血小板衍生生长因子刺激鼠成骨细胞内Ca2+浓度变化的实验研究*
作者：李菊根 陈建庭 金大地
单位：李菊根 (广州军区广州总医院骨科，广州，510010)；陈建庭 金大地 (第一军医大学南方医院骨科，广州，510515)
关键词：PDGF；成骨细胞；Ca2+；ACAS
血小板衍生生长因子刺激鼠成骨细胞内Ca2 摘要：目的 观察血小板衍生生长因子(PDGF)等生长因子对鼠成骨细胞内Ca2+浓度变化的影响。方法 酶消化法体外分离培养胎儿鼠成骨细胞，应用ACAS检测成骨细胞内Ca2+浓度的变化。结果 PDGF可促进成骨细胞内Ca2+浓度的瞬时增加;PDGF与BMP、TGF-β联合应用对成骨细胞Ca2+浓度升高有协同作用;ACAS能准确测量胞内Ca2+浓度的动态变化。结论 PDGF可促进成骨细胞内Ca2+浓度的增加，且与BMP、TGF-β有协同效应。
, 百拇医药
中图分类号：R336
Changes in intracellular Ca2+ concentration of rat osteoblasts produced by platelet-derived growth factor：An experimental study
Li Jugen
(Department of Orthopedics，Guangzhou General Hospital of PLA，Guangzhou，510010)
Chen Jianting，Jin Dadi
(Department of Orthopedics，Nanfang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou，510515) Abstract：Objective To observe the effect of platelet-derived growth factor (PDGF) on the change in intracellular Ca2+ concentration of rat osteoblasts.Methods The rat osteoblasts were isolated and cultured by enzyme digestion，and adherent cell analysis and sorting cytometer (ACAS) was employed to assay the change of intracellular Ca2+ concentration of rat osteoblasts.Results Intracellular Ca2+ concentration was increased instantaneously; synergic action on Ca2+ concentration was attained by the combined use of PDGF and BMP or TGF-β;The dynamic change of intracellular Ca2+ concentration was measured exactly by ACAS.Conclusion PDGF could increase Ca2+ concentration and attain a synergic action of PDGF and BMP or TGF-β.
, 百拇医药
Key words：PDGF;osteoblasts; Ca2+;ACAS
血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)是一种存在于多种组织(包括骨组织)中的多肽生长因子，在骨折修复过程中起重要作用。成骨细胞是骨组织中的主要成份，是骨的修复与重建过程中的重要功能细胞[1]。已有实验证明PDGF可刺激鼠成骨细胞的分裂、增殖[2]。本实验应用粘附细胞仪(Adherent cell analysis and sorting cytometer，ACAS)观察PDGF、骨形态形成蛋白(Bone morphogentic protein，BMP)、转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)等生长因子对鼠成骨细胞内Ca2+浓度变化的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要试剂 DMEM培养液(Gibco)，型胶原酶(Sigma,)，胰蛋白酶(Promega)，PDGF-AB辈(Promega)，BMP(北京帮定生物公司)，TGF-β(暨南大学生物医学工程系)。
1.2 主要仪器与材料 570型粘附式细胞仪(ACAS-570)，1～2 d龄SD纯种大鼠，无菌操作取出其双侧颅盖骨。
1.3 方法
1.3.1 细胞分离和培养[3] 取1～2 d龄SD纯种大鼠颅盖骨，经缓冲液冲洗后剪碎。0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶反复消化4次，过滤收集后3次消化液，以1000 r/min离心10～15 min，使细胞沉淀，用吸管轻轻吹匀制成细胞悬液。悬液细胞经改良钙-钴组化法和真空负压LSAB法(免疫组化法)进行碱性磷酸酶(ALP)染色,结果细胞ALP染色阳性率为95%以上,即悬液细胞为成骨细胞。台盼兰染色计数90%以上细胞存活，每25 ml培养瓶中细胞接种量约(3.5～4.0)×105个，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每隔2 d换一次培养液，5～7 d细胞长成致密单层时，原代细胞按1:2进行传代培养。
