.06
1.38±0.06
0.78±0.27※
n=5；※：P<0.01 vs control
2.2 不同浓度LPS和Lipid A与HGVEC孵育12 h MtDH活性比较
LPS和LipidA在相同浓度时比较MtDH活性差异不显著(P>0.05)；LPS和Lipid A随着浓度增加，MtDH活性逐渐降低，LPS升至0.9 μg/ml和LipidA升至0.6 μg/ml以后，MtDH活性显著低于对照(P<0.01)，见表2。
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表2 不同浓度LPS和Lipid A对HGVEC的MtDH活性影响
Tab 2 The effect of LPS and Lipid A with various concentration on MtDH activity of HGVECs
Control
Concentration (μg/ml)
0.3
0.6
0.9
1.2
LPS
1.63±0.015
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1.60±0.005
1.45±0.23
0.96±0.24※
1.05±0.17※
Lipid A
1.63±0.015
1.27±0.05
1.04±0.05※
0.91±0.12※
0.99±0.51※
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※：P<0.01 vs control;no significance between LPS group vs Lipid A group
2.3 形态学变化见图1、2
内毒素浓度达到0.9μg/ml以上，共同孵育时间达到12 h以上均可见到内皮细胞明显的形态学变化。最常见的形态改变为胞体收缩，细胞边缘卷曲，其次是细胞浆中的网状结构消失(卡马斯亮蓝染色时可见胞浆中丰富的网状结构)[3]。同时可见到较多的细胞核固缩，核碎裂，少数细胞的核消失、脱出。类脂A引起的内皮细胞损伤，在形态上与LPS非常相似，其损伤浓度在0.6μg/ml以上，作用时间在12 h以上。
图1 加入0.9 μg/ml LPS后12 h HGVEC的形态变化 细胞肿胀，胞浆内结构部分消失，胞核部分脱落，呈空泡状
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Fig 1 Morphologic changes of HGVEC cultured in medium with 0.9 μg/ml LPS at 12 h
图2 加入0.6 μg/ml Lipid A后12 h HGVEC的形态变化 细胞皱缩，细胞间连接消失，部分细胞脱落，有些细胞呈空泡状
Fig 2 Morphologic changes of HGVEC cultured in medium with 0.6 μg/ml Lipid A at 12 h
3 讨论
LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁上的脂糖成分，由类脂A和多糖链组成。本实验所用类脂A为含有两种磷酸基的完整Lipid A[4]。文献报道单磷酸基Lipid A的生物活性低于双磷酸基Lipid A。目前认为LPS的主要生物学效应部分是脂多糖的类脂A部。烧伤早期血中内毒素升高较早，是参与损伤血管内皮细胞的重要因素之一。国内外对内毒素在多脏器损害发生中的作用已引起广泛关注。通常内毒素通过直接和间接两条途径损伤内皮细胞，使内皮细胞出现过强反应，引起功能和形态变化，对全身脏器造成损害。内毒素对血管内皮细胞的间接损害(指内毒素通过刺激免疫细胞，释放炎性介质和细胞因子作用内皮细胞)研究得较多，也比较深入[5]，而内毒素对内皮细胞的直接损伤研究较少，许多机制尚不清楚[6]，是一正待突破的环节。本实验从内毒素的主要生物活性成分类脂A入手，以直接作用于HGVEC的方法来研究内毒素的直接作用。
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本实验发现LPS和Lipid A对HGVEC线粒体脱氢酶活性有显著的直接抑制作用，并有明显的时间依赖性和浓度依赖性。刺激HGVEC同等时间(12 h)，Lipid A(0.6μg/ml)对HGVEC线粒体脱氢酶的抑制浓度低于LPS(0.9μg/ml)，从而说明Lipid A对HGVEC的直接损伤作用强于LPS。
实验说明Lipid A是损伤HGVEC的主要成分。LPS由O-特异侧链、核心多糖和类脂A组成，其分子量随所含糖、脂的比重不同而相差较大，约为(1 000～2 000)×103u，本实验所用LPS为大肠杆菌011：B4株提取，其LPS中富含类脂A。因此，从理论上推测与LPS相同浓度下Lipid A损伤效应应该大致与LPS相差不多，但由于目前尚不清楚内皮细胞上与LPS结合的受体物质的性质，还未有人对LPS损伤内皮细胞的机制进行研究，也未能证实LPS损伤内皮细胞的主要核心是Lipid A。本研究首次证明了Lipid A是LPS中对内皮细胞造成直接损伤的主要成分。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目,No.39830400
作者简介:罗晓凤,女,25岁,护师
参考文献
1 黄跃生，杨宗城，陈发明，等.严重烧伤脏器损害机制与防治.解放军医学杂志，1996，21(1)：20
2 杨宗城，罗向东，高建川，等.严重烧伤后内皮细胞损伤及其在早期脏器损害发病中的作用.解放军医学杂志，1996，21(1)：10
3 罗向东，杨宗城，黎 鳌.缺氧环境对培养的血管内皮细胞的损伤.中华创伤杂志，1996，12(5)：306
4 Qureshi N, Takayamak, Heller D, et al. Position of ester groups of the Lipid A backbone of lipopolysaccharides obtained from salmonella typhimurium. J Biol Chem,1983,258(21):12947
5 Tennenberg S D, Weller J J. Endotoxin-induced, nea-trophil-mediated entothelial cytotoxicity is enhanced by T-lyphocytes. J Surg Res,1997,69(1):11
6 罗向东，杨宗城，黎 鳌.内毒素对培养人脏静脉内皮细胞的损伤作用.中华创伤杂志，1998，14(3)：154
收稿：1998-10-10
修回：1999-02-01, 百拇医药