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1.3.2 ACAS样品制备 以第二代传代成骨细胞按1.0×104个/皿接种于专用塑料培养皿，孵育24h；弃培养液，Hepes液轻洗二次，每皿加入Fluo-3染料100 μl，孵育1 h；Hepes液轻洗3次，每皿均加1.0 mlHepes液， ACAS检测各组细胞内Ca2+浓度变化。
本实验设对照组、P组、P+B组、P+T组，每组样本数10例，对照组为无血清DMEM培养液细胞，P、B、T分别代表 PDGF、BMP、TGF-β，其终浓度均为100 μg/L。
2 结果
静息状态下成骨细胞内Ca2+浓度相对稳定，加入PDGF、BMP、TGF-β等生长因子后可刺激细胞内Ca2+浓度的变化，ACAS反映为胞内Ca2+荧光强度的变化(表1)。本实验所用荧光探针为Fluo-3，是钙螯合剂EGTA的衍生物，与钙有较高的特异性亲合力。将它接上一个乙酰甲酯后导入细胞，经细胞内的非特异性酯酶水解，释放出探针。经ACAS的电脑自动分析系统分析细胞内Ca2+的荧光强度，连续不同的荧光强度反映出Ca2+浓度的动态变化过程。
, 百拇医药
表1 PDGF、BMP、TGF-β对成骨细胞内动态Ca2+浓度的影响(
±s)
Tab.1 Effect of PDGF、BMP、TGF-β on intracellular Ca2+ concentration of osteoblasts
Groups
Samples
Heightening speed(u/s)
Control
10
, 百拇医药
0.008±0.005
P
10
0.054±0.010*
P+B
10
0.084±0.016*#
P+T
10
0.062±0.013*#
The values are expressed as means±SD.*P<0.01 vs control group，#P<0.05 vs group P
, 百拇医药
从表1可看出，各处理组与对照组比较P<0.01，后三组与P组比较P<0.05，Ca2+浓度的上升速度均有显著差异。这表明PDGF单独应用可刺激成骨细胞内Ca2+浓度的瞬时增加，但与BMP、TGF-β协同作用刺激成骨细胞内Ca2+浓度的增加更明显，即有协同效应。
3 讨论
粘附细胞分析仪是一种借助于与细胞内某种成分特异性结合的荧光染料的荧光定量方法，运用激光和计算机技术，对活细胞内物质含量及其变化规律进行准确定量[4]。它在分子水平上研究细胞生理及细胞内某些成份功能等方面有其独特性。
细胞内Ca2+作为细胞内较重要的第二信使之一，参与并调节细胞多种功能活动及生理生化过程，如细胞的分裂、增殖、趋化性、粘附性及细胞对各种激素或生长因子的反应[5]。我们通过粘附细胞仪检测到在分离培养的成骨细胞样细胞中单独加入PDGF后，胞内Ca2+浓度可呈现出瞬时升高；且发现与BMP、TGF-β联合应用Ca2+浓度上升速度更快，即有明显协同效应。这也说明在骨重建过程中多种生长因子可同时存在并互相促进。
, 百拇医药
PDGF、BMP、TGF-β等生长因子刺激胞内Ca2+浓度瞬时升高的机制可能是[6,7]：生长因子与胞膜上相应受体结合后，通过活化磷脂酶C，触发专一的PIP2水解，释放出DG和IP3。DG活化蛋白激酶C，而IP3主要扩散到胞质，诱发Ca2+从细胞内储存库(主要是线粒体和内质网)释放出来，导致胞内游离Ca2+浓度的瞬时增加。这是细胞反应初始细胞内Ca2+增加的主要来源。成骨细胞的线粒体内含有细胞内总钙量的90%以上，细胞内的钙盐沉淀，首先必需有大量的Ca2+。PDGF等生长因子可通过刺激成骨细胞内Ca2+浓度的增加促进磷酸钙沉淀，为骨基质的形成提供物质基础。有关PDGF、BMP、TGF-β刺激胞内Ca2+浓度升高的分子生物学机制，将是今后有待解决的重要课题。
*国家自然科学基金资助(39500175)
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作者简介：李菊根，男，1968年出生,1997年毕业于第一军医大学,硕士,主治医师,电话86662205-53537
参考文献
1 Vander PA，Ni Jweide PJ.Cell-cell interaction in osteogenic compartment of bone.Bone,1988,9(2):107
2 李菊根，陈建庭，金大地.MTT法分析PDGF对鼠成骨细胞生长作用的影响.第一军医大学学报，1998，18(3):231
3 Marie PJ，Lomri A，Sabbagh A et al.Culture and behavior of osteoblastic cells isolated from normal trabecular bone surface.In Vitro，1989，25(2):373
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4 张 薇，朴英杰，鲍永耀等.粘附式细胞仪测量巨噬细胞内游离钙的方法.第一军医大学学报.1994，14(1):43
5 周衍椒，张镜如.生理学.北京：人民卫生出版社.1995.47～48
6 Somlyo Ap.Cellular site of Ca2+ regulation.Nature.1984，309(2):516
7 Crepa JA.Rapid break down of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in rat hepatocytes stimulated by vasopressin and other Ca2+ mobilizing hormones.J Biochem，1983，212(3): 733
(收稿日期：1998-09-02), 百拇医药
单位：李菊根 (广州军区广州总医院骨科，广州，510010)；陈建庭 金大地 (第一军医大学南方医院骨科，广州，510515)
关键词：PDGF；成骨细胞；Ca2+；ACAS
血小板衍生生长因子刺激鼠成骨细胞内Ca2 摘要：目的 观察血小板衍生生长因子(PDGF)等生长因子对鼠成骨细胞内Ca2+浓度变化的影响。方法 酶消化法体外分离培养胎儿鼠成骨细胞，应用ACAS检测成骨细胞内Ca2+浓度的变化。结果 PDGF可促进成骨细胞内Ca2+浓度的瞬时增加;PDGF与BMP、TGF-β联合应用对成骨细胞Ca2+浓度升高有协同作用;ACAS能准确测量胞内Ca2+浓度的动态变化。结论 PDGF可促进成骨细胞内Ca2+浓度的增加，且与BMP、TGF-β有协同效应。
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中图分类号：R336
Changes in intracellular Ca2+ concentration of rat osteoblasts produced by platelet-derived growth factor：An experimental study
Li Jugen
(Department of Orthopedics，Guangzhou General Hospital of PLA，Guangzhou，510010)
Chen Jianting，Jin Dadi
(Department of Orthopedics，Nanfang Hospital，First Military Medical University，Guangzhou，510515) Abstract：Objective To observe the effect of platelet-derived growth factor (PDGF) on the change in intracellular Ca2+ concentration of rat osteoblasts.Methods The rat osteoblasts were isolated and cultured by enzyme digestion，and adherent cell analysis and sorting cytometer (ACAS) was employed to assay the change of intracellular Ca2+ concentration of rat osteoblasts.Results Intracellular Ca2+ concentration was increased instantaneously; synergic action on Ca2+ concentration was attained by the combined use of PDGF and BMP or TGF-β;The dynamic change of intracellular Ca2+ concentration was measured exactly by ACAS.Conclusion PDGF could increase Ca2+ concentration and attain a synergic action of PDGF and BMP or TGF-β.
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Key words：PDGF;osteoblasts; Ca2+;ACAS
血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)是一种存在于多种组织(包括骨组织)中的多肽生长因子，在骨折修复过程中起重要作用。成骨细胞是骨组织中的主要成份，是骨的修复与重建过程中的重要功能细胞[1]。已有实验证明PDGF可刺激鼠成骨细胞的分裂、增殖[2]。本实验应用粘附细胞仪(Adherent cell analysis and sorting cytometer，ACAS)观察PDGF、骨形态形成蛋白(Bone morphogentic protein，BMP)、转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)等生长因子对鼠成骨细胞内Ca2+浓度变化的影响。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 主要试剂 DMEM培养液(Gibco)，型胶原酶(Sigma,)，胰蛋白酶(Promega)，PDGF-AB辈(Promega)，BMP(北京帮定生物公司)，TGF-β(暨南大学生物医学工程系)。
1.2 主要仪器与材料 570型粘附式细胞仪(ACAS-570)，1～2 d龄SD纯种大鼠，无菌操作取出其双侧颅盖骨。
1.3 方法
1.3.1 细胞分离和培养[3] 取1～2 d龄SD纯种大鼠颅盖骨，经缓冲液冲洗后剪碎。0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶反复消化4次，过滤收集后3次消化液，以1000 r/min离心10～15 min，使细胞沉淀，用吸管轻轻吹匀制成细胞悬液。悬液细胞经改良钙-钴组化法和真空负压LSAB法(免疫组化法)进行碱性磷酸酶(ALP)染色,结果细胞ALP染色阳性率为95%以上,即悬液细胞为成骨细胞。台盼兰染色计数90%以上细胞存活，每25 ml培养瓶中细胞接种量约(3.5～4.0)×105个，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每隔2 d换一次培养液，5～7 d细胞长成致密单层时，原代细胞按1:2进行传代培养。
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1.3.2 ACAS样品制备 以第二代传代成骨细胞按1.0×104个/皿接种于专用塑料培养皿，孵育24h；弃培养液，Hepes液轻洗二次，每皿加入Fluo-3染料100 μl，孵育1 h；Hepes液轻洗3次，每皿均加1.0 mlHepes液， ACAS检测各组细胞内Ca2+浓度变化。
本实验设对照组、P组、P+B组、P+T组，每组样本数10例，对照组为无血清DMEM培养液细胞，P、B、T分别代表 PDGF、BMP、TGF-β，其终浓度均为100 μg/L。
2 结果
静息状态下成骨细胞内Ca2+浓度相对稳定，加入PDGF、BMP、TGF-β等生长因子后可刺激细胞内Ca2+浓度的变化，ACAS反映为胞内Ca2+荧光强度的变化(表1)。本实验所用荧光探针为Fluo-3，是钙螯合剂EGTA的衍生物，与钙有较高的特异性亲合力。将它接上一个乙酰甲酯后导入细胞，经细胞内的非特异性酯酶水解，释放出探针。经ACAS的电脑自动分析系统分析细胞内Ca2+的荧光强度，连续不同的荧光强度反映出Ca2+浓度的动态变化过程。
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表1 PDGF、BMP、TGF-β对成骨细胞内动态Ca2+浓度的影响(
±s)Tab.1 Effect of PDGF、BMP、TGF-β on intracellular Ca2+ concentration of osteoblasts
Groups
Samples
Heightening speed(u/s)
Control
10
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0.008±0.005
P
10
0.054±0.010*
P+B
10
0.084±0.016*#
P+T
10
0.062±0.013*#
The values are expressed as means±SD.*P<0.01 vs control group，#P<0.05 vs group P
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从表1可看出，各处理组与对照组比较P<0.01，后三组与P组比较P<0.05，Ca2+浓度的上升速度均有显著差异。这表明PDGF单独应用可刺激成骨细胞内Ca2+浓度的瞬时增加，但与BMP、TGF-β协同作用刺激成骨细胞内Ca2+浓度的增加更明显，即有协同效应。
3 讨论
粘附细胞分析仪是一种借助于与细胞内某种成分特异性结合的荧光染料的荧光定量方法，运用激光和计算机技术，对活细胞内物质含量及其变化规律进行准确定量[4]。它在分子水平上研究细胞生理及细胞内某些成份功能等方面有其独特性。
细胞内Ca2+作为细胞内较重要的第二信使之一，参与并调节细胞多种功能活动及生理生化过程，如细胞的分裂、增殖、趋化性、粘附性及细胞对各种激素或生长因子的反应[5]。我们通过粘附细胞仪检测到在分离培养的成骨细胞样细胞中单独加入PDGF后，胞内Ca2+浓度可呈现出瞬时升高；且发现与BMP、TGF-β联合应用Ca2+浓度上升速度更快，即有明显协同效应。这也说明在骨重建过程中多种生长因子可同时存在并互相促进。
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PDGF、BMP、TGF-β等生长因子刺激胞内Ca2+浓度瞬时升高的机制可能是[6,7]：生长因子与胞膜上相应受体结合后，通过活化磷脂酶C，触发专一的PIP2水解，释放出DG和IP3。DG活化蛋白激酶C，而IP3主要扩散到胞质，诱发Ca2+从细胞内储存库(主要是线粒体和内质网)释放出来，导致胞内游离Ca2+浓度的瞬时增加。这是细胞反应初始细胞内Ca2+增加的主要来源。成骨细胞的线粒体内含有细胞内总钙量的90%以上，细胞内的钙盐沉淀，首先必需有大量的Ca2+。PDGF等生长因子可通过刺激成骨细胞内Ca2+浓度的增加促进磷酸钙沉淀，为骨基质的形成提供物质基础。有关PDGF、BMP、TGF-β刺激胞内Ca2+浓度升高的分子生物学机制，将是今后有待解决的重要课题。
*国家自然科学基金资助(39500175)
, http://www.100md.com
作者简介：李菊根，男，1968年出生,1997年毕业于第一军医大学,硕士,主治医师,电话86662205-53537
参考文献
1 Vander PA，Ni Jweide PJ.Cell-cell interaction in osteogenic compartment of bone.Bone,1988,9(2):107
2 李菊根，陈建庭，金大地.MTT法分析PDGF对鼠成骨细胞生长作用的影响.第一军医大学学报，1998，18(3):231
3 Marie PJ，Lomri A，Sabbagh A et al.Culture and behavior of osteoblastic cells isolated from normal trabecular bone surface.In Vitro，1989，25(2):373
, http://www.100md.com
4 张 薇，朴英杰，鲍永耀等.粘附式细胞仪测量巨噬细胞内游离钙的方法.第一军医大学学报.1994，14(1):43
5 周衍椒，张镜如.生理学.北京：人民卫生出版社.1995.47～48
6 Somlyo Ap.Cellular site of Ca2+ regulation.Nature.1984，309(2):516
7 Crepa JA.Rapid break down of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in rat hepatocytes stimulated by vasopressin and other Ca2+ mobilizing hormones.J Biochem，1983，212(3): 733
(收稿日期：1998-09-02), 百拇医药